TEMA 5: TIPOS DE HIBRIDACIÓN
TIPOS DE TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN EN FUNCIÓN DEL MEDIO EN
QUE SE LLEVA A CABO:
• Técnicas de hibridación en medio sólido.
• Técnicas de hibridación en medio líquido.
• Técnicas de hibridación in situ.
TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN EN MEDIO SÓLIDO.
Lo más frecuente es que la diana sin marcar se fija sobre un soporte
sólido antes de la hibridación se incuba posteriormente con la sonda
marcada. En microrrays es al contrario
DOT BLOT
Utiliza como soporte sólido membranas de nailon o nitrocelulosa.
Solo se pueden detectar secuencias de ADN o ARN (está o no está).
Permite el estudio simultáneo de varias muestras.
Las muestras pueden ser ácidos nucleicos purificados, lisado celular o ADN
amplificado por PCR.
El marcaje de las sondas se realiza con isótopos radiactivos o con haptenos.
Si las aplicaciones se hacen en forma de banda la técnica se denomina slot
blot.
La incubación secuencial con los distintos reactivos se hace por inmersión
en cubeta, en bolsa termosellable o con cierre hermético o en frascos con
tapón de rosca
Protocolo genérico del dot blot
Aplicación de la muestra al soporte
Soporte: mb. de nitrocelulosa o nailon humedecida 10’ en tampón o agua
destilada. Eliminación del exceso de humedad entre dos hojas de papel de
filtro. Colocación de la mb. en el sist. de vacío (plantilla con pocillos
numerados, junta selladora, soporte para la junta y placa o cámara
colectora) entre la plantilla y la junta selladora.
Muestras de ADN
• Desnaturalizar con NaOH y EDTA 10’ a 100ºC y neutralizar con acetato
de amonio pH=7.
• Cargar el ADN muestra en las posiciones correspondientes de la plantilla.
Los reactivos se filtran a la cámara colectora.
• Lavar cada pocillo con NaOH o SSC y filtrar al vacío.
• Desmontar el sistema de vacío y lavar la mb con SSC.
• Secar la mb en estufa a 80ºC 30’-120’ para unir el ADN permanentemente
• El ADN en la mb de nailon se puede fijar definitivamente con luz UV.
• La unión del ADN a la mb se realiza por el esqueleto azúcar-fosfato.
DOT BLOT (continuación)
Muestras de ARN
Desnaturalizar para eliminar las horquillas intracatenarias. Desnaturalizar =
pero más suave que para ADN. Lavado con la misma solución que para
ADN y secado de la mb similar al anterior.
Prehibridación
• Incubar la mb con sol. de prehibridación con o sin formamida.
• Solución de prehibridación: misma composición que la de hibridación, pero
sin sonda y con esperma de salmón (Carrier) y sirve para bloquear uniones
inespecíficas.
Hibridación
• Si la sonda es bicatenaria hay que desnaturalizar a 95-100ºC 5’ y
enfriamiento rápido en hielo.
• Retirar la solución de prehibridación y poner solución fresca con la sonda.
• Incubar en agitación 4-24 horas.
Lavado poshibridación
• Colocar la mb en una cubeta para realizar los lavados en agitación.
• Hacer 2-3 lavados con soluciones de mayor a menor fuerza iónica, por
ejemplo. Es decir, aumentando las condiciones de rigurosidad.
Detección del híbrido
Marcado radiactivo
• Secar la mb para revelar. Si se va a volver a utilizar la mb para una nueva
hibridación mantener la mb húmeda y envolver en plástico para que no
toque la placa radiográfica.
• Colocar la placa radiográfica encima de la mb y oscuridad durante horas-
días.
• Al revelar la placa se observarán puntos negros en las posiciones de
muestras positivas.
Marcado con haptenos
Rehibridación
Para hacer una 2ª hibridación con la mb hay que desnaturalizar los híbridos
de la 1ª técnica de la siguiente manera:
• Dos lavados de 20’ cada uno con solución de baja fuerza iónica a 95ºC.
• Para comprobar la efectividad del lavado hacer una nueva radiografía.
Aplicaciones del dot blot
• Estudios de expresión génica en células en distintas situaciones, tras
disantos estímulos, en células tumorales.
• Detección de secuencias de AN extrañas como virus, bacterias, hongos.
• Control de calidad de la PCR.
• Control de calidad del marcaje de sondas haciendo un dot blot con
soluciones de concentración decreciente de secuencias diana control.
Esto permite calcular la sensibilidad.
• Determinar el sexo de especies sin diferencias fenotípicas.
Aplicaciones específicas
ASO DOT BLOT
• Para detectar mutaciones en homo o heterocigosis con nº de variantes
alélicas reducidas.
DOT BLOT INVERSO O REVERSE DOT BLOT
• Las sondas se fijan en la membrana (oligonucleótidos específicos de alelo
normales y mutados) sin marcar.
• El gen de interés se amplifica por PCR y se marca.
• Para cada caso se emplea una membrana diferente.
• La técnica permite distinguir entre individuos homocigotos y
hererocigotos. Ejemplo, las talasemias.
HIBRIDACIÓN DE COLONIAS
• Para detectar bacterias que portan una secuencia génica concreta.
• Se toma una impronta con una mb en una placa con colonias aisladas.
• Se lisan las bacterias en la mb y se desnaturaliza el ADN colocando la mb
entre papeles secantes empapados en soluciones de SDS Y NaOH
respectivamente.
• Continuar con un dot blot tradicional.
HIBRIDACIÓN DE PLACAS VIRALES O PLAQUE LIFT
• Detecta secuencias diana de virus.
• Útil para detectar fagos recombinantes.
• Técnica similar a la hibridación de colonias.
SOUTHERN BLOT
Permite identificar fragmentos de ADN separados por electroforesis en gel
y transferidos a una mb de nitrocelulosa o nailon.
Para estudiar simultáneamente varias secuencias diana de distinto tamaño
en una única hibridación.
Protocolo del Southern blot
Digestión enzimática
• Trocear el ADN con una o varias enzimas de restricción, para ADN
genómico durante toda la noche con exceso de enzima, para plásmidos
incubar 1-2 horas.
Electroforesis en gel
• Se puede hacer en gel de agarosa y en gel de poliacrilamida.
• Agente intercalante fluorescente bromuro de etidio que se puede
incorporar en el gel o después de la electroforesis y obtener la fotografía.
• En una de las posiciones se coloca un marcador de tamaños.
• Cuando se estudia ADN genómico se observa una estela fluorescente
continua (smear).
• Cuando se estudian moléculas relativamente pequeñas, como plásmidos,
se observa un nº reducido de bandas.
Transferencia del ADN a la membrana
1. Desnaturalización del ADN (se realiza en agitación).
• Desnaturalización alcalina con NaOH y neutralización con tampón neutro.
• Lavado del gel con solución de lavado (por ej., sol. Salina fosfato con
EDTA.).
2. Transferencia a la membrana.
Lo más normal es hacerlo por capilaridad durante toda la noche para se
movilicen los fragmentos de ADN a la membrana.
De abajo a arriba el dispositivo consta de:
• Cubeta con buffer de transferencia (SSPE 10X).
• Soporte de plástico que sobresalga de buffer.
• Papel Whatman humedecido con el buffer de transferencia y sus
extremos sumergido en el buffer de la cubeta.
• Gel colocado cara abajo (los pocillos hacia abajo).
• Mb humedecida.
Pila de papeles absorbentes y un peso ligero (placa de cristal) encima.

SOUTHERN BLOT (continuación)
3. Anclaje del ADN a la membrana.
• Se incuba la membrana a 80ºC en estufa o con luz UV si es de nailon.
Hibridación
1. Previo a la hibridación
• Se coloca la membrana en una bolsa con cierre hermético, igual que en
dot blot, o acolpada a la pared interna del tubo de hibridación.
• Se añade solución de prehibridación con esperma de salmón
desnaturalizado para bloquear uniones inespecíficas.
2. Hibridación
• Solución de hibridación y una o más sondas marcadas.
• Si se usan varias sondas, sus Tm deben se similares.
3. Tras la hibridación
• Lavados posthibridación en condiciones de rigurosidad crecientes con
solución de lavado.
Revelado
• Mediante autorradiografía con película de rayos X. aparecen manchas
oscuras en los puntos de la mb en los que se localice el híbrido.
• Comparando las bandas se identifican los fragmentos por tamaños.
Aplicaciones del Southern blot
• Elaboración de huella genética
• Estudio de mutaciones estructurales.
• La detección de secuencias adquiridas.
NORTHERN BLOT
Hibridación para moléculas de ARN separadas por electorforesis. y
transferidas a una mb de nitrocelulosa o nailon (similar a Southern blot)
Protocolo del Northern blot
• Lisado celular para extraer ARN y purificación. Se obtiene mezcla de ARN
de ≠ tamaños.
• Diluir el ARN en tampón con formamida y formaldehído y calentar a 65ºC
para desnaturalizarlo (eliminar posibles horquillas intracatenarias)
• Electroforesis en gel de agarosa en condiciones desnaturalizantes (con
formaldehído).
• Resto de pasos similares a Southern blot.
Aplicaciones de Northern blot
• Análisis de expresión génica.
• Detección de mutaciones.
• Estudios de corte y empalme o splicing alternativo.
MICROARRAYS DE ADN
Conjunto de sondas monocatenarias y sin marcar de ADN fijadas en una
superficie sólida de vidrio, plástico o silicio (biochip).
La muestra a estudio se marca con fluorocromos.
En una sola hibridación se detectan miles de secuencias ≠ cualitativa y
cuantitativamente.
La lectura tras la hibridación se tiene que realizar con un escáner láser y un
software de análisis.
TEMA 5: TIPOS DE HIBRIDACIÓN (continuación)
MICROARRAYS (continuación)
Fabricación de microarrays
• Depositar sondas una a una con un brazo robotizado que tiene una matriz
de finas agujas que sumergen en las sondas y depositan microgotas (pg)
en posiciones concretas del soporte sólido.
• Otro método es sintetizar la sonda sobre la superficie sólida.
• Resultado final, una matriz de puntos en la que cada punto está formado
por cientos de miles de moléculas de una misma sonda.
• Los tipos de sondas utilizados pueden ser ADNc, oligonucleótidos
sintéticos específicos o productos de amplificación por PCR con un único
primer. En caso de microarray con sondas sintetizadas en el soporte, las
sondas normalmente son de 25 bases.
Protocolo genérico de trabajo
1. Marcaje de la muestra
• Para estudios de expresión génica se utiliza ARNm o ADNc marcados.
• Para estudios genómicos se purifica el ADN y se marca mediante Nick
traslation o Random priming.
2. Hibridación y lavados de posthibridación
• Lavado en condiciones de rigurosidad recomendadas por el fabricante.
• Si el marcaje es con biotina después de los lavado poshibridación realizar
un paso extra de tinción con estreptavidina marcada con fluorocromo.
3. Lectura del microarray y análisis e interpretación de los resultados
Con escáner adecuado y software espedífico.
Aplicaciones de los microarrays
Hibridación genómica comparada
• Para detectar e identificar deleciones y duplicaciones. No se detectan
traslocaciones o inversiones
• Se marcan el ADN muestra y el ADN de referencia con ≠ fluorocromo y
se mezclan en la misma proporción.
• Esta mezcla se hibrida en un array y ambos tipos de ADN compiten por
hibridar con la sonda de forma que la fluorescencia final depende de la
proporción genes de uno u otro ADN haya hibridado. Si se marca la
referencia de rojo y la muestra de verde, puntos rojos indican deleciones,
puntos rojos amplificaciones y punto amarillos indican genes inalterados.
• En un único array se pueden estudiar múltiples genes y con múltiples
sondas específicas de distintas regiones del gen.
• Se pueden detectar microdeleciones y microamplificaciones de 5-10kb.
• Sirve para estudios de células tumorales, diagnosticar enfermedades
genéticas y diagnóstico prenatal.
Estudios de expresión génica
En términos absolutos
• Se hibrida el microarray con ADNc obtenido de un ARNm de una
población celular para saber qué genes se expresan y con qué intensidad
relativa en un momento determinado y qué genes están reprimidos.
• Se va a interpretar el resultado en función de la intensidad de la
fluorescencia en cada punto.
En términos comparativos
• Se hibrida el ADNc de la muestra y el ADNc de referencia marcados con ≠
fluorocromos.
• La fluorescencia en cada punto depende de las proporciones de ADNc que se haya
unido a las sondas pudiendo detectar expresión normal, sobreexpresión,
infraexpresión o represión de un gen.
• Permite estudiar expresión génica de células en distintas situaciones, efectos de
medicamentos y respuesta a agentes químicos, físicos e infecciósos.
Otras aplicaciones
• Se pueden estudiar polimorfismos y mutaciones, detectar microorganismos
contaminantes de alimentos y muestras biológicas, estudio de splicing alternativos
de ARN…
TÉCNICA DE CAPTURA DEL HÍBRIDO
Si la secuencia diana es ADN, la sonda es ARN y viceversa. La captura del híbrido
se produce mediante Ac específicos fijados en las paredes de los pocillos de la placa
microtiter que reconocen los heteroduplex. Técnica desrrollada inicialmente para
detectar el VPH en muestras de cuello uterino.
PROTOCOLO
1. Lisis de los virus y desnaturalización del ADN con sol. Alcalina.
2. Hibridación del producto de lisis con sonda ARN en tampón adecuado.
3. Captura del híbrido pasando la mezcla de hibridación a un pocillo recubierto de
Ac anti ARN/ADN.
4. Detección del híbrido por medio de Ac antiARN/ADN marcados con fosfatasa
alcalina.
5. Revelado añadiendo sustrato quimioluminiscente que por la acción de la fosfatasa
alcalina produce luminiscencia de λ determinada que se detecta con un
luminómetro o un lector de placas.
TECNOLOGÍA DEL ADN RAMIFICADO bDNA o branched DNA
Es un sistema de amplificación de señal basado en la unión de la secuencia diana a
un complejo de ADN de tipo arborescente.
Pincipal aplicación, cuantificación de cargas virales en muestras biológicas.
1. Lisis de las partículas víricas y desnaturalización en virus ADN.
2. Hibridación con sondas específicas en condiciones de rigurosidad. Se usa una
mezcla de dos tipos de sondas.
• Sondas para captura. Una parte de la sonda es complementaria de una región del
AN del virus y otra parte es complementaria de un oligonucleótido de captura fijado
a la pared de un pocillo microtiter.
• Sondas de extensión. Una parte de la sonda es complementaria de un región del
AN del virus y otra del oligonucleótido preamplificador.
3. Captura del híbrido. Se traspasa la mezcla de hibridación a un pocillo con las
paredes recubiertas de oligonucleótido de captura.
4. Preamplificación. Se añade al pocillo un oligonucleótido preamplificador (tronco
del árbol) que se une por un lado a la sonda de extensión y por el otro tiene muchas
secuencias cortas repetidas complementarias de los oligonucleótidos
amplificadores.
5. Amplificación. Se añade al pocillo los oligonucleótidos amplificadores (ramas del
árbol) que contienen muchas secuencias repetidas complementarias de pequeños
oligonucleótidos marcados con fosfatasa alcalian y que van a hibridar por un
extremo a los oligonucleótidos preamplifcadores.
6. Detección y revelado. añadir oligonucleótido marcado con fosfatasa alcalina
(hojas) que hibridan con los oligonucleótidos amplificadores y revelar con sustrato
quimioluminiscente

La diana se localiza en el sitio que se encuentra fisiológicamente
(cromosomas o núcleos interfásicos)
TIPOS DE MUESTRAS
Preparaciones citogenéticas de metafases o núcleos interfásicos
desnudos.
Extensiones citológicas Secciones de tejidos.
CARACTERÍSTICAS DE LA TÉCNICA
No hay que extraer ni purificar previamente el ADN.
Es relativamente rápida y sencilla.
Coste económico moderado.
Se poder realizar sobre material fresco o FFPE.
Permite obtener información a nivel de célula individual en relación con
el resto del tejido.
Permite hacer estudios retrospectivos.
Utiliza sondas no radiactivas.
PREPARACIÓN DE CROMOSOMAS EN METAFASE
Visto en tema12.
PREPARACIONES DE NÚCLEOS DESNUDOS (en interfase).
Normalmente a partir de sangre periférica o médula ósea. Pasos:
1. Choque hipotónico. Diluir la muestra 5:1 en solución de KCl e incubar a
37ºC 20’.
2. Fijación. Fijar con Carnoy (metanol-ácido acético glacial 3:1) recién
preparada y agitación en vortex. Lisa hematíes y endurece leucocitos.
Lavados sucesivos hasta obtener un botón blanco. Los leucocitos se
pueden guardar a -20ºC un año aprox.
3. Extensión de los núcleos. 1º lavar con Carnoy recién preparado. Con
pipeta pasteur dejar caer gotas de la muestra a unos 30cm sobre el
portaobjetos desengrasado y frío (en congelador sumergido en metanol y
secados antes de hacer la extensión). Las células se rompen y los núcleos
desnudos se pegan al portaobjetos. Dejar secar las extensiones y proceder
a hibridar.
EXTENSIONES CITOLÓGICAS
A partir de células en suspensión obtenidas de fluidos biológicos. Extender
en monocapa sobre un portaobjetos, manualmente o automáticamente, c
olocando directamente una gota de fluido o previo lavado con una solución
tampón. Dejar secar la extensión y opcionalmente fijar con fijador suave,
etanol a 4ºC o metanol/acetona al 50% a 4ºC o paraformaldehído al 4%.
SECCIONES DE TEJIDO
Se necesitan portaobjetos tratados para que los cortes se adhieran. Dos TTº
1. Recubiertos con adhesivos especiales como polilisina y derivados del
orgnosilano. Nunca con albúmina porque la digieren las proteasas.
Sumergirlos en la solución de adhesión, secar en posición vertical y
almacenar a -20ºC.
2. Cargados positivamente que retienen los tejidos mediante uniones
electrostáticas porque al fijar los tejidos en formol los tejidos tienen
carga negativa. Tras colocar el tejido incubar a 55ºC mínimo 2 horas para
conseguir buena adherencia.
TEMA 5: TIPOS DE HIBRIDACIÓN: HIBRIDACIÓN IN SITU (ISH)
Tipos de tejido.
1. Tejido en congelación. Secciones obtenidas en un criostato y
depositadas en un portaobjetos. Fijación en etanol a 4ºC
2. Tejido FFPE. Obtenidas con el microtomo y depositada sobre un
portaobjetos.
HIBRIDACIÓN IN SITU FLUORESCENTE (FISH)
Uso de sondas marcadas con fluorocromos.
Principales aplicaciones: alteraciones cromosómicas tanto numéricas
como estructurales para diagnóstico y pronóstico de patologías
oncológicas con base genética.
Protocolo genérico para metafases y núcleos desnudos:
1. Hibridación.
• Aplicar 5µl de sonda marcada en el área de hibridación y colocar un
cubreobjetos evitando que queden burbujas.
• Desnaturalizar el ADN de la muestra y la sonda (si es bicatenaria)
colocando el portaobjetos en la placa calefactora a 72ºC 4-5’.
• Hibridación: colocar el porta en cámara húmeda a Tª recomendad por el
fabricante (37-42ºC) 12-16h
2. Lavado poshibridación.
Inmersión de los portas en cubetas Coplin con solución de lavado previa
retirada de los cubres.
3. Contratinción.
• Se elimina el exceso de solución de lavado colocando los portas sobre
papel de filtro en posición vertical.
• Se pone 5-7 µl de solución de contratinción (diamino-fenil-indol DAPI
que se une a los AN en general y al ADN bicatenario en particular) que
al excitar con luz ultravioleta los núcleos muestran fluorescencia azul.
• Colocar un cubreobjetos evitando la formación de burbujas.
4. Visualización.
Con microscopios de fluorescencia y filtros (generalmente verde y rojo). Los
núcleos desnudos se ven en azul con puntos verdes o rojos. Hay que
analizar 200 núcleos y resultado se expresa como porcentaje de núcleos
que presentan la alteración que se estudia.
FISH INTERFÁSICA
Se pueden detectar secuencias en preparaciones citológicas de núcleos
desnudo, en extensiones citológicas y secciones de tejidos.
Sondas más utilizadas
Sondas centroméricas o sondas CEP (Chromosome Enumeration Probes)
• Hibridan con secuencias localizadas en el centrómero de cromosomas
concretos.
• Existen sondas para cada cromosoma (CEPx: x es el nº del
cromosoma).
• Se emplean para el estudio de anomalías cromosómicas numéricas. Se
observará un punto fluorescente por cada cromosoma homólogo
estudiado.
• Diferenciar trisomía de poliploidía se usan dos juegos de sondas
marcadas con distinto fluorocromo. Trisomía: dos puntos de un color y
tres de otro. Poliploidía: tres puntos de un color y tres de otro.
Sondas teloméricas o sondas TEL
Hibridan con secuencias situadas en telómeros de los cromosomas. Se
nombran TELxp o q, donde x es el nº del cromosoma y p o q el brazo en
el que se une. Se utilizan para estudios de alteraciones numéricas o de
patologías producidas por deleciones en esas regiones.
Sondas específicas de locus o sondas LSI (Locus Specific Identfier)
Hibridan en regiones (locus) concretas de un cromosoma. Se utilizan para
detectar anomalías numéricas y estructurales (traslocaciones,
microdeleciones y microamplificaciones.
Estrategias para identificar traslocaciones
Sondas de separación, Split o Break-apart (tipo de sonda específica de
locus)
Para translocaciones en las que se conoce uno de los cromosomas
implicados, pero el otro puede variar.
Se utilizan un juego de dos sondas. Un juego se une a un lado del punto
de rotura y está marcado con un color. El otro juego está marcado con otro
color y se une al otro lado del punto de rotura.
No existe traslocación: la fluorescencia de ambas se superpone y se
ve amarillo o rojo y verde con una zona amarilla central.
Existe traslocación: tres puntos, uno amarillo correspondiente al
correspondiente al cromosoma intacto, y uno rojo y otro verde
separados, correspondiente a las dos partes del cromosoma traslocado.
Sondas de fusión (tipo de sonda específica de locus)
Se utilizan cuando se conocen los dos cromosomas implicados en la
traslocación.
Se utilizan dos pares de sondas para hibridar a ambos lados de los puntos
de rotura de cada cromosoma implicado. Las dos sondas que flanquean
el punto de rotura son de un color y las otras dos del otro cromosoma son
de otro color
En células normales se observan dos puntos verdes y dos rojo.
Si existe traslocación se observan un punto verde correspondiente a
uno de los cromosomas no traslocados, un punto rojo correspondiente al
otro cromosoma no traslocado y dos puntos amarillos correspondientes
a los dos cromosomas que han sufrido traslocación.
FISH METAFÁSICA
Se pueden detectar secuencias en extensiones citogenéticas de
metafases.
Se utilizan:
Sondas centroméricas para detección de anomalías numéricas.
Sondas específicas de locus para anomalías estructurales.
Combinación de ambos tipos para identificar el cromosoma en el que se
encuentra el locus de interés (especialmente en traslocaciones).
FISH para pintado de cromosomas enteros o WCP-FISH (Whole
Chromosome Painting- FISH).
Se utilizan sondas marcadas con el mismo fluororóforo que hibridan con
todo el cromosoma y se ve de un color uniforme.
Se utiliza para detectar anomalías numéricas y sobre todo para
traslocaciones.
No se puede utilizar para deleciones, duplicaciones e inversiones.

FISH multicolor o M-FISH
Se utilizan cócteles de sondas, sondas para pintado de bandas específicas o sondas
BSP (Band Specific Painting) que hibridan en distintas regiones de un cromosoma con
solapamiento parcial y marcadas con distintos fluoróforos.
El solapamiento de las sondas produce combinación de colores. La interpretación de
resultados se realiza con un sistema de análisis de imagen que asigna un color
convencional de una paleta de colores a las diferentes combinaciones de fluorescencia.
El resultado final es un bandeado multicolor característico de cada cromosoma.
Son útiles para estudiar cualquier tipo de anomalía.
Cariotipo espectral o SKY (Spectral Karyotyping)
Se basa en la utilización desondas WCP y en la combinación fluoróforos. Se hibridan
todos los cromosomas con un cóctel de 24 sondas WCPn una por cada cromosoma.
Cada sonda va marcada con una combinación distinta de fluoróforos que se obtiene
por combinación de 5 fluoróforos consiguiendo hasta 31 combinaciones diferentes con
un espectro de emisión característico. Lectura con un sistema de análisis espectral de
cada cromosoma que asigna un color convencional a cada cromosoma de una paleta
de colores.
Se utiliza principalmente para estudio de cariotipos complejos con múltiples
alteraciones numéricas y estructurales.
Hibridación genómica comparada (CGH)
Mismo fundamento que el aCGH. La hibridación se hace sobre cromosomas en
metafase el resultado se visualiza con microscopio de fluorescencia.
ISH CROMOGÉNICA (CISH)
El híbrido se detecta mediante una reacción inmunohistoquímica que produce un
producto coloreado visible en microscopio óptico convencional.
Se realiza principalmente sobre secciones de tejido FFPE porque en estas muestras no
se puede realizar FISH ya que el formol les provoca cierto grado de autofluorescencia.
Aplicaciones:
Detección de secuencias génicas de virus oncológicos com VPH o virus de Epstein-
Barr.
Detección de ARNm de cadenas k y λ de las inmunoglobulinas para estudiar
clonalidad de infiltrados linfocitarios.
Estudios de expresión génica. Muy útiles para estudiar sobreexpresión de
oncogenes.
POTOCOLO GENÉRICO
1. Desparafinado y rehidratación de los portaobjetos por inmersiones, primero en xilol
y luego en soluciones decrecientes de etanol (100%, 96%, 70%) y finalmente en agua
destilada o tampón para rehidratar tejido.
2. Digestión enzimática con proteinasa K o con pepsina que libera a los AN de su unión
a histonas y otras proteínas y permeabiliza el tejido para que las sondas puedan
acceder a su secuencia diana.
La digestión con proteinasa K depende del tiempo que la muestra haya estado
fijándose en formol (+ de 24 h, + tiempo de digestión).
La digestión con pepsina es independiente de la fijación, pero funciona mejor si se
hace previamente hidrólisis ácida con HCl 0.1M.
TEMA 5: TIPOS DE HIBRIDACIÓN (continuación)
3. Prehibridación para bloquear posibles uniones inespecíficas de la sonda.
Contiene ADN de esperma de salmón fragmentado.
4. Hibridación. Se inunda el tejido con la solución de hibridación con la sonda y
se desnaturaliza tanto la sonda (5µl) como el ADN de la muestra poniendo un
cubre sin dejar burbujas y colocándolo en una placa calefactora a 95ºC 5-10´.
La detección de secuencias de ARN con sondas ARN no requieren
desnaturalización. Después se coloca el porta en cámara húmeda y se incuba
por tiempo y Tª indicados por el fabricante.
5. Lavado poshibridación por inmersión de los portas en solución de
poshibridación en cubetas Coplin por tiempo y Tª indicadas por el
fabricante. Se incrementa rigurosidad.
6. Detección del híbrido. Las sondas se marcan con haptenos y se detectan por
métodos inmunohistoquímicos indirectos amplificadores de señal. Se obtiene
un producto coloreado alrededor del híbrido.
Las sondas plamídicas de gran tamaño incorporan muchas moléculas
marcadoras.
Las sondas oligonucleotídicas pequeñas requieren sistemas de detección
ultrasensibles.
7. Contratinción para hacer visible el resto del tejido se realiza una tinción suave
que no enmascare la hibridación con hematoxilina de Mayer, por ejemplo.
8. Se visualiza con microscopio óptico de luz transmitida.
Método de detección de sondas marcadas con digoxigenina
1. Tras lavado poshibridación se añade Ac primario anti-digoxigenina..
2. Ac secundario biotinilado antiprimario.
3. Esteptavidina marcada con peroxidasa o fosfatasa alcalina.
4. Sustrato cromógeno adecuado que por acción de la enzima provoque la
transformación del sustrato en un producto coloreado insoluble que se deposita
en el lugar en que se encuentra el híbrido.
Entre paso y paso hay que hacer lavados para eliminar exceso de reactivo.
Podrían usarse sondas marcadas con fluorocromo.
9. CONTROLES
Se realizan al mismo tiempo que se procesa la muestra.
Control positivo de la técnica. Se hibrida una muestra conocida que
contiene la secuencia diana. Sirve para ver que todos los reactivos funcionan
correctamente. Debería dar señal si todo funciona bien (+).
Control negativo de la técnica. Se realiza igual que la problema, pero sin la
sonda. No debería aparecer señal si no se producen tinciones inespecíficas.
(-).
Control positivo de la muestra. Se realiza con sondas específicas de
secuencias repetidas ALU (Secuencias de ADN repetidas distribuidas a lo
largo del genoma) para ADN y sondas poliT para ARN. Si la muestra está bien
debería hibridar (+)
Control negativo de la muestra. Se sustituye la sonda específica por secuencias
no complementarias de la muestra. No debería producirse señal (-) y si aparece
es porque se han producido hibridaciones inespecíficas.