TEMA 5: TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN

5.1. LAS TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN

• Las técnicas de hibridación se pueden clasificar tomando como criterio el medio o soporte en
el que se llevan a cabo.

5.2. TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN EN SOPORTE SÓLIDO

• Las técnicas de hibridación en soporte solido se caracterizan porque una de las dos moléculas
implicadas, la secuencia diana o la sonda, previamente a la hibridación se inmoviliza sobre un
soporte sólido.
• Lo habitual es fijar al soporte la muestra con la secuencia diana e incubar posteriormente con
la sonda marcada para formar el híbrido. En esta metodología se basan las técnicas de dot blot,
southern blot y northern blot.
• En otras ocasiones se obtiene más información fijando al soporte la sonda e incubando
posteriormente con el acido nucleico que se estudia, previamente marcado. En esta
metodología se basan los microarrays.
5.2.1. DOT BLOT

• Es una técnica de hibridación simple que utiliza membranas de nitrocelulosa o nailon como
soporte sólido y que permite detectar secuencias de ácidos nucleicos, ADN o ARN, en una
mezcla compleja.
• Sobre las membranas de nitrocelulosa o de nailon se coloca directamente una gota de la
muestra que se va a analizar, que puede ser un acido nucleico purificado, un lisado celular, un
producto de amplificación por PCR…
• Permite el estudio simultáneo de varias muestras, aplicando cada muestra en una zona distinta
de la membrana y se puede realizar con sondas radiactivas o con sondas marcadas con
haptenos. Si las aplicaciones se realizan en forma de banda en lugar de en forma circular, la
técnica se denomina slot blot.
• La técnica se lleva a cabo incubando secuencialmente las membranas con los reactivos por
inmersión en cubetas, en bolsas de plástico termosellables o con cierre hermético o en frasco
con tapón de rosca.
 Protocolo del dot blot
1º Aplicación de la muestra al soporte
Antes de iniciar la aplicación de las muestras, hay que humedecer la membrana que actúa de soporte
solido mediante inmersión durante 10 minutos en un tampón adecuado o agua destilada, según el
tipo de membrana. Transcurrido este tiempo, se saca el liquido humectante y se retira el exceso. Una
vez humedecida la membrana, se ensambla en un sistema de vacío que va a permitir que se consiga
una adecuada fijación de la muestra a la membrana.
El proceso de aplicación de la muestra varía para ADN y ARN.
2º Prehibridación
Las membranas con las muestras se incuban con una solución de prehibridación para bloquear las
posibles uniones inespecíficas de la sonda a la membrana. Las soluciones de prehibridación suelen
tener la misma composición que las soluciones de hibridación, pero sin sonda.
La membrana se incuba con esta solución a la misma temperatura a la que se realizará posteriormente
la hibridación, normalmente a 65-68%.
3º Hibridación
Las sondas de ADN bicatenario se desnaturalizan inmediatamente antes de su uso, mediante
calentamiento y enfriamiento rápido en hielo. Se retira la solución de prehibridación del contenedor
y se sustituye por un volumen igual de solución fresca a la que se le añade la sonda recién
desnaturalizada. La membrana se incuba con esta solución a la temperatura adecuada, en agitación,
durante 4-24 horas.
4º Lavado de poshibridación
Si las dos fases anteriores se han llevado a cabo en bolsa, se saca la membrana de la bolsa y se coloca
en una cubeta para proceder a los lavados de poshibridación en agitación. Lo habitual es hacer 2 o 3
lavados.
5º Detección del híbrido
Se procederá según el tipo de marcaje que lleve la sonda, radiactivo o con haptenos:
- Marcaje radiactivo: la membrana se puede secar y se revela mediante exposición
autorradiográfica, colocando una placa radiográfica encima y manteniendo en oscuridad. Al
revelar la placa, aparecerán puntos negros en las posiciones correspondientes a las muestras
positivas, es decir, aquellas que contenían la secuencia diana.
- Marcaje con haptenos: se revela con un método de detección cromogénico. El resultado final
es una mancha coloreada en las posiciones correspondientes a las muestras positivas.
6º Rehibridación
Sondas radiactivas, las membranas pueden someterse a nuevas rehibridaciones con otras sondas. Para
ello hay que desnaturalizar los híbridos formados y eliminar la primera sonda utilizada. Es fundamental
que la membrana permanezca siempre húmeda y no se seque durante la autorradiografía.
 Aplicaciones del dot blot
El dot blot se puede usar como técnica de rastreo o screening para detectar secuencias de interés en
múltiples muestras simultáneamente.
- Dot blot como técnica de rastreo (screening).
- ASO dot blot: para detectar mutaciones mediante el empleo de oligonucleótidos específicos
de alelo, ASO.
- Dot blot inverso: tiene el mismo fundamento que el ASO dot blot, pero aplica una estrategia
inversa. Se inmoviliza en la membrana los oligonucleótidos específicos de alelo sin marcar, esto
permite estudiar genes con un gran número de variantes alélicas.
- Hibridación de colonias: es un tipo especial de dot blot utilizado para detectar bacterias que
portan una secuencia génica concreta.
- Hibridación de placas virales: la hibridación de placas virales o plaque lift es un tipo de dot blot
en el que se detectan virus que portan la secuencia diana.
5.2.2. SOUTHERN BLOT

• Es una técnica de hibridación que permite identificar fragmentos de ADN separados por
electroforesis en gel y transferidos a una membrana de nitrocelulosa o de nailon.
• Permite la detección simultanea de varias secuencias dianas de distintos tamaños con una
única hibridación.
Protocolo del southern blot
1º Digestión enzimática
Se realiza con una o varias enzimas de restricción. Su objetivo es trocear el ADN de partida en
fragmentos de diferentes tamaños.
2º Electroforesis en gel
El ADN digerido se somete a una electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida para separar los
fragmentos producidos según su tamaño. En el gel se puede incorporar un agente intercalante
fluorescente, lo que permite fotografiarlo después de terminar la electroforesis. Esta fotografía
permitirá comparar el patrón de bandas de ADN obtenido tras la digestión con el resultado de
hibridación.
3º Transferencia del ADN a la membrana
Se obtiene una replica del patrón de bandas del ADN en el gel sobre una membrana de nitrocelulosa
o nailon. Consta de varios pasos:
1. Desnaturalización.
2. Transferencia.
3. Anclaje del ADN a la membrana.
4º Hibridación
Incubando la membrana con los distintos reactivos dentro de una bolsa con cierre hermético. Se
realiza a la temperatura adecuada y en agitación. La hibridación se realiza con la sonda o sondas
especificas marcadas y diluidas en una solución de hibridación adecuada.
5º Revelado
El revelado de la sonda se realiza mediante autorradiografía con una película de rayos X, de manera
que aparecerá una mancha oscura en los puntos de la membrana en que se localicen los híbridos
sonda/ secuencia diana.
Aplicaciones del southern blot
Las principales aplicaciones son:
- La elaboración de huellas genéticas.
- El estudio de mutaciones estructurales.

5.2.3 NORTHERN BLOT

• Es una técnica de hibridación que permite detectar moléculas de ARN separadas por
electroforesis en gel y transferidas a una membrana de nitrocelulosa o nailon.

Protocolo de northern blot

Se parte de ARN purificado y se procede de forma muy parecida a la técnica de southern blot con tres
diferencias principales:
- No se requiere digestión enzimática previa.
- No es necesario el paso de desnaturalización antes de la transferencia del gel a la membrana.

Aplicaciones del northern blot

Las principales aplicaciones incluyen:
- El análisis de expresión génica.
- La detección de mutaciones.
- Estudios de corte y empalme (o splicing alternativos).

5.2.4. MICROARRAYS

• Son conjuntos o colecciones de fragmentos de ADN (sondas) distintos fijados a una superficie
sólida (vidrio, plástico o silicio).
• Las sondas ancladas en el biochip son monocatenarias y no están marcadas. Se marca con
fluorocromos la muestra que se va a estudiar. La lectura del resultado obtenido tras la
hibridación requiere un escáner de lectura.
 Fabricación de microarrays
Se pueden distinguir 2 estrategias:
- Depositar las sondas, una a una, en posiciones determinadas del soporte sólido.
- Sintetizar las sondas sobre la propia superficie sólida.
Protocolo del trabajo genérico
1º Marcaje de la muestra.
2º Hibridación.
3º Lectura del microarray.
4º Interpretación de los resultados.
Aplicaciones de los microarrays
▪ Hibridación genómica comparada en arrays (aCGH): permite detectar e identificar alteraciones
genéticas consistentes en pérdida o ganancia de material genético, mediante la comparación
del ADN a una muestra con un ADN de referencia.
▪ Estudios de expresión génica.

5.3. TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN EN MEDIO LÍQUIDO

• El híbrido sonda/ secuencia diana se forma en solución, normalmente en pocillos de una placa
microtiter, y posteriormente se fija a la pared del pocillo para proceder a su detección.
• No se marca ni la muestra ni la sonda. El híbrido se detecta por métodos indirectos.
• Estas técnicas se han desarrollado para diagnósticos microbiológicos y para la detección de
virus.
• Su realización es similar a la de los inmunoensayos tipo ELISA, permiten analizar múltiples
muestras simultáneamente y son fácilmente automatizables. Las más importantes son la
técnica de captura de híbrido y la técnica de ADN ramificado.
5.3.1. TÉCNICA DE CAPTURA DE HÍBRIDO

• Se basa en la formación de híbridos ARN/ADN que serán reconocidos o capturados por

anticuerpos específicos.
• Si la secuencia diana es ADN, la sonda será ARN.
• Si la secuencia diana es ARN, la sonda será ADN.
• La captura del híbrido ARN/ADN se produce mediante anticuerpos específicos y que se hallan
fijados en las paredes de pocillos de una placa microtiter.
• Esta técnica se desarrolló inicialmente para detectar el virus del papiloma humano (VPH) en
muestras cervicales. (cuello uterino).
5.3.2. TÉCNICA DEL ADN RAMIFICADO

• Consiste en un sistema de amplificación de señal, basado en la unión de la secuencia diana a

un macrocomplejo de ADN, de tipo arborescente, mediante sucesivas hibridaciones.
• Se diseño para aumentar la sensibilidad de las técnicas de captura de híbrido, haciendo posible,
además, su cuantificación. Una de sus principales aplicaciones es la cuantificación de cargas
virales en muestras biológicas.
• Los pasos son:
1. Lisis de partículas víricas y desnaturalización.
2. Hibridación de sondas específicas:
▪ Sondas para captura: parte de la sonda es complementaria del ácido nucleico
vírico y otra es complementaria de un oligonucleótido de captura fijado a la
pared de un pocillo de una place microtiter.
▪ Sondas de extensión: parte de la sonda es complementaria del ácido nucleico
vírico y la otra es complementaria del extremo de un oligonucleótido
preamplificador.
3. Captura del híbrido.
4. Preamplificación: se añade al pocillo un oligonucleótido preamplificador.
5. Amplificación: se añade al pocillo los oligonucleótidos amplificadores.
6. Detección: se añaden los oligonucleótidos marcados con fosfatasa alcalina.
7. Revelado.

5.4. TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN

• Permiten detectar y localizar secuencias de ácidos nucleicos (ADN y ARN) sobre cromosomas
metafásicos, células y tejidos.
• Son las técnicas en las que se realiza directamente sobre extensiones citológicas o secciones
de tejido y el resultado obtenido se analiza microscópicamente.
• FISH (hibridación in situ fluorescente): las sondas se marcan con fluorocromos.
• CISH (hibridación in situ cromogénica): las sondas se marcan con haptenos.
5.4.1. TIPOS DE MUESTRAS PARA ISH

• La expresión in situ significa que la secuencia diana se localiza en el sitio en el que se

encuentran fisiológicamente, es decir, los cromosomas o núcleos interfásicos en el caso del
ADN y en el citoplasma en el caso del ARN.
5.4.2. ISH FLUORESCENTE (FISH)

• Se basa en el empleo de sondas marcadas con fluorocromos, que son detectadas visualizando
las preparaciones con un microscopio de fluorescencia mediante los filtros adecuados.
• Su principal aplicación es la detección de alteraciones cromosómicas, tanto numéricas como
estructurales en relación con el diagnóstico y pronóstico de patologías oncológicas o con base
genética.
 Protocolo genérico
➢ Hibridación: se realiza directamente sobre la preparación, aplicando 5 ul de la sonda marcada.
➢ Lavado de poshibridación.
➢ Contratinción: se añade 5-7 ul de solución de contratinción sobre el área de hibridación. La
solución de contratinción contiene diamino-fenil-indol (DAPI) con luz ultravioleta muestran
fluorescencia azul.
➢ Visualización: se visualizan con un microscopio de fluorescencia. En preparaciones de
metafases, los cromosomas se visualizan en color azul, y las secuencias diana como puntos o
manchas rojas o verdes.
5.4.3. ISH CROMOGÉNICA (CISH)

• Se caracteriza porque el híbrido de detecta mediante una reacción inmunohistoquímica que

produce un producto coloreado visible con un microscopio óptico convencional de luz
transmitida.
• Se realiza principalmente sobre secciones de tejido FFPE.
Protocolo genérico
1. Desparafinado y rehidratación: la inclusión en parafina es un método habitual de
conservación de los tejidos durante periodos muy prolongados.
2. Digestión enzimática: libera a los ácidos nucleicos de su unión a histonas y otras proteínas.
3. Prehibridación: bloqueo de posibles uniones inespecíficas de la sonda al tejido.
4. Hibridación: se realiza directamente sobre la preparación, aplicando la sonda marcada.
5. Lavado de poshibridación: se lavan por inmersión en soluciones de poshibridación
colocadas en cubetas Coplin.
6. Detección del híbrido: se elige un método u otro en virtud del marcador empelado y del
tamaño de la sonda.
7. Contratinción: tras el revelado del marcaje, en el tejido aparecen manchas coloreadas en
las regiones en que se encuentra la secuencia diana. Sin embargo, el resto del tejido no es
visible al microscopio, por lo que no se puede interpretar el resultado. Por eso, es
necesario contrateñir el tejido con una tinción suave, que no enmascare el resultado de la
ISH.
8. Visualización: microscopio óptico de luz.