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Dilucin y conservacin de semen

Tecnologa Reproductiva Dr. Jaime Ruiz Bjar

Dilucin de semen

Consiste en mezclar el semen con sustancias llamadas dilutores. Propsitos: Aumentar el volumen del eyaculado para poder inseminar el mayor nmero de hembras posibles. Mantener frtiles y motiles a los espermatozoides el mayor tiempo posible.

Propiedades de los dilutores

Aumentar el volumen del eyaculado. Contener sustancias nutritivas, capaces de mantener con vida a los espermatozoides No contener sustancias toxicas para los espermatozoides. Tener la misma presin osmtica que el semen. Tener un PH neutro. Debe actuar como sustancia buffer. Prevenir contra el shock fro. Contener sustancias anti-bacteriales. Ser econmicos y fciles de reparar. Contener sustancias que favorecen la congelacin de los espermatozoides.

Dilutores ms usados

CITRATO Yema de huevo. Dilutor a base de leche. Dilutor a base de agua de coco. Dilutor TRIS Yema de huevo.

DILUTOR YEMA CITRATO

Se prepara de la forma siguiente: Se disuelve 2.5 gr. de citrato de sodio qumicamente puro en 100 cc de agua destilada. Se toma 80% de la solucin preparada y se le agrega 20% de yema de huevo. La preparacin de ambos dilutores es para semen fresco o refrigerado, cuya duracin hbil, en refrigeracin es de 2 a 3 das.

Preparacin del dilutor yema citrato


Solucin madre Citrato de Na al 2,9% + 1gr. Glucosa se completa hasta 100 cc de agua bidestilada. 80% solucin madre 20% yema de huevo Sustancias antimicrobiales (penicilina 500 a 1000 UI/cc de dilutor, estreptomicina 500 a 1000 g/cc de dilutor, sulfanilamida 5 mg/cc de dilutor). Para semen fresco (15-25C) hasta 6-15 horas. Para semen refrigerado (4 5 C) hasta 24-36 horas.

Dilutor TRIS Yema de huevo


Se prepara de la siguiente forma. Pesar los siguientes ingredientes: Tris ( hidrximetil amino metano): 3.605 gr. cido ctrico: 2.05 gr. Fructosa. 1.48 gr. Se disuelve estos 3 ingredientes en agua bidestilada, enrasando a 100 cc. En una probeta graduada. Se toma 80% de la solucin y se le agrega 20% de yema de huevo. Ejemplo necesitamos preparar 50 cc de dilutor: El 80% de 50 cc = 80*50/100 = 40 cc. El 20%(yema de huevo) de 50cc. = 20*50/100 = 10 cc. Todos estos ingredientes son colocados en una probeta y enrasados en agua bidestilada a 100 cc. Esta solucin tambin se le llama solucin madre o buffer TRIS.

Preparacin de dilutor yema tris

Solucin madre
Tris (hidrometil amino metano) Ac. Ctrico Fructosa Penicilina Estreptomicina Completar a 100cc con agua bidestilada 3,605 gr. 2,024 gr. 1,488 gr 100 UI 100 g

Preparacin de dilutor yema tris


Para semen congelado dividir solucin madre en A y B.
A Solucin madre Yema de huevo 67,2% 20,0% B 67,2% 20,0%

Agua bidestilada
Glicerina

12,8%
------

----12,8%

La solucin A en forma lenta se agrega por las paredes de la probeta. Luego la solucin B se divide en 4 partes y se vaca al semen cada 15 minutos.

Dilutor a base de leche

Se puede utilizar leche entera, descremada u homogenizada. Para su uso se calienta la leche entre 92 y 95 grados centgrados durante 10 minutos en Bao Mara, luego se filtra para separar la nata y la espuma, y cuando alcanza una temperatura de 32 y 34 C ya puede ser usado como dilutor.

Dilutor con Leche


A B

Leche Yema de huevo Glicerina

100% ----------

80% 15% 5%

La solucin A se agrega en forma lenta a temperatura corporal (37C). Luego la solucin B se divide en 4 partes y se agrega cada 15 minutos.

Agentes Antibacteriales
El semen recin colectado normalmente trae alta carga bacterial, aun cuando previo a la coleccin se haya limpiado el orificio prepucial. Las bacterias compiten con el semen por nutrientes, alterando el pH. Por lo cual para evitar los efectos nocivos es conveniente aadir antibiticos, de los cuales los ms usados son. Penicilina.- Se emplea en cantidades de 500 a 1000 unidades internacionales por cc de dilutor. Estreptomicina.- Se emplea en cantidades de 500 a 100 microgramos por cc de dilutor. Sulfamilamida.- Se utiliza en dosis de 5 mg por cc de dilutor.

Precauciones a tener en cuenta al hacer la dilucin


Es necesario contar con un ambiente de laboratorio limpio y que ofrezca condiciones de higiene adecuadas. Debe evitarse la incidencia de los rayos del sol sobre el eyaculado porque los rayos ultravioleta matan a los espermatozoides. El instrumental de vidrio debe ser estril y completamente seco. El semen y el dilutor deben mezclarse a una misma temperatura de 25 a 30 C. El agregado del semen debe hacerse en forma suave. Debe agregarse el semen al dilutor por las paredes de la probeta que contiene el dilutor y no al revs. La tasa de dilucin debe estar de acuerdo con las caractersticas seminales estudiadas previamente.

Agregado dilutor A

Previamente preparado

Dilutor A

Semen fresco

Bao mara

Agregado dilutor B

En tres proporciones

Tcnicas de conservacin

La IA nos ofrece una serie de ventajas sobre el servicio de la monta natural, dentro de estas la ms importante es la que se refiere a la conservacin del semen. En la actualidad solo se utiliza el mtodo de conservacin por congelacin debido al avance de la tecnologa en cuanto a envases de semen congelado, instrumental necesario para la inseminacin y los tanques criognicos de diferentes tamaos que permiten la conservacin de las dosis de semen y la posibilidad de llevar la inseminacin a lugares de difcil acceso.

Ventajas de la congelacin

Permite almacenar el semen por varios aos, conservando la misma potencialidad en cuanto a la fertilidad que cuando se congel, posibilitando el uso an despus de muerto el toro donador. Mediante el uso del semen congelado se logra solucionar el problema de las distancias, de tal manera que permita adquirir y usar el semen de los mejores toros probados del mundo.

Procedimiento para congelar el semen usando el dilutor tris yema de huevo


Preparacin de la solucin buffer TRIS - yema de huevo, se preparan 2 dilutores de la siguiente manera
Dilutor A
Solucin buffer TRIS
Yema de huevo Agua bidestilada Glicerina Total dilutor

Dilutor B 67.2%
20.0% 12.8% 100.0%

67.2 %
20.0 % 12.8% 100.0%

Procedimiento para congelar el semen usando el dilutor tris yema de huevo

Se prepara la solucin buffer en cantidad suficiente calculando el N de dosis a preparar y la cantidad de dilutor necesario, de la siguiente manera.
N de dosis = V x [ ] x % motilidad x % de vivos N de espermatozoides por dosis

Donde:

V :volumen de semen colectado/cc. [] :concentracin de espermatozoides en millones / cc. %de motilidad :motilidad expresada en unidades. %vivos :%de vivos expresados en unidades. N de spz/dosis :25 a 30 millones.

Congelamiento de pajillas de semen

Congelamiento de pajillas de semen


Refrigeracin 2-3 horas a 4-5 C (Ambientacin).
Colocar las pajillas sobre la rejilla metlica. La temperatura en la rejilla debe ser de 0 C.

Se va introduciendo la rejilla dentro de la caja de tecnopor, la temperatura debe bajar 20 C/minuto hasta llegar a 140 C (7 minutos).
Si el descenso no es a 20 C/minuto hay que aplicar electricidad (5-10 segundos). Al llegar a 140 C se introducen la rejilla hasta el fondo de la caja para llegar a 196 C.

Almacenamiento de la dosis

Introducir las varillas de aluminio y los globets (tubitos de plstico) dentro del nitrgeno lquido. Usando la pinza de plstico o madera depositar las pajuelas en los globets y luego estos colocarlos en las varillas de aluminio; en estas condiciones las dosis de semen congelado deben ser rpidamente pasadas a las canastillas de almacenamiento en el tanque criognico, previamente abastecido de nitrgeno lquido. Es importante verificar antes de almacenar el semen la motilidad espermtica, la cual debe estar entre 60 y 70 % para esto se debe descongelar una pajilla, sacndola de la caja con nitrgeno lquido y colocndola en una cubeta con agua a 38 40 C por 10 a 12 segundos; sacar la pajilla y cortar por el extremo correspondiente colocando una gota de semen en una lmina portaobjetos para observar a unos 200 400 aumentos si la motilidad es adecuada guardar las dosis de semen.

Manejo del tanque de almacenamiento de la dosis

Ejercer un estricto control del contenido de nitrgeno lquido, el que nunca debe bajar de su nivel normal. Este control debe efectuarse mediante una varilla graduada en pulgadas o en centmetros. El chequeo debe hacerse cada 2 a 3 semanas y cuando el nivel este 4 a 5 pulgadas se procede al rellenado del tanque con nitrgeno lquido. Guardar el tanque en un lugar fresco y seguro, de preferencia en un lugar con llave cuidar que este siempre con la tapa bien puesta para evitar que se derrame o evapore el nitrgeno, con lo cual puede deteriorarse todo el semen por efecto de la descongelacin. Cuando debe ser transportado es necesario fijarlo bien para evitar balanceo o choque. Determinar la localizacin del semen que se va a usar antes de abrir el tanque; sacar la pajilla que se necesite e inmediatamente tapar el tanque .

Manipulacin adecuada de la PAJILLA

No exponer la pajilla de semen a temperatura ambiente por mas de 20 segundos; nunca levante la canastilla con los portapajillas a una altura que sobrepase el cuello del tanque por mas de 40 segundos, si necesita ms tiempo para su trabajo, devolverla al fondo por 15 segundos, para restablecer la temperatura a la del nitrgeno lquido. Usar en lo posible guantes o pinzas de madera o plstico al manipular el semen, as evitara quemarse las manos con el nitrgeno lquido.

Descongelacin de la pajilla

Disponer de una cubeta con agua a una temperatura de 38 a 40 C. Pasar la pajilla rpidamente del tanque al recipiente con agua caliente. La pajilla debe descongelarse en la cubeta por espacio de 10 a 12 segundos, luego por las cuales debe ser extrada y secada con una franela o papel higinico. Cargar la pistola de inseminacin con la pajilla y cortar el extremo libre para luego cubrir la pajilla y el cuerpo de la pistola con la funda plstica. Realizar la inseminacin de la vaca.

Generalidades sobre tanque y pajillas

El tanque contiene pajillas de diferentes toros y razas por lo que estos deben estar debidamente identificadas. Se deben mantener un inventario constante de la existencia de las pajillas, con la finalidad de mantener un plan de trabajo sin inconvenientes. De preferencia se recomienda tener en cada canastilla del tanque, semen de un solo toro. La presentacin del semen congelado en la actualidad solo es en pajilla de 0.5 y 0.25 cc. De capacidad. Este semen es envasado en pajillas y pajuelas cuyos extremos son taponados con alcohol polivinlico (polvo fino de colores variados) que tiene la propiedad de que al entrar en contacto con el semen diluido se endurece e impermeabiliza los extremos de las pajuelas. La congelacin se realiza utilizando nitrgeno lquido.

Congelamiento de semen en Pellets

Mellisho E., E. Flores (2004) Criopreservacin de semen ovino en el Per. Visin veterinaria, ISSN 680-9335, N. 37, 2004

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