UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE TLAXCALA

Ingeniería en biotecnología

Balance de materia y energía

Proyecto:
Modelo de producción de la proteína Cry con Bacillus thuringiensis para uso
de plaguicida

Integrantes:
Félix Limón Santiago
Zulikey Lemus Vásquez
Erick Tlecuilt Espinoza
Daniel Pedraza Chávez
Ángel David Aguilar Tepatzi
 Introducción

El control de plagas de insectos es un problema importante en la agricultura y la salud

pública. Los insecticidas químicos tradicionales son eficaces, pero tienen efectos adversos
sobre el medio ambiente y la salud humana. Él insecto patógeno más exitoso utilizado para
el control de insectos es la bacteria Bacillus thuringiensis (Bt), que actualmente representa
aproximadamente el 2% del mercado total de insecticidas. La gran potencia y especificidad
de Bt, su velocidad de acción, aunado a su ausencia de efectos sobre otros organismos no
blanco, propició su rápido desarrollo comercial a partir de su descubrimiento a fines de la
década de los 70', Bt es casi exclusivamente activo contra los estadios larvarios de diferentes
órdenes de insectos. Los insecticidas microbianos, como Bacillus thuringiensis (Bt), son una
alternativa más sostenible. Bt produce toxinas insecticidas que matan a los insectos, tras la
esporulación, Bt produce inclusiones de cristales insecticidas que están formadas por una
variedad de proteínas insecticidas llamadas toxinas Cry o Cyt, las toxinas Cry de Bt son
proteínas formadoras de poros (PFT). El modo de acción de la familia de toxinas Cry implica
la interacción secuencial de estas toxinas con varias proteínas del intestino medio de los
insectos, lo que facilita la formación de una estructura de oligómero preporo y la posterior
inserción de membrana que conduce a la muerte de las células del insecto del intestino
medio por choque osmótico, pero estas toxinas también pueden tener un espectro de
actividad estrecho y ser susceptibles a la resistencia. El modo de acción de las toxinas Cry se
ha estudiado principalmente en insectos lepidópteros y se ha revisado
recientemente. Además, también se ha revisado previamente la identificación de proteínas
del intestino medio de insectos que se unen a las toxinas Cry y median en la toxicidad y la
especificidad de los insectos. Hasta la fecha, se han utilizado diferentes preparaciones de
esta bacteria, tales como líquidos, polvos, granulos, peilets, microgránulos y otros, que se
aplican a los sitios de cultivos dependiendo de la especie de plaga. Sin embargo, a pesar de
sus diversos atributos, las formulaciones a base de este microorganismo presentan ciertas
desventajas, como son la sedimentación rápida de la toxina en el ambiente acuático donde
se aplica, así como la degradación que sufre debido a la acción de la luz ultravioleta del sol,
por lo que tratamos de resolver estos problemas que impiden la prolongación de la actividad,
mediante la incorporación de sustancias de liberación lenta así como fotoprotectores
solares, que incluyen diversos cromóforos
 Marco Teórico

Los distintos aislamientos de B. thuringiensis presentan en general características

bioquímicas comunes. Poseen la capacidad de fermentar glucosa, fructosa, trealosa, maltosa
y ribosa, y de hidrolizar gelatina, almidón, glucógeno, esculina y N-acetil-glucosamina.
Bacillus Thuringiensis es una bacteria aeróbica gran positiva, aeróbica no estricta, con un
rango de temperatura de crecimiento entre 10° y 45°C. Su característica principal es la
formación de inclusiones proteicas cristalinas durante la fase de esporulación. El efecto tóxico
de las proteínas se inicia inmediatamente después de la ingestión, entre los síntomas se
encuentra la pérdida de apetito del insecto y el abandono de los alimentos, seguido de
parálisis del intestino y posterior muerte. Las larvas muertas con intoxicación por Bt tienen el
característico color negro de esta infección. La mayoría de los bioinsecticidas a base de B.
thuringiensis se producen empleando un número reducido de cepas y utilizan sólo una
pequeña proporción de las proteínas Cry conocidas. En la producción de bioinsecticidas
requiere del diseño de un medio de cultivo adecuado para el crecimiento, esporulación y
formación de la S-endotoxina. Obviamente se tendrá que satisfacer el suministro de una
fuente de Carbono adecuada, una fuente de Nitrógeno y requerimientos minerales, Para la
elaboración de productos biológicos es fundamental contar con una estructura física
adecuada, equipos y suministros de buena calidad. Los principales pasos para la producción
consisten en: bioprospección, almacenamiento de microorganismos, proceso de
fermentación, recuperación de principios activos de interés (proteínas, esporas), formulación
del producto y control de calidad. Luego de seleccionar las cepas a utilizar, la multiplicación
se llevará a cabo mediante un proceso de fermentación en biorreactores, compuesto por sus
actuadores tales como: control del pH mediante la adición de ácido y base, temperatura,
adición de nutrientes, control y monitoreo de oxígeno disuelto, entre otros.

Las bacterias y otros microorganismos son responsables de descomponer la materia

orgánica, solubilizar y mineralizar los nutrientes, además de liberar compuestos orgánicos
como enzimas, ácidos, antibióticos, metabolitos y vitaminas.

thuringiensis es una bacteria aeróbica grampositiva, aeróbica no estricta, con un rango de

temperatura de crecimiento entre 10° y 45°C. Su característica principal es la formación de
inclusiones proteicas cristalinas durante la fase de esporulación. Estas inclusiones contienen
una serie de proteínas con función insecticida como α-exotoxinas, β-exotoxinas, δ-
endotoxinas (proteínas Cry y Cyt) y proteínas insecticidas vegetativas (VIP), que se producen
y secretan durante la fase vegetativa del crecimiento bacteriano. La función insecticida de Bt
se debe a la presencia de cristales llamados delta-endotoxinas o proteínas Cry. Estas
proteínas son responsables de la actividad entomopatógena en insectos diana, siendo
eficaces en diferentes órdenes de insectos como Lepidoptera y Coleoptera.

Estas proteínas, que tienen forma de cristales, al ser ingeridas por larvas de insectos, se
solubilizan en el intestino debido al pH alcalino, y así liberan protoxinas que son clivadas por
proteasas, convirtiéndose en toxinas activas. Fisher (2014) informa que tales toxinas actúan
paralizando el tracto digestivo de las larvas y, posteriormente, conducen a la muerte por
inanición y parálisis general de los músculos. El efecto tóxico de las proteínas se inicia
inmediatamente después de la ingestión, entre los síntomas se encuentra la pérdida de
apetito del insecto y el abandono de los alimentos, seguido de parálisis del intestino y
posterior muerte. Las larvas muertas con intoxicación por Bt tienen el característico color
negro de esta infección.

Los medios de cultivo suelen tener una fuente de carbono (glucosa, almidón y dextrosa), una
fuente de nitrógeno (peptona, extracto de caseína) y sales minerales (calcio, manganeso,
zinc y magnesio), que a veces requieren la adición de un antiespumante. La fuente de
carbono, cuya función es suministrar energía, puede provenir de residuos industriales como
melaza de caña de azúcar, o agua de maceración de maíz. La fuente de nitrógeno sirve para
la síntesis de proteínas y ácidos nucleicos, y las sales minerales actúan como cofactores y
regulan el estrés osmótico en la célula. Luego de la selección del medio de cultivo y sus
componentes, se debe colocar en el biorreactor y se debe realizar la verificación y calibración
de los sensores de pH, temperatura, O2 y antiespumante. Una vez ajustados los parámetros,
se debe agregar a la cepa elegida aproximadamente el 2% del volumen del medio a inocular,
siendo necesario mantener los parámetros de control dentro del rango óptimo para el
crecimiento de Bt.
 Objetivo General Y Específicos
Objetivos Generales

• Dar a conocer una alternativa a los insecticidas químicos, menos contaminante para
el medio ambiente
• Plantear un proceso de destilación para la producción de Bacillus Thuriengiensis
• Dar a conocer información sobre los insecticidas microbianos
• Cultivar y procesar cepas puras de Bacillus Thuringiensis para la obtención de la toxina
Cry que se encuentra en las esporas
Objetivos Específicos

• Producir un bioincecticida a base de Bacillus Thuringienesis

• Realizar una simulación de producción a nivel industrial

Metodología

La muestra de suelo será tomada de un jardín, a una profundidad de 20cm por debajo
del suelo, aplicando la NOM-021-SEMARNAT-2000; la muestra puede ser tomada
con ayuda de una pala pequeña, una vez teniendo la muestra será vertida en un
frasco previamente ya esterilizado(La muestra debe de ser tomada un día antes). Se
tomará una muestra de un gramo de suelo en el cual no se encuentrenpesticidas
para así después en el laboratorio se coloque en un tubo Eppendorf de 1.5ml estéril,
se le agrega 1ml de agua destilada. Se le da un choque térmico a 60°C durante 60
minutos, para eliminar hongos y bacterias no formadoras de esporas, es
recomendable estar constantemente checando la temperatura con un termómetro
industrial, posteriormente se preparará un medio de cultivo Luria-Bertani Se debe
colocar en el biorreactor y se debe realizar la verificación y calibración de los
sensores de pH, temperatura, O2 y antiespumante. Una vez ajustados los
parámetros, se debe agregar a la cepa elegida aproximadamente el 2% del volumen
del medio a inocular, siendo necesario mantener los parámetros de control dentro
del rango óptimo para el crecimiento de Bt. El rango de pH del medio de cultivo
para B. thuringiensis. está entre 6,8 y 7,8 y no es recomendable pasar valores por
encima de 8,5, lo que puede conducir a la solubilización de endotoxinas. La
temperatura por mantener debe estar entre 28 y 32°. Otro parámetro que requiere
atención es el oxígeno disuelto, que debe mantenerse en torno al 40% sin llegar a
valores por debajo del 20%, ya que a medida que avanza el proceso de fermentación
aumenta el requerimiento de OD.1 El tiempo de fermentación puede durar entre
24 y 72 horas, dependiendo de las condiciones de cultivo. La fermentación se realiza
en biorreactores de mesón de 1,5 litros a 15 litros, y biorreactores piloto de 25 litros
a más de 10.000 litros, siempre con control y monitoreo de parámetros como
temperatura, pH y aireación. Al final de la fermentación, el caldo fermentado se
somete a una filtración y recuperación de esporas y toxinas en una columna de
micro/ultra filtración, siendo uno de los métodos más utilizados para esta función.
Luego de esta filtración y recuperación de los metabolitos de interés, el producto
se formula con el objetivo de entregar un producto estable durante la aplicación y
almacenamiento, así como proteger a los microorganismos y cristales de
condiciones ambientales adversas.
 Conclusión

Los insecticidas a base de Bacillus thuringiensis (Bt) son una alternativa ecológica y sostenible
a los insecticidas químicos tradicionales. Estos insecticidas son eficaces en el control de una
amplia gama de plagas de insectos, y son seguros para el medio ambiente y la salud humana.
La producción de bioinsecticidas a base de Bt en biorreactores tiene una serie de ventajas
sobre los métodos tradicionales, que incluyen:

• Mayor productividad: Los biorreactores pueden proporcionar las condiciones

óptimas para el crecimiento de las bacterias y la producción de toxinas, lo que resulta
en una mayor productividad.
• Mayor uniformidad: Los biorreactores pueden garantizar una mayor uniformidad en
el producto final, lo que es importante para garantizar la eficacia del bioinsecticida.
• Mayor seguridad: Los biorreactores pueden ayudar a reducir el riesgo de
contaminación del producto final.

Sin embargo, la producción de Bt en biorreactores también tiene algunas desventajas,

que incluyen:

• Costos iniciales: La instalación y puesta en marcha de un biorreactor puede ser

costosa.
• Requerimientos técnicos: La producción de bioinsecticidas en biorreactores
requiere conocimientos técnicos especializados.
Conclusiones

Los insecticidas a base de Bt son una herramienta eficaz y segura para el control de plagas
de insectos. La producción de bioinsecticidas a base de Bt en biorreactores es una tecnología
prometedora que tiene el potencial de mejorar la sostenibilidad y la eficiencia de la
producción de estos insecticidas.
 Bibliografía

• Alejandra Bravo, Supaporn Likitvivatanavong, Sarjeet S. Gill, Mario Soberón, Bacillus

thuringiensis: A story of a successful bioinsecticide, Insect Biochemistry and
Molecular Biology, Volume 41, Issue 7,2011, Pages 423-431, ISSN 0965-1748,

• https://tecnal.com.br/es/blog/269_bacillus_thuringiensis_y_su_contribucion_a_una
_agricultura_mas_sostenible - FUENTE CONSULTADA [15-09-2021]

• ÂNGELO, E. A.; VILAS_BÔAS, G. T.; CASTRO-GÓMEZ, R. J. H. Bacillus thuringiensis:

características gerais e fermentação.Londrina:Semina: Ciências Agrárias, v.31, n.4,
p.945-958, out./dez. 2010.

• BOBROWSKI, V. L.; FIUZA, L. M.; PASQUALI, G.; BODANESEZANETTINI. Genes de

Bacillus thuringiensis: uma estratégia para conferir resistência a insetos em plantas.
Santa Maria:Ciência Rural, , v.34,n1,p.843-850, setout, 2003.

• FISCHER, T. D. Avaliação do inseticida biológico (Bacillus thuringiensis) no manejo de

pragas em cultivares de soja (Glycine Max L.) modificadas geneticamente.
Ijuí:Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul, 2014.

• GUSMÃO, F. P. Bioinseticida à base de Bacillus thuringiensis.Lorena:Monografia