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INTRODUCCION

Todas las plantas tienen o deben tener programas especiales para controlar
y prevenir la contaminación identificando los lugares, situaciones o materiales
donde la contaminación es más probable. Las inspecciones son de tipo visual,
biológico y químico para determinar donde los microorganismos pueden
contaminar. Estas inspecciones son o deben ser hechas diariamente (inspección
básica) y de forma periódica (inspección completa). Visualmente se pueden ver
residuos, suciedad, agua, polvo y otras fuentes de contaminación. Es por esta razón
que el control microbiologico toma un papel muy importante en los procesos de
una industria y en la calidad de los productos finales. En este resumen se presentan
los métodos físicos y químicos mas comunes utilizados en la industria, tambien se
hace un breve resumen de los antibioticos los cuales son un medio de controlar los
microorganismos en el cuerpo humano, lo cual es un campo de importancia dentro
de la microbiologia.

Químicamente , se realizan análisis para determinar los niveles de


conservantes, los componentes de los alimentos, etc.

Desde el punto de vista economico el control microbiologico toma un


papel importante, por ejemplo en la industria alimenticia, los alimentos
procesados que contienen microorganismos peligrosos deben ser destruidos. Si
ya están distribuidos y puestos a la venta deben ser retirados e intervenidos.
Cuando un producto es intervenido se notifica la marca, el tamaño del envase,
el lote y el tipo de peligro.
Se puede prevenir el crecimiento de los microorganismos en los
alimentos controlando las condiciones de almacenamiento (principalmente de
temperatura y humedad) así como reduciendo el tiempo que los alimentos están
en la planta hasta su procesado.
CONTROL DE LAS POBLACIONES MICROBIANAS: ESTERILIZACION
Y DESINFECCION

I.- DEFINICIONES Y CONCEPTOS

Esterilización:

proceso de destruir los agentes infecciosos o microorganismos


incluyendo sus formas de resistencia, por medio de agentes fisicos o
quimicos.

Es el proceso de destruir todas las formas de vida microbiana. Por tanto,


genera una situación en la que la probabilidad de que el objeto tratado
contenga siquiera un superviviente es infinitamente pequeña.
Así, un objeto esterilizado, en sentido microbiológico, está libre de
microorganismos vivos. El único criterio válido de muerte en el caso de un
microorganismo es la pérdida irreversible de la capacidad de reproducirse.
Eiminación de toda forma de vida, incluídas las esporas.

Desinfección:

proceso de destruir los agentes infecciosos o microorganismos


pero no sus formas de resistencia, por medio de agentes fisicos o
quimicos.

Sanitizacion:

proceso por el cual se destruyen los microorganismos a niveles


tales que son inocuos para el proceso industrial en que se relacionan
o para los seres humanos que alli operan.

Un compuesto por lo general químico que mata o interfiere con el


crecimiento y actividad de los microoganismos. Se clasifica de acuerdo a
su aplicación y a como actúa.

Agente antimicrobial:
es un compuesto por lo general químico que mata o interfiere con el
crecimiento y actividad de los microoganismos. Se clasifica de acuerdo a
su aplicación y a como actúa.

Germicida:

es un agente químico que mata los microorganismos pero no


necesariamente las esporas (ej. Los bactericidas matan bacterias, los
fungicidas matan hongos, los viricidas matan virus).

Agente microbiostático:

es uno que inhibe el crecimiento de los microoganismos pero no los


mata (ej. bacteriostático inhibe el crecimiento bacterial).

Antisepsia:

operaciones o técnicas encaminadas a crear un ambiente que impida


el desarrollo de los microorganismos e incluso pueda matarlos.

Asepsia:

técnicas empleadas para impedir el acceso de microorganismos al


campo de trabajo.

Antibiosis:

fenómeno biológico en el que existe una detención o destrucción del


crecimiento microbiano debido a sustancias producidas por otro ser vivo.

Microbicidas:

sustancias que matan las formas vegetativas, pero no


necesariamente las esporas de un microorganismo (bactericida, fungicida,
etc.).

Microbiostáticos:

sustancias que inhiben el crecimiento de microorganismos


(bacteriostáticos, fungistáticos, etc.).

Antisépticos:
se refiere a sustancias que se aplican sobre el cuerpo.

Desinfectantes:

se refiere a sustancias empleadas sobre objetos inanimados.

Agentes terapéuticos:

antimicrobianos empleados en el tratamiento de infecciones.

Agentes quimioterapéuticos:

sustancias químicas empleadas en el tratamiento de enfermedades


infecciosas o enfermedades causadas por la proliferación de células
malignas.

Antibióticos:

sustancias producidas por un ser vivo que se oponen a la vida de


otro ser vivo.
Medio de cultivo:

substrato óptimo para el mantenimiento y crecimiento de


microorganismos en el laboratorio. El medio variará dependiendo del tipo
de microorganismo.

Un cultivo que contiene solamente una clase de microorganismo se


conoce como cultivo puro o axénico. Un cultivo que contiene más de una
clase de microorganismo se conoce como cultivo mixto; en el caso
especial de que contenga sólo dos clases de microorganismos,
deliberadamente mantenidos en mutua asociación, se trata de un cultivo
bimembre.

Aislamiento:

es la separación de un microorganismo determinado de las


poblaciones mixtas que existen en la naturaleza; el cultivo, es el
crecimiento de poblaciones microbianas en ambientes artificiales (medios
de cultivo) bajo condiciones de laboratorio.
II. MUERTE DE LAS POBLACIONES MICROBIANAS Y CURVAS DE
SUPERVIVENCIA

Criterio de muerte de un microorganismo:

pérdida irreversible de la capacidad de reproducción en un medio


adecuado. Para poder determinar la eficacia antimicrobiana (la muerte de
los microorganismos) se utilizan técnicas que descubran a los
sobrevivientes es decir, a los capaces de reproducirse; ya que los
incapaces de reproducirse están muertos. Esto se determina generalmente
mediante métodos cuantitativos de siembra en placa en los que los
supervivientes se detectan porque forman colonias.

Cuando una población microbiana se expone a un agente letal, la


cinética de la muerte es casi siempre exponencial ya que el número de
supervivientes disminuye de forma geométrica con el tiempo. Si
representamos gráficamente el logaritmo del número de supervivientes
frente al tiempo se obtiene una línea recta cuya pendiente negativa define
la tasa de mortalidad. Esta tasa de mortalidad nos dice sólamente que
fracción de la población inicial sobrevive a un determinado período de
tratamiento. Para determinar el número real de sobrevivientes es necesario
conocer además el tamaño inicial de la población. De acuerdo con esto,
para establecer los procedimientos de esterilización hay que tener en
consideración dos factores: la tasa de mortalidad y el tamaño de la
población inicial. En la práctica de la esterilización la población microbiana
que ha de ser destruida es mixta. Como los microorganismos difieren
ampliamente en su resistencia a los agentes letales, los factores que se
hacen significativos son el tamaño de la población inicial y la tasa de
mortalidad de los miembros más resistentes de la población mixta. Para
asegurar la fiabilidad de los métodos de esterilización se utilizan
suspensiones de esporas de resistencia conocida. Los procedimientos
rutinarios de esterilización se diseñan siempre de forma que proporcionen
un amplio margen de seguridad.

Fundamentos del control de los microorganismos

Las razones principales para controlar los microorganismos son:


prevenir la transmisión de enfermedades, evitar el deterioro de los
alimentos y evitar la contaminación tanto en procesos industriales que
requieran cultivos puros, como en laboratorios de diagnóstico o
investigación.

III. CONDICIONES QUE INFLUYEN EN LA ACCION ANTIMICROBIANA

Concentración del agente químico

Intensidad del agente físico- cuanto más intenso es el agente físico


(calor o radiación ) mas rápidamente mata a los micoorganismos.

Tiempo de exposición- a mayor tiempo de exposición, mayor es el


número de organismos destruídos.

Temperatura a mayor temperatura se acelera la destrucción de los


organismos.

Número de organismos- mientras mayor sea la población microbiana,


más tiempo se requeire para matarla

Clase de organismo las células vegetativas son más suceptibles que la


esporas.

Estado fisiológico de las células mientras más viejas sean las células,
más rápido se destruyen.

Ambiente:
• El calor es más eficaz en un medio ácido que en uno alcalino.
• La consistencia del material, acuoso o viscoso, influye
marcadamente en la penetración del agente.
• Las concentraciones altas de carbohidratos aumentan, por lo
general, la resistencia térmica de los organismos.
• La presencia de materia orgánica extraña reduce notablemente la
eficacia de los agentes químicos antimicrobianos por inactivar éstos
o proteger al microorganismo.

IV.- AGENTES ESTERILIZANTES FISICOS

1.- Altas Temperaturas

La alta temperatura combinada con un alto grado de humedad es


uno de los métodos más efectivos para destruir microorganismos. Hay que
distinguir entre calor húmedo y calor seco. El húmedo mata los
microorganismos porque coagula sus proteínas siendo más rápido y
efectivo que el calor seco que los destruye al oxidar sus constituyentes
químicos. La acción letal del calor es una relación de temperatura y tiempo
afectada por muchas condiciones. Por ejemplo, las esporas de Clostridium
botulinum son destruidas en 4 a 20 minutos a 120° C en calor húmedo,
mientras que se necesitan alrededor de 2 horas de exposición al calor
seco para obtener los mismos resultados.

A.- Esterilización por calor húmedo: (se utiliza para soluciones acuosas)

Autoclave:

El calor en la forma de vapor a saturación y a presión es el agente


más práctico para esterilizar ya que el vapor a presión proporciona
temperaturas superiores a las que se obtienen por ebullición. El aparato
utilizado se llama autoclave (una olla que regula la presión interna y el
tiempo). Los autoclaves de laboratorio se emplean generalmente a una
presión de vapor de una atmósfera por encima de la presión atmosférica lo
cual corresponde a una temperatura de 120° C. El tiempo de exposición
depende del volumen del líquido, de tal manera que para volúmenes
pequeños (hasta unos 3 litros) se utilizan 20 minutos a 120° C; si los
volúmenes son mayores debe alargarse el tiempo de tratamiento. Algunos
materiales no se deben esterilizar en el autoclave. Sustancias que no se
mezclan con el agua no pueden ser alcanzadas por el vapor sobreviviendo
los microorganismos que contengan. Otras sustancias se alteran o son
destruidas por tratamientos prolongados de calor empleándose en estos
casos otros métodos de esterilización.

Tindalización:
Se utiliza cuando las sustancias químicas no pueden calentarse por
encima de 100° C sin que resulten dañadas. Consiste en el calentamiento
del material de 80 a 100° C hasta 1 hora durante 3 días con sucesivos
períodos de incubación. Las esporas resistentes germinarán durante los
períodos de incubación y en la siguiente exposición al calor las células
vegetativas son destruidas.

Pasteurización:
La leche, nata y ciertas bebidas alcohólicas (cerveza y vino) se
someten a tratamientos de calor controlado que sólo matan a ciertos tipos
de microorganismos pero no a todos. La leche pasteurizada no es estéril.
La temperatura seleccionada para la pasteurización se basa en el tiempo
térmico mortal de microorganismos patógenos (es el tiempo más corto
necesario para matar una suspensión de bacterias a una temperatura
determinada). Mycobacterium tuberculosis es de los microorganismos
patógenos más resistentes al calor que puede transmitirse por la leche
cruda y se destruye en 15 minutos a 60° C. Posteriormente se descubrió
que Coxiella burnetti, agente causal de la fiebre Q, se encuentra a veces
en la leche y es más resistente al calor que Mycobacterium tuberculosis
por lo que la pasteurización de la leche se realiza a 62,8° C durante 30
minutos o a una temperatura ligeramente superior, 71,7° C durante 15
segundos (Flash-Pasteurización).

B.- Esterilización por calor seco: (se utiliza para materiales sólidos
estables al calor)

Horno Pasteur:

El calor seco se utiliza principalmente para esterilizar material de


vidrio y otros materiales sólidos estables al calor. El aparato que se emplea
es el horno Pasteur. Para el material de vidrio de laboratorio se consideran
suficientes dos horas de exposición a 160° C.
Incineración:

La destrucción de los microorganismos por incineración es una


práctica rutinaria en los laboratorios. Las asas de siembra se calientan a la
llama de mecheros Bunsen. La incineración también se utiliza en la
eliminación de residuos hospitalarios.

2.- Bajas Temperaturas

En general, el metabolismo de las bacterias está inhibido a


temperaturas por debajo de 0° C. Sin embargo estas temperaturas no
matan a los microorganismos sino que pueden conservarlos durante largos
períodos de tiempo. Esta circunstancia es aprovechada por los
microbiólogos para conservar los microorganismos indefinidamente. Los
cultivos de microorganismos se conservan congelados a -70° C o incluso
mejor en tanques de nitrógeno líquido a -196° C.

3.- Radiaciones

A.- Radiaciones ionizantes

Rayos gamma:

Las radiaciones gamma tienen mucha energía y son emitidas por


ciertos isótopos radiactivos como es el Co60 pero son difíciles de controlar
ya que este isótopo emite constantemente los rayos gamma en todas
direcciones. Estos rayos gamma pueden penetrar los materiales por lo que
un producto se puede empaquetar primero y después esterilizar.

Rayos catódicos (Radiación con haz de electrones):

Se usan para esterilizar material quirúrgico, medicamentos y otros


materiales. Una ventaja es que el material se puede esterilizar después de
empacado (ya que éstas radiaciones penetran las envolturas) y a la
temperatura ambiente.

B.- Radiaciones no ionizantes

Luz ultravioleta:
La porción ultravioleta del espectro incluye todas las radiaciones
desde 15 a 390 nm. Las longitudes de onda alrededor de 265 nm son las
que tienen mayor eficacia como bactericidas (200 - 295 nm). Se usan para
reducir la población microbiana en quirófanos, cuartos de llenado asépticos
en la industria farmacéutica y para tratar superficies contaminadas en la
industria de alimentos y leche. La luz UV tiene poca capacidad para
penetrar la materia por lo que sólo los microorganismos que se encuentran
en la superficie de los objetos que se exponen directamente a la acción de
la luz UV son susceptibles de ser destruídos.

4.- Presión osmótica


La pared celular de las bacterias las protege de cambios en la presión
osmótica del medio.Sin embargo si la presión osmótica externa es alta el
organismo puede morir. Altas concentraciones de sal interrumpen los
procesos de transporte a través de la membrana y desnaturalizan las
proteínas

5.- Ondas ultrasónicas (sonicación)


En general, los microorganismos suspendidos en un líquido y
sometidos a la acción de ondas ultrasónicas de altas intensidades (20,000
ciclos/seg.) durante cierto tiempo se destruyen porque se rompe la
pared celular y se pierde el contenido de la célula.

6.- Filtración
Algunos materiales como los líquidos biológicos (suero de animales,
soluciones de enzimas, algunas vitaminas y antibióticos) son termolábiles.
Otros agentes físicos como las radiaciones son perjudiciales para estos
materiales e imprácticos para esterilizarlos, por lo que se recurre a la
filtración a través de filtros capaces de retener los microorganismos. Los
microorganismos quedan retenidos en parte por el pequeño tamaño de los
poros del filtro y en parte por adsorción a las paredes del poro durante su
paso a través del filtro debido a la carga eléctrica del filtro y de los
microorganismos. Debido al pequeño tamaño de los virus, nunca es
posible tener certeza de que, por los métodos de filtración que dejan libre
de bacterias una solución, se van a eliminar también los virus.

A.- Filtros de membrana


Los filtros de membranas son discos de ésteres de celulosa con
poros tan pequeños que previenen el paso de los microorganismos.
Existen distintos tipos de filtro dependiendo del tamaño de poro. Estos
filtros son desechables. Además de utilizarse en la esterilización de
líquidos se usan en el análisis microbiológico de aguas ya que concentran
los microorganismos existentes en grandes volúmenes de agua.
B.- Filtros HEPA
Un filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air) está compuesto por
pliegues de acetato de celulosa que retienen las partículas (incluídos los
microorganismos) del aire que sale de una campana de flujo laminar.

7.- Desecación
La desecación de las células vegetativas microbianas paraliza su
actividad metabólica. Este proceso físico se utilizaba ampliamente antes
del desarrollo de la refrigeración. El tiempo de supervivencia de los
microorganismos después de desecados depende de muchos factores,
entre ellos la especie microbiana. En general, los cocos Gram (-) son más
susceptibles a la desecación que los cocos Gram (+). Las endoesporas
bacterianas son muy resistentes a la desecación pudiendo permanecer
viables indefinidamente.

V.- AGENTES ESTERILIZANTES QUIMICOS

1.- Oxido de etileno:

El requerimiento esencial para un agente químico esterilizante es


que sea volátil así como tóxico para los microorganismos, de manera que
pueda ser fácilmente eliminado del objeto esterilizado después del
tratamiento. Normalmente se utiliza el óxido de etileno, un líquido que
hierve a 10,7° C. Se usa en la industria para la esterilización de placas
Petri, jeringas y otros objetos de plástico que se funden a temperaturas
superiores a los 100° C. Debido a su alto poder de penetración estos
objetos se empaquetan primero y después se esterilizan. El óxido de
etileno actúa inactivando enzimas y otras proteínas que contienen grupos
sulfidrilos (R-SH) mediante una reacción llamada alquilación (R-S-
CH2CH2O-H).

2.- Glutaraldehido:

Una solución acuosa al 2% presenta una amplia actividad


antimicrobiana. Es efectivo frente a virus, células vegetativas y esporas de
bacterias y hongos. Se usa en medicina para esterilizar instrumentos
urológicos y ópticos.
VI.- DESINFECTANTES Y ANTISEPTICOS

Esterilización:

es el proceso de destrucción de todas las formas de vida microbiana.

Desinfección:
es el proceso de destrucción de los agentes infecciosos.

Desinfectantes:

son aquellas sustancias químicas que matan las formas vegetativas y no


necesariamente las formas de resistencia de los microorganismos
patógenos. Se refiere a sustancias empleadas sobre objetos inanimados.

Ningún agente químico antimicrobiano sólo es el mejor o ideal para uno o


todos los propósitos. Existen diferencias en sus mecanismos de acción y
muchos tipos de células microbianas que pueden ser destruídas. No
obstante, existen una serie de características que debe de tener un buen
desinfectante, y son las siguientes:

- Actividad antimicrobiana: el primer requerimiento es la capacidad de la


sustancia para matar microorganismos. Así, la sustancia química a baja
concentración deberá tener un amplio espectro de actividad
antimicrobiana.

- Solubilidad: la sustancia deberá ser soluble en agua y/u otros disolventes


en la medida necesaria para un uso eficaz.

- Estabilidad: los cambios en la restbilidad de la sustancia deberán ser


mínimos y no afectar considerablemente la acción germicida.

- No deberá ser tóxica para el hombre u otros animales: de manera ideal,


la sustancia deberá ser letal para los microorganismos y no para el hombre
u otros animales.

- Homogeneidad: la preparación deberá ser uniforme en su composición


de manera que los ingredientes activos se encuentren en cada aplicación.

- No deberá reaccionar con material orgánico extraño: muchos


desinfectantes tienen afinidad por las proteínas y otros materiales
orgánicos. Cuando se usan estos desinfectantes en situaciones en las que
además de bacterias hay cantidades considerables de material orgánico,
muy poco desinfectante estará disponible para actuar contra los
microorganismos.

- Toxicidad para los microorganismos a la temperatura del ambiente donde


se usará.

- Capacidad de penetración: a menos que la sustancia pueda penetrar a


través de las superficies, su acción germicida se limitará al sitio de
aplicación.

- No deberá corroer ni teñir.

- Propiedad desodorante: es deseable que tenga atributos desodorantes,


así como desinfectantes. Lo ideal es que el desinfectante tenga por sí
mismo olor agradable o sea inodoro.

- Capacidad detergente: un desinffectante que a la vez sea detergente


(agente limpiador) aumentará la eficacia del desinfectante.

- Disponibilidad: el compuesto deberá estar dispnible en grandes


cantidades y a precio razonable.

Antisépticos:
son aquellas sustancias químicas que previenen el crecimiento o acción de
los microorganismos ya sea destruyéndolos o inhibiendo su crecimiento y
actividad. Se refiere a sustancias que se aplican sobre el cuerpo.

A.- INORGANICOS

1.- Metales:

Los más efectivos son el mercurio, plata ,cobre y zinc. Actúan


inactivando las proteínas celulares al combinarse con ellas. Entre los
compuestos de mercurio que se emplean como antisépticos en heridas
superficiales de la piel y mucosas están el mercurocromo (mercromina) y
el mertiolato. Entre los compuestos de plata utilizados como antisépticos
está el nitrato de plata (AgNO3) que en solución al 1% se ha utilizado para
prevenir infecciones gonocócicas en los ojos de los recién nacidos aunque
actualmente se está reemplazando por antibióticos como la penicilina.
Entre los compuestos de cobre se encuentra el sulfato de cobre (CuSO4)
que se utiliza como algicida en los recipientes abiertos que contienen
agua. También es fungicida por lo que se utiliza para controlar las
infecciones fúngicas de plantas (Mezcla Bordolesa). Los compuestos de
zinc también son fungicidas por lo que se utilizan para tratar el pié de
atleta.

2.- Acidos y álcalis:

Actúan alterando la permeabilidad y coagulando las proteínas. En


general los ácidos son más eficaces que los álcalis. Dentro de estos
compuestos se encuentran el sulfúrico (H2SO4), nítrico (HNO3),
hidróxido sódico (NaOH) e hidróxido potásico (KOH). Tienen aplicación
limitada debido a su naturaleza cáustica y corrosiva. Aún así el NaOH se
utiliza en la industria del vino para limpiar las cubas de madera.

3.- Compuestos inorgánicos oxidantes:

actúan oxidando los componentes de la membrana y enzimas. El


agua oxigenada (H2O2) al 6% (20 volúmenes) se utiliza como antiséptico
en pequeñas heridas de la piel.

4.- Halógenos:

Los halógenos especialmente el cloro y el iodo son componentes de


muchos antimicrobianos. Los halógenos son agentes fuertemente
oxidantes por lo que son altamente reactivos y destructivos para los
componentes vitales de las células microbianas.

Cloro:

La muerte de los microorganismos por acción del cloro se debe en


parte a la combinación directa del cloro con las proteínas de las
membranas celulares y los enzimas. Así mismo en presencia de agua
desprende oxígeno naciente (O) que oxida la materia orgánica:

Cl2 + H2O ----------------> HCl + HClO (ácido hipocloroso)

HClO ----------------> HCl + O (oxígeno naciente)

El gas cloro licuificado se utiliza en la desinfección del agua de


bebida y piscinas. El hipoclorito sódico (lejía) al 1% se puede utilizar como
desinfectante doméstico.

Iodo:
El mecanismo mediante el cual el iodo ejerce su acción
antimicrobiana es debido a su acción oxidante. Además la habilidad que
tiene el iodo para combinarse con el aminoácido tirosina resulta en la
inactivación de enzimas y otras proteínas. El iodo se puede utilizar como
antiséptico bajo dos formas: i) tintura de iodo, es una solución alcohólica
(tintura) de iodo (I2) más ioduro potásico (KI) o ioduro sódico (NaI). ii)
iodóforos, son mezclas de iodo (I2) con compuestos que actúan como
agentes transportadores y solubilizadores del iodo. Por ejemplo, la
povidona iodada (Betadine) es un complejo de iodo y polivinil pirrolidona
(PVP). Los iodóforos tienen la ventaja de que no tiñen la piel. Las
preparaciones de iodo se utilizan principalmente para desinfectar la piel así
como en la desinfección de pequeñas cantidades de agua. Los vapores de
iodo se utilizan a veces para desinfectar el aire.
B.- ORGANICOS

1.- Alcoholes:

El alcohol metílico (1C) es menos bactericida que el etílico (2C) y


además es altamente tóxico. Hay un aumento en el poder bactericida a
medida que aumenta la longitud de la cadena carbonada; pero como los
alcoholes con peso molecular superior al del propílico (3C) no se mezclan
en todas las proporciones con el agua, no se suelen utilizar como
desinfectantes. Los alcoholes actúan desnaturalizando las proteínas,
disolviendo las capas lipídicas y como agentes deshidratantes. El etanol al
96% se usa como antiséptico de la piel y como desinfectante en los
termómetros clínicos orales y algunos instrumentos quirúrgicos.

2.- Fenol y compuestos fenólicos:

Una solución acuosa al 5% de fenol mata rápidamente a las células


vegetativas de los microorganismos. Sin embargo, las esporas son mucho
más resistentes al fenol. Debido a que el fenol es tóxico y tiene un olor
desagradable ya casi no se usa como desinfectante o antiséptico, siendo
reemplazado por compuestos fenólicos que son sustancias derivadas del
fenol menos tóxicas y más activas frente a los microorganismos. Lysol es
una mezcla de compuestos fenólicos que se utiliza para desinfectar
objetos inanimados como los suelos, paredes y superficies. El fenol y
compuestos fenólicos actúan alterando la permeabilidad de la membrana
citoplásmica así como desnaturalizando proteínas.

VII.- EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS


DESINFECTANTES Y ANTISEPTICOS

Para el estudio de los microorganismos es necesario cultivarlos en


condiciones de laboratorio. Para ello hay que conocer los nutrientes y
condiciones físicas que requieren, información que disponemos tras
investigaciones extensas y con las que se han desarrollado numerosos
medios de cultivo.

Condiciones generales de un medio de cultivo:

- presentar todos los elementos necesarios y en sus


proporciones/cantidades necesarias.
- pH adecuado.
- condiciones osmóticas adecuadas.
- debe de ser estéril y preservado de cualquier contaminación.
- medio fresco (ya que se desecan y pierden humedad,
concentrándose el resto de componentes).

Componentes de los medios de cultivo:


- Agua

- Extracto de levadura:

fuente rica en vitaminas B; también contiene nitrógeno


orgánico y compuestos de carbono.
- Peptonas:

es el producto que resulta de la digestión de materiales


proteicos. Constituye una fuente principal de nitrógeno
orgánico; contiene también algunas vitaminas, y a veces
carbohidratos. Distinguimos dos tipos, dependiendo del tipo de
digestión que hayan sufrido:
- Hidrólisis química (ácida o alcalina)
- Hidrólisis enzimática

- Infusiones y extractos:

contienen las sustancias solubles en agua de tejidos


animales (carbohidratos, compuestos orgánicos nitrogenados,
vitaminas solubles en agua y sales). Mientras que un caldo se
obtiene por ebullición de los tejidos, una infusión implica un
"colado" del líquido obtenido. Un extracto es un concentrado de
un caldo.

- Azúcares:

actuarán como fuente de energía (cuando su proporción


es de 1 g/l) o como substrato de prueba (1-2%)

- Sales minerales:

podemos distinguir dos tipos, atendiendo a la función que


desempeñan. Estos son:
Sales para el mantenimiento de la presión osmótica (NaCl).
Tampones: carbonatos y fosfatos (este ultimo más eficaz).

- Indicadores de pH:

son sustancias que cambian de color cuando el medio


alcanza algún valor determinado de pH. Los más utilizados
son:
-Azul de timol (Rojo 1,2 Azul 2,8 Amarillo)
- Púrpura bromocresol (Amarillo 5,2 Anaranjado 6,8
Púrpura)
- Azul de bromotimol (Amarillo 6,0 Verde 7,6 Azul)
- Rojo fenol (Amarillo 6,8 Rojo claro 8,4 Rojo cereza)
- Rojo neutro (Rojo intenso 6,8 Rojo 8,0 Amarillo)
- Azul de bromofenol, rojo de metilo, rojo de cresol,
fenolftaleina, etc...

- Indicadores REDOX:

son sustancias que cambian de color cuando se


producen este tipo de reacciones. Distinguimos:
Azul de metileno (azul-incoloro)
Cloruro de trifenil (incoloro-rojo)
- Agentes selectivos:

son sustancias que inhiben el crecimiento de


determinados microorganismos en decrimento de otros.
Encontramos varios tipos:
- Colorantes (antimetabolitos): cristal violeta, verde
brillante, etc...
- Azida sódica: inhibe el metabolismo aerobio (inhibe
la cadena respiratoria); esto afecta principalmente a
bacterias Gram negativas.
- Sales biliares y detergentes: son agentes
tensoactivos, depresores de la tensión superficial. En
este caso son las bacterias Gram negativas las que
resisten más su acción.
- Cloruro sódico: a elevadas concentraciones son
perjudiciales para aquellos microorganismos no
halófilos.
- pH: cada tipo de microorganismo tiene su rango de
pH óptimo y sus valores críticos.
- Antimicrobianos: sustancias capaces de matar a
microorganismos.
- Suplementos (factores de crecimiento):

consiste en uno o mas compuestos orgánicos que un


microorganismo requiere como precursor o como constituyente de su
material orgánico celular, pero que no puede sintetizar a partir de
fuentes de carbono más sencillas, y debe ser administrado como
nutriente. Hay tres clases: aminoácidos, pirimidinas y vitaminas.

- Agentes solidificantes:
permiten solidificar un medio previamente líquido. Pueden ser
de:
- agar-agar (a partir de 10-14 g/l es un medio de cultivo
sólido; para valores inferiores, medios semisólidos).
- gel de sílice
- geles poliacrílicos

- Agentes reductores:

estos disminuyen el contenido de O2, obteniéndose así un


ambiente de anaerobiosis. Los más usados son:
- Ácido ascórbico
- Tioglicolato sódico
- Ácido tiomálico
- Cisteina

- Agentes quelantes:

son agentes que forman complejos solubles con los metales,


impidiendo así que estos formen un complejo insoluble con los
fosfatos. El más utilizado es el EDTA (ácido etilendiamino
tetraacético).

Clasificación de los medios de cultivo: atiende a distintos criterios.


Estos son:

- Composición química:
- Definidos o sintéticos
- Indefinidos o complejos

- Origen de sus componentes:


- Artificiales
- Naturales
- Mixtos

- Estado físico:
- Sólidos: rebanadas de pan, etc...
- Líquidos (caldos): caldo nutritivo, leche desnatada, etc...
- Semisólidos: con pequeñas cantidades de agar (consistencia
de "natilla")
- Sólidos reversibles a líquidos: agar nutritivo.

- Uso o aplicación:
- Comunes
- Especiales:
- Medios enriquecidos: adición de componentes, como sangre,
suero, etc..., para proporcionar sustancias nutritivas
complementarias para que el medio pueda soportar el
crecimiento de los heterótrofos exigentes.
- Medios selectivos: medio con ciertas sustancias químicas
específicas que no permitirán el desarrollo de un grupo de
bacterias, sin inhibir a su vez el crecimiento de otros grupos.
- Medios diferenciales: ciertos reactivos o sustancia químicas
que dan lugar a determinado tipo de crecimiento bacteriano o
cambios para diferenciar las bacterias.
- Medios de prueba: para el ensayo de vitaminas, aminoácidos
y antibióticos se utilizan medios de composición experimental.
También se utiliza este tipo de medio para probar
desinfectantes.
- Medios para recuento: utilizado para el recuento de
microorganismos en una muestra.
- Medios de caracterización bacteriana: para determinar el tipo
de crecimiento producido por los organismos y la capacidad de
la bacteria para producir cambios químicos.
- Medios de mantenimiento: para conservar al microorganismo
durante un elevado tiempo sin dañar su estructura.

Un medio de cultivo ha de estar libre de microorganismos (solo


queremos aquellos que vamos a estudiar). Por ello se debe de utilizar
material y componentes esterilizados.

1.- Técnica de dilución en tubo:

Primero se realizan diferentes diluciones del agente químico. El


mismo volumen de cada dilución se dispensa en tubos estériles. A cada
tubo se le añade la misma cantidad de una suspensión del microorganismo
utilizado como prueba. A determinados intervalos de tiempo se transfiere
una alícuota de cada tubo a otro tubo que contenga medio de cultivo.

Estos tubos inoculados se incuban a la temperatura óptima de


crecimiento del microorganismo utilizado como prueba durante 24 a 48
horas. Al cabo de este tiempo se examina el crecimiento del
microorganismo mediante la aparición de turbidez en el tubo (crecimiento
+) o ausencia de turbidez (crecimiento -). Aquellos tubos que presenten
crecimiento negativo indican la dilución a la cual ese agente químico mata
al microorganismo utilizado como prueba cuando este microorganismo es
expuesto al agente químico durante ese período de tiempo.

2.- Técnica de la placa de agar:

Se inocula una placa que contenga medio de cultivo sólido con el


microorganismo utilizado como prueba. El agente químico se coloca en el
centro de la placa, bien dentro de un cilindro o impregnado en un disco de
papel. Al cabo de 24 a 48 horas se observan zonas de inhibición
(crecimiento -) alrededor del agente químico. Una modificación de esta
técnica es la incorporación del agente químico en el medio de cultivo antes
de verterlo sobre la placa. Una vez solidificado se inocula con el
microorganismo utilizado como prueba, se incuba y se examina el
crecimiento microbiano.

3.- Técnica del coeficiente fenólico:

Es una técnica estandarizada que se utiliza para comparar el poder


desinfectante de un agente químico frente al del fenol. Es una modificación
de la técnica de dilución en tubo tal como se describe a continuación: (i)
Se prepara una serie de tubos conteniendo cada uno 5 ml de diferentes
diluciones del desinfectante. (ii) A la vez se prepara una segunda serie de
tubos que contengan diferentes diluciones de fenol. (iii) Cada tubo de las
dos series se inocula con 0,5 ml de un cultivo de 24 horas del
microorganismo utilizado como prueba (cepas específicas de Salmonella
typhi o Staphylococcus aureus). (iv) A los 5, 10 y 15 minutos se recoge
una alícuota de cada tubo que se inocula en otro tubo que contenga medio
de cultivo estéril. (v) Estos tubos inoculados se incuban durante 24 a 48
horas y se observa el crecimiento del microorganismo (aparición de
turbidez). (vi) La mayor dilución del desinfectante que mate a los
microorganismos en 10 minutos pero no los mate en 5 minutos se divide
por la dilución mayor de fenol que dé los mismos resultados. El número
obtenido es el coeficiente fenólico de ese desinfectante.

4. TECNOLOGIA PARA EL CONTROL MICROBIOLOGICO

BetzDearborn ha elaborado un sistema para medir de control


microbiológico, denominado BioscanTM2, que consigue eliminar el periodo
de incubación que requieren los métodos de cultivo tradicionales. Funciona
midiendo la luz que se produce cuando los reactivos enzimáticos
reaccionan con el ATP del microorganismo, sustancia que se encuentra en
todas las células vivas. Se dispone de resultados inmediatos en campo
que indican la población microbiológica total de bacterias aeróbicas y
anaeróbicas, hongos, levaduras, algas y protozoos. Como resultado, se
pueden reducir los costes de limpieza y de mantenimiento, disminuir el
número de paros no programados y mejorar considerablemente la
productividad.

VIII.- ANTIBIOTICOS

1.- Determinación del espectro de acción de un antibiótico:

Los antibióticos son una clase especial de agentes


quimioterapeuticos, obtenidos generalmente de organismos vivos. La
palabra antibiótico se refiere a un producto metabólico de un organismo
que es perjudicial o inhibitorio, en muy pequeñas cantidades para otros
microorganismos. Para que un antibiótico sea útil como agente
quimioterapéutico debe reunir las siguientes cualidades:
- Amplio espectro de acción: debe ser capaz de destruir o inhibir
muchas especies de microorganismos patógenos.

- Impedir la aparición rápida de formas resistentes del parásito.

- No debe producir efectos secundarios: reacciones de sensibilidad o


alergia, daño al sistema nervioso o irritación de los riñones y
conducto gastrointestinal son posibles efectos colaterales
indeseables en el huesped.

- No debe eliminar la flora microbiana normal del huesped.

2.- Pruebas de susceptibilidad (antibiograma):


La susceptibilidad de un microorganismo a un antibiótico y a otros agentes
quimicoterapeuticos se determina por las técnicas de dilución en tubo o por
la del disco en placa.
-. Método de disco en placa de agar (difusión en disco):
Este método es el que se usa comúnmente para determinar la
susceptibilidad de los microorganismos a los agentes quimioterapéuticos.
Se colocan pequeños discos de papel impregnados con cantidades
conocidas del agente (disponibles en el comercio) sobre la superficie de
una placa sembrada (cesped bacteriano). Ocurren, pues, dos procesos: el
microorganismo empieza a crecer y el antibiótico difunde, de tal forma que
alrededor del disco hay un gradiente de concentación de antibiótico.
Después de la incubación se examina la placa buscando zonas de
inhibición del desarrollo alrededor de los discos (halo de inhibición). Una
zona de inhibición (área clara) alrededor del disco indica que el organismo
fue inhibido por el agente difundido en el agar desde el disco. El diámetro
del halo nos indica si la bacteria es resistente "R", presenta resistencia
intermedia "I", o es sensible al antibiótico "S".

Factores que influyen en el resultado:

a) Tipo de medio de cultivo: para que no influya, se usa siempre "Agar


Mueller-Hinton". Si hay que suplementar este hay que realizar un control
utilizando una cepa de referencia para ver si el suplemento provoca
cambios. Se prueba con las siguientes cepas de referencia:

Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Pseudomona aeruginosa

Si los halos no son iguales a los definidos, entonces el suplemento está


provocando cambios en el resultado.

b) Volumen del medio de cultivo: el antibiótico no solo difunde en


superficie, sino también en profundidad. Por ello también se estandariza la
altura de cepa de agar, y este es de 4 mm.

c) Carga o concentración de antibiótico en los discos: la cantidad de


antibiótico vendrá expresado en mg o U.I. Los discos han de conservarse
entre 4ºC - 8ºC, y una vez que vayan a ser utilizados hay que dejar que se
estabilicen a temperatura ambiente.

d) Inóculo y siembra: el inóculo también influye (cuantas más bacterias, el


halo será de menor tamaño). El número de células que se deben de poner
en una placa se estandariza mediante la "escala de MacFarland". Se
ajusta la turbidez a 0'5 de escala MF (cuando este número es mayor mas
concetración de sal de bario tiene la escala). En cuanto a la forma de
sembrar: hay que conseguir un cesped homogeneo. Para ello sembramos
pasando un bastoncillo impregnado con la bacteria en primer lugar en un
sentido, se gira 60º y se hacen estrías cruzando las anteriores. Repetimos
el giro y la siembra. Finalmente inoculamos el borde de la placa.
Colocación de los discos: con unas pinzas flameadas con alcohol ponemos
los discos en la placa, procurando ponerlos separados unos de otros y del
borde de la placa. Los discos han de ir sobre el agar (damos un golpe
suave). Pasados 15 minutos invertimos la placa e incubamos.
El método del disco único para cada antibiótico es la prueba de
susceptibilidad recomendada usualmente por la FDA de Estados Unidos
(Administración de alimentos y drogas)

- Técnica de dilución en tubo:

Consiste en lo siguiente: en una serie de tubos que contienen el


medio de cultivo adecuado y sembrados con el organismo que se prueba,
se ponen cantidades crecientes del antibiótico que se estudia. Después de
la incubación se determina la concentración de la droga necesaria para
inhibir el desarrollo del organismo que se prueba por la falta de desarrollo.

3.- Conjugación bacteriana:

La conjugación es un proceso mediante el cual ciertas células


bacterianas transfieren DNA a una segunda célula con la que entran en
contacto. La capacidad para transferir DNA por conjugación depende de la
presencia de una entidad citoplasmática denominada factor de fertilidad o
F. Las células portadoras de F se conocen como F+, y las células que no
contienen F se conocen como F-.
El factor F se trata de un pequeño elemento circular que funciona como un
minicromosoma (contiene aprox. 100 genes). Las células portadoras de F
producen pili ( pilus en singular), que son pequeños túbulos proteicos que
permiten a las células F+ adherirse y mantener contacto con las células F-.
La transferencia del factor F se produce siempre (logicamente) de las
células F+ a las células F-. Existen las denominadas "cepas de alta
frecuencia de recombinación" (Hfr). Esto ocurre cuando, ocasionalmente, F
deja el citoplasma y se integra en el cromosoma de la célula hospedadora.
Los pili o fimbrias son muy lábiles, con lo cual es muy dificil que se
transfiera todo el factor F (que para Escherichia coli requiere un tiempo de
60-90 minutos). Ademas, la transferencia del "cromosoma" se realiza por
un punto concreto de inicio. Por tanto, la distancia y el orden de entrada de
los genes se puede conocer por métodos como conjugación interrumpida
(se recogen muestras a intervalos de tiempo concretos después de realizar
la mezcla) o por frecuencia de recombinación.

4.- Aglutinación bacteriana:

Los anticuerpos son sustancias específicas formadas por el cuerpo


en respuesta a un estímulos antigénico. Quimicamente son proteinas.
Estas se unen especificamente a un antígeno (la sustancia que cuando se
introduce en el cuerpo origina la producción de los anticuerpos), formanto
un entramado o "rejilla" de antígenos y anticuerpos, que son visibles a
simple vista como grumos.

Esta propiedad se utiliza para determinar si un microorganismo


problema es o nó la especie que estamos buscando mediante la aplicación
de anticuerpos específicos para esa especie o, a partir de una especie ya
conocida, determinar si en un suero problema existen o no anticuerpos
específicos para ese microorganismo. La proporción adecuada para que
los grumos sean visibles es la que se señala en la siguiente gráfica como
"región de equivalencia":

Y = Aglutinación
X = [Antígeno]
La reacción de aglutinación se lleva a cabo de la siguiente forma: en un
portaobjetos se ponen dos gotas (5ml) separadas de una suspensión
bacteriana. En una de las gotas se añade 5ml de antisuero, y en la otra,
5ml de PBS (tampón fosfato salino), y mezclamos con un palillo de dientes.
Los resultados posibles son los siguientes:
- Si solo aparecen grumos en la gota con antisuero: la bacteria tiene
el antígeno para ese anticuerpo.
- Si no aparecen grumos en ambas gotas: la bacteria no tiene el
antígeno específico de ese anticuerpo.
- Si aparecen grumos en ambas gotas: la prueba no puede leerse
(los grumos no se forman por la unión antígeno-anticuerpo).

CONTROL DE LAS POBLACIONES MICROBIANAS: ESTERILIZACION


Y DESINFECCION

I.- DEFINICIONES Y CONCEPTOS

II.- MUERTE DE LAS POBLACIONES MICROBIANAS Y CURVAS DE


SUPERVIVENCIA.

III.- CONDICIONES QUE INFLUYEN EN LA ACCION ANTIMICROBIANA

IV.- AGENTES ESTERILIZANTES FISICOS

1.- Altas Temperaturas


A.- Esterilización por calor húmedo
• Autoclave
• Tindalización
• Pasteurización
B.- Esterilización por calor seco
• Horno Pasteur
• Incineración
2.- Bajas Temperaturas
3.- Presion Osmotica
4.- Ondas Ultrasonicas
5.- Radiaciones
A.- Radiaciones ionizantes
B.- Radiaciones no ionizantes

6.- Filtración
A.- Filtros de membrana
B.- Filtros HEPA
7.- Desecación

V.- AGENTES ESTERILIZANTES QUIMICOS


1.- Oxido de etileno
2.- Glutaraldehido

VI.- DESINFECTANTES Y ANTISEPTICOS


A.- Inorgánicos
1.- Metales
2.- Acidos y álcalis
3.- Compuestos inorgánicos oxidantes
4.- Halógenos

B.- Orgánicos
1.- Alcoholes
2.- Fenol y compuestos fenólicos

VII.- ACCION DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS


DESINFECTANTES Y ANTISEPTICOS

1.- Técnica de dilución en tubo


2.- Técnica de la placa de agar
3.- Técnica del coeficiente fenólico

VIII.- ANTIBIOTICOS.
1.- Determinacion del espectro de accion de un antibiotico.
2.- Pruebas de susceptibilidad.
3.- Conjugacion bacteriana.
4.- Aglutinacion bacteriana.

BIBLIOGRAFIA

1. http://www.atl-gestion.com/Asepsia y desinfeccion.htm

2. http://edicion-micro.usal.es/web/educativo/entrada.html

3. http://edicion-micro.usal.es/Web/haccp99/Unidades/CURSO/UNI_04/images/4010201.gif
4. http://www.encolombia.com/orto12398contenido.htm
5. http://edicion-micro.usal.es/web/educativo/micro2/tema08.html#anchor171586
6. http://orbita.starmedia.com/~sohail/micro1.htm