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Editado por:
george concesión,
Universidad de Aberdeen,
Reino Unido
Revisado por:
Mariana Martins Drumond,
Centro Federal de Educación
Tecnológica de Minas Gerais, Brasil
Rajaraman D. Eri,
Universidad de Tasmania, Australia
Luis A. Rubio,
Consejo Superior de Investigaciones
Científicas (CSIC), España
* Correspondencia:
Sang Kee Kang
kangsk01@snu.ac.kr
Chong Su Cho
chocs@snu.ac.kr
†Estos autores han contribuido
igualmente a este trabajo
Sección de especialidad:
Este artículo fue enviado a
Enfermedades infecciosas,
una sección de la revista
Frontiers in Microbiology
Recibió:26 mayo 2021
Aceptado:21 julio 2021
Publicado:12 agosto 2021
Citación:
Hong L, Lee SM, Kim WS,
Choi YJ, Oh SH, Li YL, Choi SH,
Chung DH, Jung E, Kang SK y Cho
CS (2021) Simbióticos que contienen
Nanoprebióticos: una nueva terapéutica
Estrategia para restaurar la disbiosis intestinal.
Frente. Microbiol. 12:715241.
doi: 10.3389/fmicb.2021.715241
Fronteras en Microbiología | www.frontiersin.org
INVESTIGACION ORIGINAL
publicado: 12 de agosto de
2021 doi: 10.3389/fmicb.2021.715241
Simbióticos que contienen
Nanoprebióticos: una nueva estrategia
terapéutica para restaurar la disbiosis intestinal
lin hong1,2†, Sang-Mok Lee2,3†, Whee-Soo Kim2, Yun-Jaie Choi2,4, Seo Ho Oh2, Yu Ling Li
2, Seung Hoon Choi3, Dong Hyen Chung3, Eunkyoung Jung3, Sang-Kee Kang5* y
Chong-Su Cho2,4*
1Laboratorio clave de cría de animales agrícolas y cría saludable de Tianjin, Facultad de ciencia animal y medicina veterinaria,
Universidad agrícola de Tianjin, Tianjin, China,2Departamento de Biotecnología Agrícola, Universidad Nacional de Seúl, Seúl, Corea
del Sur,3Insilico Co., Ltd., Ansan-Si, Corea del Sur,4Instituto de Investigación de Agricultura y Ciencias de la Vida, Universidad
Nacional de Seúl, Seúl, Corea del Sur,5Institutos de Biociencia y Tecnología Verdes, Escuela de Graduados en Tecnología Agrícola
Internacional, Universidad Nacional de Seúl, Pyeongchang, Corea del Sur
Se demostró que una nueva formulación, los nanoprebióticos [p. ej., nanopartículas de ftalil pululano
(PPN)], mejora la actividad antimicrobiana de los probióticos [p. ej.,Lactobacillus plantarum(LP)]in vitroa
través de la estimulación intracelular mejor que la de los prebióticos de la columna vertebral, que se
utilizan comúnmente. En este estudio, nuestro objetivo era investigar si esta combinación ejercería
efectos distintos como simbióticos.en vivo. Se utilizaron combinaciones simbióticas de LP, pululano y PPN
como tratamientos experimentales en un modelo murino inducido por disbiosis, y su efecto restaurador
se evaluó utilizando patógenos.Escherichia coli Desafío K99. Nuestros resultados mostraron que elE. colila
infección se suprimió notablemente en el grupo experimental alimentado con simbióticos que contenían
PPN. Además, la disminución del nivel de endotoxinas séricas después del tratamiento con simbióticos
sugirió un refuerzo de la barrera intestinal. La comparación de los grupos de tratamiento, incluido un
grupo de control normal, mostró que los simbióticos que contienen PPN aumentaron la diversidad
microbiana, que es un parámetro representativo del estado de salud. Además, a diferencia del
tratamiento con probióticos solos, los simbióticos mostraron efectos aditivos de enriquecimiento de
varias bacterias beneficiosas conocidas, comoLactobacillus, Bifidobacteriay otras bacterias productoras de
butirato, incluidasFaecalibacterium. En conjunto, nuestros resultados indican que los simbióticos que
contienen PPN son eficaces para restaurar la disbiosis intestinal, suprimir la infección patógena y
aumentar la diversidad microbiana, lo que sugiere que los simbióticos con nanoprebióticos tienen el
potencial de ser una estrategia novedosa para mejorar la disbiosis intestinal y las enfermedades
infecciosas.
Palabras clave: nanoprebióticos, simbióticos, disbiosis, microbiota intestinal, infección patógena, alimentación cruzada, refuerzo de la barrera
intestinal, endotoxina
INTRODUCCIÓN
Considerada por algunos investigadores como un “órgano olvidado”, la microbiota intestinal ha atraído
considerable atención en los últimos años, dado su profundo efecto sobre la homeostasis del huésped.Espíritu
Santo et al., 2021). De hecho, varios estudios han demostrado que la disbiosis intestinal está altamente asociada
con diversas enfermedades como la enfermedad inflamatoria intestinal, la obesidad y el cáncer.
1 Agosto 2021 | Volumen 12 | Artículo 715241
Hong et al. Simbióticos con nanoprebióticos para la disbiosis

(Guinane y Cotter, 2013;Aron-Wisnewsky et al., 2019;Fan y otros, 2020). Por lo (PPN) se prepararon utilizando pululano y una combinación de simbióticos
tanto, mantener o restaurar la microbiota intestinal en un estado equilibrado es recientemente diseñada (probióticos:Lactobacillus plantarum (LP),
importante para la salud del huésped. La disbiosis suele ser causada por la prebióticos: pululano y PPN) fue tratado en un modelo murino de disbiosis
infección y proliferación de microbios dañinos; por lo tanto, la capacidad de la intestinal inducida por antibióticos. Posteriormente, los efectos de mejora
microbiota intestinal para suprimir su aparición es muy importante para la salud de la disbiosis se evaluaron midiendo la cantidad de patógeno invasor en el
del huésped.Ducatelle y otros, 2015). Para solucionar esto, se están estudiando intestino del huésped y monitoreando las alteraciones en el microbioma
ampliamente varias terapias estratégicas como los probióticos, prebióticos y intestinal y otros cambios fisiológicos del huésped después de la
simbióticos (da Silva et al., 2021). exposición al patógeno.
Según la Organización Mundial de la Salud, la Organización para la
Agricultura y la Alimentación y la Asociación Científica Internacional de
Probióticos y Prebióticos, los probióticos son microorganismos vivos que
RESULTADOS
brindan beneficios para la salud del huésped cuando se administran en
cantidades adecuadas.Akour, 2020;Swanson y otros, 2020). Generalmente
son seguros y pueden prevenir y curar la disbiosis debido a su producción
Síntesis y caracterización de PPN.
El esquema de reacción química del ftalil pululano se muestra en
de péptidos antibacterianos como las bacteriocinas y su capacidad para
Figura 1A. Siguiendo el mismo método que se informó
mejorar las funciones de la barrera intestinal.Ohland y Macnaughton, 2010;
anteriormente, el contenido de grupos ftalato en ftalil pululano se
Daba y Elkhateeb, 2020;Liu y otros, 2020). En el caso de los prebióticos,
confirmó mediante1Medición de espectroscopía de resonancia
estimulan el crecimiento de probióticos u otros microorganismos benéficos
magnética nuclear (RMN) de H y se estimó determinando la
en el tracto gastrointestinal, disminuyendo los patógenos y brindando
proporción de protones de ácido ftálico a protones de azúcar (Hong et
efectos favorables al huésped (Wang S. y otros, 2020). Los simbióticos, una
al., 2019). La observación bajo un microscopio electrónico de barrido
combinación de probióticos y prebióticos, también están diseñados para
indicó que las morfologías de las PPN eran esféricas como se muestra
producir un efecto sinérgico en la supresión de patógenos (Zheng y otros,
enFigura 1B. La internalización de las PPN se confirmó mediante
2021). En particular, se han propuesto varios mecanismos de los
microscopía de barrido láser confocal. Como se muestra enFigura 1C,
simbióticos, como mejorar la viabilidad o funcionalidad de los probióticos
las PPN se internalizaron en LP.
en el tracto gastrointestinal mediante la utilización selectiva de sus socios
Para examinar cualquier cambio interno en LP causado por
simbióticos (p. ej., prebióticos) (Swanson y otros, 2020). Además, existe el
PPN, LP se trató con PPN o pululano y sus ácidos grasos de
concepto de que los simbióticos pueden ser simbióticos complementarios,
cadena corta (SFCA) comúnmente secretados, como el acetato
en los que cada componente funciona de forma independiente, aunque
(C2) (Figura complementaria 1A), propionato (C3) (Figura
todos apuntan a producir beneficios para el huésped y facilitar que la
complementaria 1B), y butirato (C4) (Figura complementaria 1C
microbiota intestinal controle los patógenos fortaleciendo su capacidad
), fueron analizados in vitro. Se encontró que la cantidad total de
antimicrobiana.
AGCC (mM) en el medio de cultivo de LP (61,70±0,36) cambió en
menor medida cuando se trataron NPP (63,46±0,51) que cuando
Nuestros estudios anteriores demostraron que los nanoprebióticos
se trató con pululano (70,32±0,93) (Figura 1D).
(NP), cuyos pilares eran la inulina, el dextrano, el almidón y el pululano,
Las actividades antimicrobianas del LP internalizado por PPN
aumentaban la capacidad antimicrobiana de los probióticos.in vitro(Kim y
contra patógenos.Escherichia coli(Figura 1E) yListeria monocytogenes
otros, 2018, 2019;Hong et al., 2019, 2020). Mejoraron la expresión de genes
(LM) (Figura 1F) fueron evaluados mediante el ensayo de cocultivo
biosintéticos de bacteriocina y activaron el sistema de defensa de los
(UFC/ml×104) y prueba de difusión en agar (mm). EnE. coli, los
probióticos mediante la internalización dentro de los probióticos. Los
resultados del ensayo de cocultivo (E. coli: 90,33±2,31, LP: 59,67±3,21,
probióticos mostraron una actividad antimicrobiana extremadamente alta
LP/P: 61,00±1,73 y LP/PPN: 40,67±1,53) y prueba de difusión en agar
contra patógenos grampositivos y gramnegativos cuando se trataron con
(LP: 1,98±0,02, LP/P: 2,02±0,02 y LP/PPN: 2,48±0,03) mostró una
NP. En el caso del dextrano, unen vivo Se realizó un experimento de
capacidad antibacteriana distinguida en los grupos tratados con PPN.
alimentación en un modelo de ratón normal para investigar los efectos
Asimismo, se observaron patrones similares tanto en el ensayo de
sobre la microbiota intestinal cuando se alimenta con NP y su compañero
cocultivo (LM: 161,67±12,58 LP: 99,67±10,50, LP/P: 103,00±6,08 y LP/
probiótico (Kim y otros, 2019). Aunque la PDN se probó sólo en condiciones
PPN: 46,00±2,65) y prueba de difusión en agar (LP: 1,80±0,02, LP/P:
de eubiosis, el estudio implicó que los simbióticos con NP tenían el
1,81±0,02 y LP/PPN: 2,21±0,02) utilizando LM como patógeno. Ambos
potencial de ser medicamentos preventivos contra la disbiosis intestinal.
casos mostraron que la actividad antimicrobiana del LP internalizado
Sin embargo, aún no se han investigado sus efectos en condiciones de
con PPN era mucho mayor que la del LP no tratado o el del pululano
disbiosis. Además, el estudio anterior no investigó los efectos de los
solo.
simbióticos que comprenden una forma mixta de columna vertebral de
prebióticos y NP juntos como componentes de simbióticos, aunque los
simbióticos que utilizan NP mostraron distintos beneficios en comparación Cambios fisiológicos en el huésped
con el caso de la columna vertebral para los socios simbióticos. Como se muestra enFigura 2A, el experimento de alimentación del ratón
se realizó para evaluar el efecto de los simbióticos contra la disbiosis. La
En este estudio, nuestro objetivo fue determinar si los simbióticos eficacia del tratamiento con antibióticos para imitar la disbiosis.
que contienen NP son efectivos para recuperarse de la disbiosis en
términos de restaurar la barrera intestinal y suprimir la infección
patógena. En consecuencia, las nanopartículas de ftalil pululano 1http://picrust.github.io/picrust/

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FIGURA 1 |Síntesis y caracterización de PPN. Esquema de reacción química para la síntesis de PPN (A).Las morfologías de las PPN se observaron mediante microscopía electrónica de barrido
(SEM; aumento: 100,00 k, barra de escala = 200 nm) (B).Análisis de la internalización de PPN en LP observada mediante microscopía de barrido láser confocal (CLSM) (C).La suma de la cantidad
de SFCA cuando se cultivaron probióticos LP solos (LP) o tratados con pululano (LP/P) o PPN (LP/PPN) se midió mediante cromatografía de gases (D).Actividad antimicrobiana de los probióticos
LP cuando se tratan con pululano (LP/P) o PPN (LP/PPN) contraEscherichia coli(CE) (MI)y LM (F).ANOVA unidireccional con Tukeypost-hocSe utilizó una prueba para determinar diferencias
significativas entre los grupos. Diferentes letras en superíndice indican significación estadística (pag <0,05).

se determinó por el grado de disminución de las colonias en el agar Luria-
Bertani (LB) en comparación con el grupo tratado con solución salina (
Figura complementaria 2).
El mayor cambio de peso corporal (g) al final del experimento
de alimentación se observó en el grupo T5 (1,38±1,01), que fue
suplementado con la combinación LP/P/PPN, mientras que el
peso corporal del grupo T1 (0,05±0,58) disminuyó en el punto
final (Figura 2B; C: 0,65±0,24; T2: 0,38±0,52; T3: 0,22±0,82; y T4:
0,70±0,81). Los valores promedio de consumo de alimento por
ratón fueron numéricamente más altos en los grupos
suplementados con PPN (T4 y T5) que en los otros grupos (Figura
complementaria 3).
También hubo cambios significativos en la longitud del colon (cm) y el
peso del ciego (g) con el tratamiento con pro/simbióticos. El grupo T4 (9,43
±0,40) tuvieron la longitud de colon más larga, y todos los grupos
suplementados con pro/simbióticos tuvieron longitudes similares a esa
del grupo C (8,92±0,33) y tenía una longitud de colon más
larga que la del grupo T1 (8,03±0,62) (Figura 2C; T2: 8,93±
0,76, T3: 9,12±0,26 y T5: 9,36±0,41;Figura 2E), mostrando que
el patrón fue similar al observado en el peso corporal.
Asimismo, sólo se observó un aumento notorio en los pesos
del ciego en el T1 (451,17±51.30) grupo, a quien sólo
E. colise administró, mientras que los otros grupos se
alimentaron con probióticos o simbióticos, especialmente el T3
(238,17±35,74) y T5 (240,80±34.13), mostraron pesos ciegos bajos
similares al del grupo C (Figura 2D).
Para evaluar la restauración de la barrera intestinal mediante pro-/
sibióticos, se midieron los niveles de endotoxina sérica (UE/ml). El
grupo T1 (4,93±2.36) alimentado sólo conE. colimostró el valor más
alto, mientras que los niveles fueron significativamente más bajos en
el T4 (0,88±0,66) y T5 (1,24±0,92) grupos alimentados con LP/PPN y LP/
P/PPN, respectivamente (Figura 2F; C: 1,35±1,04; T2: 2,85±2,17; y T3:

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FIGURA 2 |En vivoCalendario de experimentos y cambios fisiológicos de ratones inducidos por disbiosis sobre pro/sibióticos después de un patógeno.Escherichia coliinfección. Calendario de
experimentos e información del grupo (A).El peso corporal individual cambia desde el inicio hasta el final del período experimental en cada grupo (B).Longitud de dos puntos (C)y peso del
ciego (D)se midieron al final del experimento, y su imagen representativa después de la disección (MI).El nivel de endotoxina sérica (LPS) por grupo se midió utilizando muestras de suero (F).
ANOVA unidireccional con Tukeypost-hocSe utilizó una prueba para determinar diferencias significativas entre los grupos. Diferentes letras en superíndice indican significación estadística (pag
<0,05).

2.47±1.81). Asimismo, con la inyección de isocianato de fluoresceína grupo (1,69±0,57) mostró el nivel más alto de FITC-dextrano en suero,
(FITC)-dextrano (µg/ml) en el intestino de ratones para determinar la mientras que se observaron niveles significativamente más bajos en los
permeabilidad intestinal, se observó una tendencia similar; la T1 grupos alimentados con simbióticos, incluido T4 (0,59±0,40) y T5

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Hong et al.
(0,50±0,20) (Figura complementaria 4; C: 0,75±0,26; T2:
1,04±0,33; y T3: 0,61±0,29).
Efectos de los simbióticos sobre la
microbiota intestinal
Para determinar los efectos de las PPN en la microbiota intestinal, se
realizaron análisis independientes y dependientes del cultivo
utilizando el contenido intestinal y su ADN genómico (ADNg).
Primero, células viables (log10UFC/mg) de bacterias coliformes,
incluidasE. coliy las bacterias del ácido láctico (LAB) se enumeraron
colocando el contenido intestinal en agar MacConkey y agar De Man,
Rogosa y Sharpe (MRS), respectivamente. El valor logarítmico medio
de bacterias coliformes viables del grupo T1 (6,32±0,15) era
aproximadamente 6 log10, mientras que el de los otros grupos
tratados con pro-/simbióticos (T2: 4,47±0,31, T3: 4,47±0,57,
T4: 3,18±0,46 y T5: 3,28±0,295) fueron Firmicutes significativamente más bajos, (Figura 3A).
Curiosamente, los grupos de espiroquetas tratados con PPN (T4 y T5) mostraron una
disminución significativa de bacterias coliformes en comparación con
que en los grupos T2 y T3, aunque no tanto como en el grupo
C (1,88±0,52).
En contraste, las cantidades de LAB en los grupos tendieron a ser
contrarias a los resultados para coliformes. El valor logarítmico medio de la
cantidad de LAB para el grupo T1 (2,62±0,30) fue significativamente el más
bajo entre los grupos, mientras que los valores de los grupos pro/
sinbióticos (T2: 5,13±0,43, T3: 5,95±0,25, T4: 5,20±0,40 y T5: 5,18±0,31)
fueron todos significativamente más altos (Figura 3B). Además, los valores
de esos grupos aumentaron significativamente en comparación con los del
grupo C (3,73±0,38).
Para verificar los resultados del análisis dependiente del
cultivo e investigar los cambios generales en la comunidad
microbiana intestinal mediante pro-sinbióticos, se realizaron
análisis basados en ADNg, como la reacción en cadena de la
polimerasa cuantitativa (qPCR) y la secuenciación del ARNr 16S
utilizando cebadores específicos de cada especie. (Tabla
complementaria 1). Con qPCR (cambio de veces), se observaron
resultados similares en los niveles de enteropatógenos.E. coli(
intimín) (Figura complementaria 5A; C: 1,10±0,10, T1: 662,67±
217,49, T2: 4,17±0,15, T3: 4,98±0,94, T4: 2,78±0,64 y T5: 3,07±0,45)
y LAB, especialmentelactobaciloespecies (Figura
complementaria 5B; C: 1,09±0,10, T1: 0,52±0,03, T2: 4,63±0,50,
T3: 20,98±5,05, T4: 9,48±0,72 y T5: 11,50±1.44) ybifidobacteria
especies (Figura complementaria 5C; C: 1,44±0,41, T1: 1,35±0,43,
T2: 2,93±0,73, T3: 3,40±0,27, T4: 6,57±0,50 y T5: 4,07±0,15).
A continuación, se exploró la dinámica de la comunidad microbiana
basándose en la secuenciación del ARNr 16S. Las unidades taxonómicas
operativas (OTU) observadas, un índice de riqueza microbiana, fueron altas
en el orden de T1, C, T2, T3, T4 y T5 (Figura 3C). Otros índices de diversidad
alfa como el de Shannon (índice de diversidad;Figura complementaria 6A;
C: 5,72±0,27, T1: 3,02±0,45, T2: 5,53±0,52, T3: 6,73±0,19, T4:
6.63±0,24 y T5: 6,88±0,52) y Simpson (índice de uniformidad; Figura
complementaria 6B; C: 0,94±0,01, T1: 0,70±0,09, T2: 0,91±0,03, T3:
0,97±0,01, T4: 0,97±0,01 y T5: 0,97±0,02) tuvieron patrones similares
en los que el valor más bajo se observó comúnmente en T1 y el más
alto en T5. Para examinar el efecto de los PPN como socios simbióticos
sobre la riqueza microbiana, los grupos se reorganizaron mediante
tratamiento con PPN (C, T1, T2, T3 frente a T4, T5).
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Simbióticos con nanoprebióticos para la disbiosis
Curiosamente, las OTU observadas fueron altas cuando se trataron con
PPN (Figura complementaria 6C).
El análisis de coordenadas principales (PCoA) se realizó basándose en
datos no ponderados (Figura 3D;R2= 0,28,pag <0,001) y ponderado (Figura
3E;R2= 0,85,pag <0.0001) Distancias UniFrac y el test de Adonis. Los
resultados, especialmente en las distancias ponderadas de UniFrac,
revelaron que la microbiota intestinal se vio alterada por el tratamiento con
simbióticos. En el gráfico de PCoA, las muestras se agruparon en tres
grupos distintos (C frente a T1 frente a T2, T3, T4 y T5). Las muestras de T2,
T3, T4 y T5 se colocaron entre las muestras C y T1, cada una de las cuales
también se distinguió de la otra.
A continuación, se comparó la abundancia relativa de taxones
microbianos en cada grupo y se encontró que varios filos y géneros
parecían estar en niveles bastante diferentes. A nivel de filo, todos los
grupos compartían los siguientes 13 filos: Actinobacteria,
Bacteroidetes, Cyanobacteria, Deferribacteres, Euryarchaeota,
fusobacterias, lentisferae, proteobacterias,
TM7, Tenerife, y
verrucomicrobia
(Tabla complementaria 2). Los tres filos dominantes, que
contienen más del 95% del total de las secuencias del gen 16S
rRNA, fueron Bacteroidetes, Firmicutes y Proteobacteria en los
grupos C y T1, mientras que en los grupos T2, T3, T4 y T5, fueron
Bacteroidetes, Firmicutes. , y Tenerife (Figura 3F). En particular,
las proteobacterias fueron más abundantes en el grupo T1 que en
el grupo C, mientras que se redujeron significativamente en los
grupos T2, T3, T4 y T5 (Figura complementaria 7).
A nivel de género, la microbiota intestinal de los seis grupos
compartió 102 géneros (Tabla complementaria 2). Tres géneros
dominantes que contenían más del 55% del total de secuencias
del gen 16S rRNA eran (1) grupo C: un género no clasificado de la
familia T24-7,Helicobacter, yOdoribacter; (2) grupo T1: géneros no
clasificados de las familias Enterobacteriaceae,
Erysipelotrichaceae y Lachnospiraceae; (3) grupo T2:oscilospira,
géneros no clasificados de las familias Lachnospiraceae y
Rikenellaceae; (4) grupos T3 y T4:oscilospira, un género no
clasificado de cada una de las familias Lachnospiraceae y
Ruminococcaceae; y (5) grupo T5: géneros no clasificados de las
familias Lachnospiraceae, Rikenellaceae y Ruminococcaceae (
Figura complementaria 8A). En particular,lactobacilofue más
abundante en T4 y T5 que en otros grupos (Figura
complementaria 8B). Asimismo,bifidobacteriafue
significativamente más abundante en T4 alimentado con LP/PPN
que en los otros grupos, lo cual es similar a los resultados de
qPCR (Figura complementaria 8C). Además,Faecalibacteriumy el
género no clasificado de la familia Veillonellaceae mostró una
abundancia significativamente mayor en el grupo T5 que en los
otros grupos (Figuras complementarias 8D,E).
En conjunto, la suplementación con simbióticos, especialmente LP/
PPN o LP/P/PPN, moduló la microbiota intestinal al aumentar la
riqueza y diversidad microbiana. Al mismo tiempo, las abundancias
relativas de varias bacterias diferían entre los grupos.
Efectos previstos de los simbióticos en el
metagenoma intestinal
Para predecir las funciones del metagenoma intestinal de cada grupo,
se utilizan las abundancias de la Enciclopedia de Genes de Kyoto.
5 Agosto 2021 | Volumen 12 | Artículo 715241
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FIGURA 3 |Efectos de los pro/sibióticos sobre la microbiota intestinal del modelo de disbiosis murina con patógenoEscherichia coliinfección. Los recuentos de células viables de bacterias
coliformes (A)y laboratorio (B)se enumeraron colocando en placas contenidos intestinales diluidos en serie 10 veces (concentración original: 10 mg de contenido intestinal/1 ml de PBS) en
agar MacConkey y agar MRS, respectivamente. Se utilizó el software QIIME versión 1.9.1 para investigar índices de diversidad alfa, como la riqueza microbiana (OTU observadas) por grupo
(C),Gráfico PCoA basado en no ponderado (D),y ponderado (MI)distancias UniFrac y las composiciones generales de la microbiota intestinal a nivel de filo (F).ANOVA unidireccional con
Tukeypost-hocSe utilizó una prueba para determinar diferencias significativas entre los grupos. Diferentes letras en superíndice indican significación estadística (pag <0,05).

y las vías del genoma (KEGG) se predijeron utilizando el software DISCUSIÓN

PICRUSt, y la precisión de la predicción se evaluó utilizando la
puntuación del Índice de taxón secuenciado más cercano (NSTI).
Las puntuaciones promedio de NSTI de C, T1, T2, T3, T4 y T5
fueron 0,18 (±0,02), 0,07 (±0,03), 0,12 (±0,01), 0,17 (±0,01), 0,15 (±
0,01) y 0,15 (±0,01), respectivamente, que fueron similares a los
informados en otros estudios de microbiota de mamíferos (
Langille et al., 2013;Kieler y otros, 2019). Posteriormente, se
realizó un análisis del tamaño del efecto (LEfSe) del análisis
discriminante lineal (LDA) para determinar las vías de KEGG cuyas
abundancias eran diferentes entre los grupos.
El efecto de los simbióticos en las vías KEGG se predijo
comparando los grupos T1 y T5. Se encontró que se identificaron
varias vías KEGG significativamente diferentes entre los dos grupos (
Figura 4A). Por ejemplo, “metabolismo”, “metabolismo de
aminoácidos”, “replicación y reparación” y “procesos celulares” se
predijeron en niveles significativamente más altos en el grupo T5,
mientras que “enfermedades infecciosas”, “biosíntesis de
lipopolisacáridos”, “sistema de secreción bacteriana” ” y “transporte de
membrana” se predijeron en niveles significativamente más altos en el
grupo T1. Un resultado similar se observó al comparar T1 con T4 (
Figura complementaria 9A).
El efecto de las PPN en el microbioma intestinal también se
predijo comparando los grupos T2 y T4 (Figura 4B). Entre los
dos, el grupo T4 mostró niveles más altos de "transporte de
membrana", "transportadores", "transportadores ABC"
“metabolismo de carbohidratos”, “factores de transcripción” y propionato (µMETRO;Figura complementaria 1B; LP: 98,67±2.08,
"transcripción", mientras que el grupo T2 mostró niveles más altos LP/P: 1683,67±95.82 y LP/PPN: 766.00±18.33) y butirato (µ
para “biosíntesis de lipopolisacáridos”, “canales iónicos de poros”,
“clasificación y degradación de plegamiento” y “biosíntesis y metabolismo
de glucanos”.
En este estudio, informamos la perturbación en la microbiota intestinal y la
fisiología del huésped asociada con la suplementación durante 2 semanas
con simbióticos, incluidos los PPN. A diferencia del caso de PDN (NP cuya
columna vertebral era el dextrano;Kim y otros, 2019) en el estudio anterior,
que se realizó en condiciones de eubiosis, se administraron simbióticos,
incluidos PPN, a unen vivoModelo murino de disbiosis inducida por
antibióticos. Además, el pululano también se utilizó como socio simbiótico
para investigar si podría proporcionar beneficios aditivos para la salud del
huésped. Posteriormente, se evaluó la capacidad de estos pro-/sibióticos
para restaurar el intestino de la disbiosis y mejorar la susceptibilidad
contra los patógenos mediante la eficacia con la que suprimían la infección
del patógeno EC.
Primero, se prepararon y examinaron PPN para determinar su
capacidad para aumentar la capacidad antimicrobiana de LP.in vitro
como se describe en un estudio anterior (Hong et al., 2019). Además,
se observó que el LP puede fermentar el pululano para producir SCFA,
que son cruciales para la salud intestinal. Especialmente, el butirato es
bien conocido por regular la función de la barrera intestinal, y se ha
demostrado el papel del propionato en el alivio de la disfunción
intestinal inducida por el sulfato de dextrano sódico.Tong y otros,
2016; Bach Knudsen y otros, 2018). En comparación con LP solo,
cuando se trató con PPN, aunque no hubo un aumento significativo
en el nivel de acetato (mM;Figura complementaria 1A; LP: 61,60±
0,36, LP/P: 67,37±0,81 y LP/PPN: 61,70±0,44), los niveles de
METRO;Figura complementaria 1C; LP: no detectado, LP/P:
1268,33±56.59 y LP/PPN: 993.67±102,71) aumentaron
ligeramente. Sin embargo, si se compara con los resultados

Fronteras en Microbiología | www.frontiersin.org 6 Agosto 2021 | Volumen 12 | Artículo 715241

Hong et al.
FIGURA 4 |Predicción metagenómica de la microbiota intestinal de ratones inducidos por disbiosis sobre pro/sibióticos después de un patógenoEscherichia coliinfección. Las funciones
microbianas se predijeron utilizando PICRUSt en el tercer nivel de la vía KEGG. El análisis LEfSe se representó como un histograma que determina el efecto LP/P/PPN de los simbióticos
(puntuación LDA>3.0) (A)y efecto NP PPN (puntuación LDA>3.0) (B).
de LP/P, en LP/PPN, todos los valores de SCFA (acetato, propionato y
butirato) fueron significativamente bajos. Esto implicaba que los PPN
podrían funcionar como partículas cuando se internalizan en probióticos,
no como fuentes de carbono para la fermentación microbiana.
Además, hubo cambios significativos en la riqueza microbiana, la
diversidad y la composición intestinal, y mejoras en los índices fisiológicos
del huésped después del ensayo de suplementación con simbióticos, que
respaldaron el efecto de restauración de la disbiosis de los simbióticos. Los
aumentos en el peso corporal y el consumo de alimento de los simbióticos,
especialmente con LP/PPN y LP/P/PPN, mostraron la capacidad de los
simbióticos para recuperar la actividad supresora de patógenos de la
microbiota intestinal, ya que las pérdidas de peso y apetito son signos
comunes de inflamación. desencadenado por patógenosE. coli(colina
verde, 2016). Estos resultados sugieren que los simbióticos que contienen
PPN pueden prevenir la pérdida de peso y la inflamación intestinal
provocadas por una infección patógena. Además, la longitud del colon y el
peso del ciego se utilizan normalmente para determinar si el intestino se
encuentra en un estado anormal, ya que son los principales reservorios de
microbios intestinales. Se informó que el colon se acortó cuando fue
dañado por invasión de patógenos o inflamación (Kajiya y otros, 2009). En
el caso del ciego, su inflamación se observó en ratones a los que se les
administraron antibióticos y similar a la observada en el caso de ratones
libres de gérmenes (Okada y otros, 1994;Nameda y otros, 2007). En este
estudio,E. coliLa infección indujo disminuciones en la longitud del colon y
aumentos en el peso del ciego, que fueron ambos
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Simbióticos con nanoprebióticos para la disbiosis
restaurado al estado normal mediante tratamiento simbiótico. Estos resultados
sugieren que los simbióticos con NP pueden desempeñar un papel importante
en la mejora de la alteración intestinal mediante el fortalecimiento de la barrera
intestinal. De hecho, la permeabilidad intestinal mejoró ya que la entrada de
endotoxinas a la circulación sanguínea fue limitada por la suplementación con
simbióticos, especialmente LP/PPN y LP/P/PPN. Como se sabe ampliamente que
las endotoxinas provocan endotoxemia, causando inflamación y diversas
enfermedades, este resultado implica que los simbióticos, incluidas las NP,
pueden tener el potencial de ser nuevas terapias para tratar la endotoxemia o
sus enfermedades asociadas.Espina, 2001;Moludi y otros, 2020).
En términos del microbioma, hubo varios hallazgos interesantes que
sugieren que los simbióticos también pueden ser útiles para reconstruir la
microbiota intestinal alterada. En particular, se monitoreó el recuento de
células viables de los patógenos desafiados para determinar el grado de
solidez de la recuperación intestinal mediante pro-simbióticos. Como era
de esperar, los simbióticos con NP mostraron una capacidad distinguida
para inhibir más patógenos en comparación con los probióticos solos o los
simbióticos sin NP. Además, los simbióticos aumentaron la cantidad de
bacterias beneficiosas como las BAL en el intestino. Los resultados de los
niveles de expresión génica que detectan enteropatógenos.E. coli(por
ejemplo, intimina),lactobacilospp., ybifidobacteriaspp., mediante qPCR de
ADNg bacteriano utilizando contenidos intestinales mostró resultados
similares a los de sus contrapartes de recuentos de células viables, lo que
respalda que los simbióticos pueden proporcionar los beneficios de ambos.
7 Agosto 2021 | Volumen 12 | Artículo 715241
Hong et al.
suprimiendo patógenos y promoviendo bacterias beneficiosas comensales.
Además, los simbióticos influyeron en los cambios no sólo en ciertas especies
sino también en las comunidades microbianas generales de la microbiota
intestinal. Numerosos estudios han demostrado que la diversidad de la
microbiota intestinal es una de las principales características del estado de salud
y de la salud del huésped.Backhed et al., 2012;Claesson y otros, 2012;Jacouton et
al., 2017). En este estudio, los índices de diversidad alfa como el índice de
Shannon (Figura complementaria 6A), índice de Simpson (Figura
complementaria 6B), y OTU observadas (Figura complementaria 6C) fueron
consistentemente los más altos en la microbiota de los grupos tratados con
simbióticos LP/P/PPN, mientras que fue el más bajo en el grupo que solo estaba
infectado con el patógeno. De acuerdo con los resultados de estudios anteriores,
los resultados de los índices de diversidad alfa obtenidos en este estudio
respaldan que los simbióticos que contienen NP pueden estar funcionando para
mantener la microbiota intestinal en el estado normal contra la disbiosis. En el
gráfico de PCoA basado en distancias ponderadas de UniFrac, se observaron
grupos distintos con infección por patógenos y tratamiento con pro/simbióticos.
Teniendo en cuenta estos resultados, se puede observar que los simbióticos con
NP provocan un cambio aparente en la microbiota intestinal de manera positiva,
lo que compensa los efectos adversos de la disbiosis y la invasión de patógenos,
e incluso una mejora en índices clave superiores a los observados en condiciones
normales. estado.
Además de los patógenos invasores externos, existen numerosas
bacterias comensales con patogenicidad oportunista ya distribuidas
en el intestino.Bhat y otros, 2019). Por ejemplo, las proteobacterias,
que disminuyeron significativamente cuando se trataron con
simbióticos, son el filo que contiene muchas bacterias que provocan
enfermedades, como lasescherichia,vibrio,Helicobacter, ySalmonela(
Litvak y otros, 2017). como el patógenoE. coli utilizado en este estudio
también es una de las especies que pertenece a Proteobacteria, la
disminución en la abundancia relativa de este filo por el tratamiento
con simbióticos sugiere que los simbióticos pueden haber restringido
el crecimiento excesivo de patógenos en el intestino.
A nivel de género, varios géneros también se vieron afectados por el
tratamiento simbiótico (Figura complementaria 8;Tabla complementaria
2). Curiosamente, a diferencia del tratamiento con probióticos solos, el
pululano y los PPN mostraron efectos aditivos al enriquecer varias
bacterias beneficiosas comensales. Por ejemplo, las abundancias relativas
de amboslactobacilo(Figura complementaria 8B) ybifidobacteria(Figura
complementaria 8C), que se utilizan ampliamente debido a sus
propiedades probióticas, aumentaron en la microbiota, lo que
correspondió a los resultados de qPCR (Suez y otros, 2020). Además, la
abundancia relativa de varias bacterias productoras de butirato, como
Faecalibacterium (Figura complementaria 8D), el género no clasificado de
la familia Veillonellaceae (Figura complementaria 8E),coprócoco, y
ruminococoaumentaron cuando se trataron con simbióticos,
especialmente LP/P/PPN (Tabla complementaria 2). Estas bacterias han
atraído la atención debido a su distinguida capacidad para producir
butirato, que desempeña funciones importantes en la homeostasis
intestinal, incluida la fuente de energía para los colonocitos y factores
inmunomoduladores.Zeng y otros, 2019). En particular, FaecalibacteriumSe
ha informado como un biomarcador representativo de la microbiota
saludable (Cheema, 2019). Uno de los géneros de la familia Veillonellaceae,
veillonella, fue reportado por su abundancia en un estado físicamente
activo (Scheiman y otros, 2019). Asimismo,
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Simbióticos con nanoprebióticos para la disbiosis
coprócocoyruminococofueron reportadas como bacterias beneficiosas
debido a su efecto anticancerígeno contra el cáncer de colon y niveles
reducidos en diversas enfermedades relacionadas con la microbiota, como
la enfermedad inflamatoria intestinal, respectivamente (Nagao-Kitamoto y
Kamada, 2017;Ai y otros, 2019).
Según el análisis PICRUSt, se observaron varias diferencias
significativas, aunque los hallazgos deben interpretarse con cautela. En
ratones alimentados con los simbióticos LP/PPN o LP/P/PPN, los genes
relacionados con el metabolismo de los nutrientes y los procesos celulares
normales eran prevalentes, mientras que las vías de invasión bacteriana y
las enfermedades asociadas eran escasas. Además, también se predijo que
el gen relacionado con la biosíntesis de lipopolisacáridos (LPS) estaría
regulado positivamente porE. coliinfección. Además, hubo diferencias
funcionales intrigantes cuando las NP (PPN) funcionaron como socios
simbióticos. Por ejemplo, en comparación con los probióticos solos, cuando
se trataba con NP, las vías que representan el transporte o la transcripción
de la membrana estaban reguladas al alza, mientras que la vía para la
biosíntesis de LPS estaba regulada a la baja. Además, a diferencia de
cuando se utiliza el polímero principal (pululano) como prebiótico, las NP
regulan positivamente las vías que representan la síntesis de glucanos y el
metabolismo de diversos carbohidratos. Estos resultados sugieren que los
simbióticos con NP pueden recuperar la microbiota intestinal del daño
principalmente promoviendo el metabolismo de varios nutrientes e
inhibiendo la biosíntesis de LPS. En particular, considerando que en este
estudio se observó una disminución en los niveles de endotoxinas (LPS) con
el tratamiento con simbióticos, el resultado puede ser consistente con la
hipótesis sobre el efecto supresor de la biosíntesis de LPS de los
simbióticos, aunque más en vivoSe requieren estudios porque hasta la
fecha no se ha demostrado que esto sea una relación de causa y efecto.
Como el LPS es un componente representativo de las endotoxinas que
se originan en bacterias gramnegativas comoproteobacterias, decidimos
examinar si había bacterias cuya abundancia relativa en el intestino se
correlacionaba con los niveles de endotoxinas séricas (Figura
complementaria 10;Rizzatti y otros, 2017). Como era de esperar,
proteobacterias(r=0,45,pag=0,007;Figura complementaria 10A) fue el
único filo que se correlacionó positivamente con el nivel de endotoxinas
séricas, aunque ningún filo mostró una correlación negativa. Además,
varios géneros comocronobacter (r=0,62,pag <0,001;Figura
complementaria 10B), género no clasificado de la familia
Enterobacteriaceae (r=0,60,pag <0,001; Figura complementaria 10C),
enterobacteria(r=0,59,pag <0,001; Figura complementaria 10D), y
Estreptococo(r=0,49, pag=0,003;Figura complementaria 10E) se
correlacionaron positivamente. cronobacterSe sabe que provoca
enfermedades graves como enterocolitis necrotizante, meningitis y
septicemia en personas con un intestino vulnerable, incluidos recién
nacidos, bebés y ancianos.Holý y Forsythe, 2014).Estreptococoestá
ampliamente estudiado como un patógeno que provoca diversas
enfermedades (Wu y otros, 2014). Varios géneros que pertenecen a la
familia Enterobacteriaceae, incluidos enterobacteria, son considerados
patógenos fatales debido a su resistencia a los antibióticos y su relación
con enfermedades (Davin-Regli et al., 2019). Sin embargo, bacterias
beneficiosas comolactobacilo (r= -0,34,pag=0,046) (Figura
complementaria 10F), que aumentó con los simbióticos, se correlacionó
negativamente con el nivel de endotoxinas séricas. Por lo tanto, es
probable que los simbióticos LP/P/PPN modulasen la microbiota intestinal
inhibiendo principalmente la producción de LPS.
8 Agosto 2021 | Volumen 12 | Artículo 715241
Hong et al.
bacterias, contribuyendo así a aliviar la entrada de endotoxinas en el
sistema circulatorio del huésped.
En general, los hallazgos tanto microbiológicos como fisiológicos sugieren
que una nueva forma de simbióticos que contienen NP tiene efectos distinguidos
en la restauración de la disbiosis, en comparación con los de los probióticos o los
simbióticos solos con polisacáridos principales. Los nuevos simbióticos
demostraron el potencial de inducir el refuerzo de la barrera intestinal mediante
la modulación de la microbiota intestinal, proporcionando en última instancia
beneficios fisiológicos al huésped.
Específicamente, en el caso de la microbiota intestinal, puede ser
posible inhibir eficazmente los patógenos enproteobacteriascomo
bacterias coliformes mediante la administración de probióticos, cuya
expresión de bacteriocina podría verse aumentada por las NP al considerar
la in vitroresultados. Aunque no se han monitoreado los niveles de AGCC
intestinales, los probióticos en sí mismos habrían tenido efectos
adicionales, como la producción de AGCC, al fermentar la columna
vertebral del pululano mientras habitaban el intestino. En particular, un
aumento de butirato, conocido como fuente de nutrientes para los
colonocitos (Fu y otros, 2019), puede promover la proliferación de
colonocitos e inhibir cambios intestinales anormales, como la contracción
del colon y la inflamación del ciego causada por la disbiosis. Además,
diversas interacciones de alimentación cruzada entre probióticos y
microbios intestinales comensales podrían ayudar a recuperar la
homeostasis intestinal. Por ejemplo, la alimentación cruzada entre
lactobaciloybifidobacteria(Moens y otros, 2017), también entre
bifidobacteriay bacterias productoras de butirato (Turroni et al., 2018;Kim y
otros, 2020), Ha sido reportado. Los crecientes niveles debifidobacteriay
diversas bacterias productoras de butirato, comoFaecalibacterium,
Veillonelláceas, coprócoco,oruminococoTambién puede atribuirse a la
administración delactobaciloy su alimentación cruzada. Dado que el
Faecalibacteriumes una de las bacterias más estudiadas, así como un
importante indicador y contribuyente a la salud intestinal (Ferreira-Halder
et al., 2017), su aumento ha apoyado el efecto restaurador de la disbiosis
de los simbióticos. Además, como se ha propuesto que el grupo de
bacterias que utilizan lactato es importante para la estabilidad del sistema
de microbiota intestinal (Wang SP y otros, 2020), un aumento de lactato en
la luz intestinal mediante la administración de LAB también puede haber
mejorado la estabilidad del sistema. De hecho, otros índices
representativos para medir la salud intestinal, como la riqueza, la
uniformidad y la diversidad microbianas, también mostraron que el
sistema microbiano se recuperó a un estado normal.
En conjunto, los nuevos simbióticos pueden suprimir patógenos de manera
más efectiva que los probióticos solos debido a la mejora de la capacidad de
producción de bacteriocinas por parte de las NP y la capacidad de producción de
SCFA por parte del polisacárido principal, al tiempo que fomentan la
alimentación cruzada entre probióticos y diversas bacterias comensales. Como
resultado, los nuevos simbióticos pueden restaurar la composición de la
microbiota intestinal a un estado similar al de la condición de eubiosis. Teniendo
en cuenta varios cambios en los parámetros fisiológicos, se puede inferir que los
efectos de los simbióticos en la dinámica microbiana intestinal pueden reforzar
la barrera intestinal y generar impactos beneficiosos en el huésped. Se ha
demostrado una permeabilidad intestinal reducida mediante niveles reducidos
de LPS y FITC-dextrano circulantes, aunque la expresión de las uniones estrechas
de los colonocitos, como ZO-1 y ocludina, no se controló directamente.
Combinados con los resultados de la predicción del metagenoma que sugieren la
inhibición de la biosíntesis de LPS en el grupo tratado con simbióticos, los
simbióticos pueden
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Simbióticos con nanoprebióticos para la disbiosis
fortalece la barrera intestinal e inhibe la entrada de patrones moleculares
microasociados (MAMP), como el LPS, desde la luz intestinal hasta el sistema de
circulación sistémica del huésped. Por lo tanto, los simbióticos pueden aliviar la
inflamación provocada por MAMP, que actúa como causa de muchas
enfermedades. Además, los resultados de la correlación entre los niveles
circulantes de LPS y la abundancia relativa de cada microbio intestinal revelaron
que la disminución de los niveles circulantes de LPS por los simbióticos puede
inhibir el impacto de patógenos que provocan enfermedades, como
proteobacterias,cronobacter,enterobacteria, y Estreptococo. Finalmente, los
cambios en la microbiota intestinal y el refuerzo resultante de la barrera
intestinal habrían afectado positivamente los parámetros fenotípicos del
huésped. De hecho, varios eventos adversos mediados por patógenos, como la
supresión del aumento de peso corporal, la reducción del colon y la hinchazón
del ciego, se han mejorado mediante la administración de los nuevos
simbióticos. Se necesitan más estudios para aclarar los efectos sobre la
microbiota intestinal y los huéspedes cuando se tratan únicamente con NP sin un
compañero probiótico. Además, para ser utilizado como fármaco para el
microbioma, debería haber un proceso de verificación de que estos nuevos
simbióticos puedan actuar con la misma eficacia que en este estudio en varios
modelos de enfermedades enteropáticas. Sin embargo, los resultados sugieren
que las NP pueden tener el potencial de ser un agente novedoso como socio
simbiótico y, por lo tanto, pueden ser ampliamente aplicables para mejorar la
susceptibilidad a patógenos invasivos y curar enfermedades asociadas con la
disbiosis, como la enfermedad inflamatoria intestinal.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales
El pullulan utilizado en este estudio se adquirió de Shandong
Freda Biotechnology Co., Ltd. (Shandong, China), y otros
productos químicos se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis,
MO, Estados Unidos). Para los cultivos bacterianos, se adquirieron
caldo LB, agar LB, caldo MRS, caldo de infusión de cerebro y
corazón (BHI), agar sorbitol MacConkey y agar Oxford de BD Difco
(Sparks, MD, Estados Unidos).
Producción de SCFA de simbióticos
Para determinar la disponibilidad de SCFA a través de pullulan y PPN
por LP,in vitroSe investigaron los perfiles de SCFA de LP al fermentar
pululano y PPN. La cromatografía de gases se realizó según un
método descrito previamente con una ligera modificación (Erwin y
otros, 1961). Brevemente, se mezcló una alícuota de 5,0 ml de
sobrenadante cultivado con 1,0 ml de ácido metafosfórico al 25 % y
0,2 ml de ácido piválico al 2 % (estándar interno), y la mezcla se analizó
utilizando un sistema de cromatografía de gases Agilent 7890B
(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Estados Unidos) con un
detector de ionización de llama (FID). La temperatura de entrada y
detector se mantuvo a 220◦C. Alícuotas (1µl) fueron inyectados con
una proporción dividida de 10:1 en un tubo de 30 m×0,25 milímetros×
0,25µm Columna capilar de sílice fundida Nukol (n.º de catálogo:
24107, Supelco, Sigma-Aldrich) con gas portador de helio ajustado a
un caudal de 1 ml/min. La temperatura del horno se mantuvo
constante a 80◦C durante 1 min y luego se aumentó a 20◦C/min a una
temperatura de 180◦C y se mantuvo durante 1 min, y se aumentó a 10◦
C/min hasta una temperatura final de 200◦C. El tiempo total de
ejecución por muestra fue de aproximadamente 14 min.
9 Agosto 2021 | Volumen 12 | Artículo 715241
Hong et al.
Síntesis de PPN
El ftalil pululano se sintetizó de acuerdo con el método perfeccionado
descrito en el estudio anterior (Hong et al., 2019). En resumen, se
disolvieron 1,0 g de pululano en 10 ml de dimetilformamida y se
añadieron a la solución 24 mg de dimetilaminopiridina (0,1 mol/mol
de residuos de azúcar de pululano) como catalizador. Posteriormente,
se añadieron 2,7 g de anhídrido ftálico a la solución anterior en una
relación molar de 9:1 (anhídrido ftálico:pululano). La reacción se
realizó a 54◦C durante 48 h bajo nitrógeno. El ftalilpululano producido
se dializó primero en dimetilformamida para eliminar el anhídrido
ftálico sin reaccionar y luego en agua destilada a 4◦C durante 24 h
para formar PPN autoensamblados. El pululano que no había
reaccionado se eliminó después de la ultracentrifugación. Finalmente,
los PPN se liofilizaron y almacenaron a -20◦C hasta su uso posterior. La
topografía de la superficie de las PPN se analizó mediante microscopía
electrónica de barrido de emisión de campo con 55VP-SEM (Carl Zeiss,
Oberkochen, Alemania).
in vitroEvaluación de la actividad
antimicrobiana
Para determinar los efectos de los PPN sobre la actividad antimicrobiana
de LP, se realizaron el ensayo de cocultivo y la prueba de difusión en agar
utilizandoE. coliy LM como patógenos como se describió anteriormente con
ligeras modificaciones (Ditu y otros, 2011;Driscoll y otros, 2012). LP,
E. coli, y LM se cultivaron en caldo MRS, LB y BHI,
respectivamente, en 37◦C con agitación (255 rpm) durante 24 h
antes de usarlo en experimentos posteriores o almacenarlo a -70◦
C en glicerol al 15% (v/v).
Para el ensayo de cocultivo, 2,0×106UFC/ml deE. colio LM fue
cocultivado con 2.0×105UFC/ml de LP tratado con o sin PPN al 0,5% (p/
v) o pululano en caldo MRS durante 8 h a 37◦C en condiciones
aeróbicas en una incubadora con agitación (250 rpm). Las muestras
cocultivadas se esparcieron en agar MacConkey u Oxford y se
incubaron durante 24 h a 37◦C, y los números deE. colio se contaron
las colonias LM, respectivamente. Para el ensayo de difusión en agar,
100µyo deE. colio acciones LM (2.0×108UFC/ml) se extendió sobre agar
LB o BHI. Se colocó un disco de papel sobre la placa de propagación
de patógenos. Entonces, 120µSe dejó caer sobre el disco de papel 1 de
medio de cultivo de 8 h de LP tratado con o sin (0,5% p/v) de PPN o
pululano. Después de secar a temperatura ambiente, la placa se
cultivó durante la noche a 37◦C. Las zonas de inhibición se utilizaron
como medida directa de la actividad antimicrobiana.
Procedimientos y mediciones experimentales
con animales.
El estudio de alimentación simbiótica se realizó con ratones hembra BALB/c de 4
semanas de edad siguiendo directrices éticas internacionales. El Comité
Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Nacional
de Seúl aprobó los experimentos con animales (SNU-180904-2-1). Los ratones se
alojaron a una temperatura controlada (22±2◦C) en un ciclo de luz/oscuridad de
12 h. Los animales fueron alimentados con una dieta estándar para ratones y se
les proporcionó agua destilada.ad libitum. Después de 7 días de aclimatación, los
ratones fueron asignados aleatoriamente en seis grupos (seis ratones BALB/c
por grupo, una jaula por grupo) (Figura 2A). Durante el período del experimento,
todos los ratones fueron rastreados individualmente marcando su identificación.
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Simbióticos con nanoprebióticos para la disbiosis
números en sus colas. El grupo de control (C) continuó siendo
alimentado como antes sin antibióticos, simbióticos ni exposición
a patógenos durante todo el período experimental. A los otros
grupos (T1-T5) se les administró un cóctel de antibióticos
(ampicilina:gentamicina:neomicina:vancomicina = 2:2:2:1, total 20
mg/ratones) durante 3 días al comienzo del experimento para
inducir disbiosis en sus intestino según los métodos descritos
previamente con modificación (Samuelson y otros, 2017;Bayer y
otros, 2019).
Las muestras fecales se esparcieron en agar LB y las colonias se
numeraron para comprobar simplemente el efecto de los antibióticos en la
microbiota intestinal.Figura complementaria 2). Posteriormente, los cinco
grupos, excepto el grupo C, fueron alimentados con pro-sinbióticos, que
fueron resuspendidos en 200µl de solución salina y se administra mediante
sonda oral durante 2 semanas. Antes de la resuspensión, los probióticos/
sibióticos se prepararon mezclando polvo liofilizado de cada probiótico o
prebiótico en cantidades precalculadas. Los tratamientos por grupo fueron
los siguientes: (1) T1 (sin pro-/sinbiótico), (2) T2 (LP 108UFC/ratones), (3) T3
[LP 108 UFC mezclado con 0,5 % en peso de pululano/ratones (LP/P)], (4) T4
[LP 108 UFC mezclado con 0,5 % en peso de PPN/ratones (LP /PPN)], y (5) T5
[LP 108UFC mezcladas con 0,5 % en peso de pululano y 0,5 % en peso de
PPN/ratones (LP/P/PPN)].
A partir del día 11 de alimentación con pro-sinbióticos,E. coli
(109UFC/ratones) se administró con 0,2 ml de NaHCO al 1%.3
(tratado 30 min antesE. coliadministración) a los ratones de
los grupos T1 a T5 mediante sonda oral durante 3 días. Al
administrar probióticos LP oE. coli, los números se
controlaron enumerando sus UFC usando placas de agar y
calculando la cantidad para 108UFC y 109UFC antes de la
administración, respectivamente.
El peso corporal y la ingesta de alimentos de los ratones se controlaron
diariamente durante todo el período experimental. Al final del
experimento, los ratones fueron sacrificados usando CO2. Luego, se
recogieron muestras de ciego, colon, contenido intestinal y suero para su
posterior análisis. El contenido intestinal se recogió en forma de una
mezcla de contenido de ciego y colon de cada ratón en el momento del
sacrificio. Se recogieron muestras de sangre (2 ml/ratones) mediante
sangrado retroorbitario y las muestras de suero se aislaron mediante
centrifugación a 12.000 rpm durante 3 minutos utilizando el tubo
separador de suero (BD microtainer, Estados Unidos). La longitud del colon
y el peso de las muestras de ciego se midieron inmediatamente después de
la disección.
Los recuentos de UFC viables de lactobacilos y bacterias coliformes se
contaron utilizando contenido intestinal resuspendido en solución salina
tamponada con fosfato (PBS) (10 mg de contenido intestinal/ml de PBS).
Entonces, 100µ1 de muestras resuspendidas se diluyeron en serie 10 veces
y se extendieron sobre agar sorbitol MRS y MacConkey, respectivamente,
seguido de incubación durante 20 h a 37ºC.◦C.
En vivoEnsayo de permeabilidad intestinal
Para evaluar el efecto pro/simbiótico sobre la integridad de la barrera
intestinal, se utilizaron el ensayo FITC-dextrano y el kit de detección del
nivel de endotoxinas séricas (Chelakkot y otros, 2017). El día del sacrificio,
los ratones se sometieron a ayuno durante 4 h, seguido de una inyección
intragástrica con trazador FITC-dextrano (0,6 mg/g de peso corporal; nº de
catálogo 46944, Sigma-Aldrich) disuelto en 0,1 ml de PBS. Después de 3 h,
se recogieron muestras de suero para medir la intensidad.
10 Agosto 2021 | Volumen 12 | Artículo 715241
Hong et al. Simbióticos con nanoprebióticos para la disbiosis

valor de fluorescencia FITC a una longitud de onda de excitación de por FASTX-Toolkit v.0.0.13 antes de la región de mala calidad. Luego, las
490 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm utilizando un lecturas recortadas de extremos emparejados se fusionaron usando FLASH
espectrofotómetro de fluorescencia Hitachi F-4500. Las muestras se v1.2.11 y se demultiplexaron. Luego, las lecturas de secuencia se
diluyeron en PBS para trazar una curva estándar. La medición se agruparon en tablas OTU mediante selección de OTU de referencia abierta
obtuvo un mínimo de tres veces por muestra. Los niveles de con submuestras a un nivel de similitud de secuencia del 97 % con la base
endotoxina sérica (LPS) se detectaron mediante el método Pierce.MT de datos GreenGenes 13_8 como referencia. El método de selección de
Chromogenic Endotoxin Quant Kit (Thermo Fisher Scientific, OTU fue usearch61 y el valor del parámetro percent_subsample fue 0,1 (
Waltham, MA, Estados Unidos) según protocolo del fabricante. Édgar, 2010). Las secuencias representativas se alinearon utilizando el
Muestras de suero diluidas (50µl) fueron probados usando un programa PyNAST, el cual se asignó taxonómicamente utilizando el
método colorimétrico. asignador de taxonomía de consenso uclust (Desantis et al., 2006).
La diversidad microbiana de las muestras (diversidad alfa) se determinó
Extracción y secuenciación de ADN utilizando el estimador de cobertura basado en abundancia, Chao1, OTU
Se extrajo el ADNg bacteriano de muestras intestinales para observadas, diversidad filogenética, índices de Shannon y Simpson. Estos
identificar y estimar bacterias específicas o su comunidad mediante índices se calcularon a partir de 85.000 lecturas de secuencia mediante
qPCR y secuenciación de alto rendimiento de los genes bacterianos rarefacción con 10 iteraciones. El análisis de coordenadas principales se
del ARN ribosómico 16S (ARNr 16S). realizó a nivel de filo y género basándose en distancias UniFrac ponderadas
El ADN se extrajo según el protocolo del fabricante de 50 mg de cada y no ponderadas, y los efectos de los probióticos, PPN, pululano o sus
muestra de contenido intestinal utilizando el sistema AccuPrep. Kit de
R simbióticos se evaluaron mediante pruebas estadísticas de Adonis con el
©
extracción de ADN en heces (Bioneer, Daejeon, Corea del Sur), seguido de paquete “vegano” en R. La abundancia de Los taxones microbianos se
almacenamiento a -20ºC◦C hasta su posterior análisis. Para la qPCR expresaron como un porcentaje del total de secuencias del gen 16S rRNA.
específica de especie, los cebadores utilizados se diseñaron en función de
las secuencias de ADN de las bacterias de interés para la detección, y la
qPCR se realizó como se describió anteriormente (Brown y otros, 2016). Los
Predicción de las funciones de las
cebadores utilizados para detectar LAB (lactobaciloy bifidobacteria) yE. coli
están listados enTabla complementaria 1.
comunidades microbianas.
Para explorar la comunidad microbiana de muestras intestinales, la región
filogenético Investigación de Comunidades por
Reconstrucción de Estados No Observados (PICRUSt) versión 1.0.01se
V4 del gen bacteriano 16S rRNA se amplificó utilizando la polimerasa Takara
utilizó para predecir el perfil funcional de las comunidades
Ex-Taq (Takara Bio, Shiga, Japón) y cebadores universales (F: 5′
microbianas basándose en las secuencias del gen 16S rRNA obtenidas
GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′, r: 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′). El
(Douglas y otros, 2018). Los metagenomas se predijeron utilizando los
programa de amplificación fue el siguiente: 1 ciclo de 94◦C durante 3 min, 40
ortólogos KEGG precalculados y se clasificaron en una jerarquía
ciclos de 94◦C durante 45 s, 55◦C durante 1 min y 72◦C durante 1,5 min y 1 ciclo
utilizando los metadatos de la ruta KEGG. LDA se realizó utilizando
de 72◦C durante 10 min. Los amplicones se separaron mediante electroforesis
LefSe en pag <0,05 y LDA>3.0 usando galaxia2(Segata et al., 2011).
en gel de agarosa (100 V, 45 min) y se purificaron utilizando un kit de
extracción en gel QIAquick (Qiagen, Valencia, CA, Estados Unidos).
Análisis estadístico
Se utilizó el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEB Next Ultra ANOVA unidireccional ypost-hocSe utilizó la prueba de diferencias
para Illumina (New England Biolabs, Ipswich MA, Estados Unidos) para honestamente significativas (HSD) de Tukey para comparaciones de medias
construir bibliotecas de ADN de acuerdo con las instrucciones del múltiples para encontrar diferencias significativas entre los grupos. Se
fabricante con algunas modificaciones. Los pasos de selección de tamaño realizaron ANOVA unidireccional y regresión lineal simple utilizando
para los ADN ligados al adaptador y los pasos de limpieza se reemplazaron estadísticas R y los paquetes “corrplot” versión 3.0.3 (R Foundation for
por productos de PCR utilizando un kit de purificación de PCR QIAquick Statistical Computing, Viena, Austria), respectivamente. La importancia se
(Qiagen, CA, Estados Unidos). El adaptador y los cebadores índice se asumió en∗pag <0,05,∗∗pag <0,01, y
agregaron a los amplicones utilizando el kit NEBNext Multiplex Oligos for ∗∗∗pag <0,001.
Illumina (New England Biolabs). La construcción de bibliotecas de ADN se Para explorar la relación entre el nivel de endotoxinas séricas y la
confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa y las bibliotecas se microbiota intestinal, se realizó un análisis de regresión lineal simple y
purificaron utilizando un kit de extracción en gel QIAquick. Luego, los se evaluó la significancia mediante el coeficiente de correlación de
componentes de las bibliotecas se secuenciaron utilizando un Illumina Pearson (r) ypag-valores.
MiSeq 2.×Plataforma de secuenciación de extremos pares de 250 pares de
bases (pb) (Macrogen, Daejeon, Corea del Sur). Las secuencias del gen 16S
rRNA determinadas en este estudio se depositaron en la base de datos
DECLARACIÓN DE DISPONIBILIDAD DE DATOS
NCBI SRA con el número de acceso SRR11341465.

Las contribuciones originales presentadas en el estudio están disponibles

Análisis de la comunidad microbiana
La comunidad microbiana se analizó utilizando el software
Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME) versión 1.9.1
y varios scripts Perl internos. Brevemente, FastQC V0.11.8 verificó
la calidad de las lecturas de secuencia sin procesar y las recortó.
públicamente. Estos datos se pueden encontrar aquí: https://www.ncbi.nlm.nih.
gov/sra/?term=SRR11341465.
2https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/

Fronteras en Microbiología | www.frontiersin.org 11 Agosto 2021 | Volumen 12 | Artículo 715241

Hong et al.
DECLARACIÓN DE ÉTICA
El estudio con animales fue revisado y aprobado por el Comité Institucional
de Uso y Cuidado de Animales (IACUC) de la Universidad Nacional de Seúl y
aprobó los experimentos con animales (SNU-180904-2-1).
CONTRIBUCIONES DE AUTOR
LH diseñó y realizó los experimentos y escribió el manuscrito.
S-ML analizó los datos y escribió el manuscrito. W-SK, S-HO e
Y-LL realizaron los experimentos de alimentación de animales.
S-HC, DC y EJ discutieron los resultados y corrigieron el
manuscrito. Y-JC, S-KK y C-SC supervisaron el proyecto. Todos
los autores contribuyeron al artículo y aprobaron la versión
enviada.
FONDOS
Este trabajo fue apoyado por los Programas de Investigación en Ciencias
Básicas a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF)
financiada por el Ministerio de Educación bajo la subvención
NRF-2020R111A1A01053275, y el Instituto Coreano de Planificación y
Evaluación de Tecnología en Alimentación, Agricultura, Silvicultura y Pesca.
(IPET) a través del Programa de Desarrollo Tecnológico de la Agro-Bio
Industria, financiado por el Ministerio de Agricultura, Alimentación y
Asuntos Rurales (MAFRA) bajo la subvención 316005-5.
EXPRESIONES DE GRATITUD
Agradecemos a Y-JC, S-KK y C-SC por sus consejos.
MATERIAL SUPLEMENTARIO
El material complementario de este artículo se puede encontrar
en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.
2021.715241/full#material-suplementario
Figura complementaria 1 |in vitroPerfil de fermentación de SCFA de probióticos LP tras el
tratamiento de nanopartículas de prebióticos pululano o nanoprebióticos de ftalil pululano
(PPN). Los niveles de acetato (A),propionato (B),y butirato (C)en el medio de cultivo de LP se
midieron por triplicado mediante cromatografía de gases.
Figura complementaria 2 |Proporción relativa de recuentos de colonias en agar Luria-Bertani (LB) después de
que los ratones fueron tratados con antibióticos
(ampicilina:gentamicina:neomicina:vancomicina = 2:2:2:1, total 20 mg/ratones) con el de un grupo
tratado con solución salina. Cada muestra se sembró en placas sobre agar LB por triplicado después de
una dilución en serie de 10 veces.
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Fronteras en Microbiología | www.frontiersin.org
Simbióticos con nanoprebióticos para la disbiosis
Figura complementaria 3 |Consumo de alimento diario promedio por ratón durante el
período experimental.
Figura complementaria 4 |Niveles de isocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano en muestras de suero de
cada grupo después de la inyección intragástrica del trazador FITC-dextrano. El trazador FITC-dextrano
(0,6 mg/g de peso corporal) se disolvió en 0,1 ml de solución salina tamponada con fosfato. El nivel
sanguíneo de FITC-dextrano se controló por triplicado midiendo el valor de intensidad de la fluorescencia
de FITC en muestras de suero a una longitud de onda de excitación de 490 nm y una longitud de onda de
emisión de 530 nm para investigar el grado de permeabilidad intestinal en ratones.
Figura complementaria 5 |Doblez de cambios en la expresión genética de marcadores que
detectan enteropatogénicos.Escherichia coli(intimín) (A),lactobaciloespecies
(B),ybifidobacteriaespecies (C)en muestras de contenido intestinal por grupo. Todas las
muestras se midieron por triplicado. La información de secuencia detallada para cada
marcador se enumera enTabla complementaria 1.
Figura complementaria 6 |Diferencias en la diversidad microbiana intestinal entre grupos tras el
tratamiento con pro/simbióticos. Índices de diversidad alfa (A:índice de Shannon; B:Índice de Simpson) de
la microbiota intestinal por grupo. Efectos del tratamiento con nanopartículas de ftalil pululano (PPN) en
las unidades taxonómicas operativas (OTU) observadas (C). Todos los índices de diversidad alfa se
investigaron utilizando el software QIIME versión 1.9.1.
Figura complementaria 7 |abundancia relativa deproteobacteriaspor grupo. ANOVA
unidireccional con Tukeypost-hocSe utilizó la prueba para determinar diferencias
significativas entre los grupos, y diferentes letras en superíndice indican una diferencia
significativa (pag <0,05).
Figura complementaria 8 |Composiciones generales de la microbiota intestinal a nivel de
género (A)y la abundancia relativa de géneros difirió significativamente según el grupo.
(B)ANOVA unidireccional con Tukeypost-hocSe utilizó una prueba para cada género para
determinar diferencias significativas entre los grupos, y diferentes letras en superíndice
indican una diferencia significativa (pag <0,05).
Figura complementaria 9 |Predicción metagenómica de la microbiota intestinal de ratones
inducidos por disbiosis después del ensayo para determinar los efectos de las nanopartículas
simultáneas de LP/ftalil pululano (LP/PPN) (A;T1 frente a T4, puntuación del análisis
discriminante lineal (LDA)>3.0) o nanopartículas de prebióticos (B;T3 frente a T4, puntuación
LDA>2.0). Las funciones microbianas se predijeron utilizando PICRUSt en el tercer nivel de la
vía KEGG y el análisis LEfSe se representó como histogramas.
Figura complementaria 10 |Análisis de correlación entre el nivel de endotoxina sérica y
la abundancia relativa de bacterias.proteobacterias(A)fue el único filo que mostró una
correlación con la endotoxina sérica. Varios géneros, entre ellos cronobacter(B),género
no clasificado de la familia Enterobacteriaceae (C), enterobacteria(D),yEstreptococo(MI),
se correlacionaron significativamente positivamente, mientras quelactobacilo(F)se
correlacionó significativamente negativamente con el nivel de endotoxina sérica. La
relación fue evaluada mediante el coeficiente de correlación de Pearson (r) ypag
-valores de regresión lineal simple.
Tabla complementaria 1 |Secuencias de cebadores para identificar bacterias específicas.
[Escherichia coli(intimín),lactobaciloespecies,bifidobacteriaspp., y ARNr 16S (B16S)] se utilizaron
para realizar una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) con ADNg del
contenido intestinal.
Cuadro complementario 2 |Abundancia relativa de filos y géneros de la microbiota ceca del
ratón y taxón que lo comparte todo tras el tratamiento con pro/simbióticos. Los datos se
muestran como media.±SD redondeado al tercer dígito después del punto decimal. ANOVA
unidireccional con Tukeypost-hocSe utilizó una prueba para determinar diferencias
significativas entre los grupos. Diferentes letras en superíndice indican significación estadística
(pag <0,05).
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Conflicto de intereses:S-ML, S-HC, DC y EJ son empleados de Insilico Co., Ltd.
Los autores restantes declaran que la investigación se realizó en ausencia de relaciones
comerciales o financieras que pudieran construirse como un potencial conflicto de
intereses.
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14 Agosto 2021 | Volumen 12 | Artículo 715241