Mutagénesis al azar

MUTAGÉNESIS: Es aquella modificación de material genético que resulta estable y transmisible a las células
la producción de mutaciones sobre el ADN, clonado o no. De realizarse in vitro, dicha alteración puede
realizarse al azar (mutagénesis al azar), sobre cualquier secuencia, o bien de forma dirigida sobre una secuencia
conocida y en la posición de interés.

AL AZAR: Son mutaciones puntuales introducidas en posiciones aleatorias en un gen de interés, típicamente a
través de PCR utilizando una polimerasa de ADN propensa a errores o con agentes mutagénicos.

TÉCNICA PCR PROPENSA A ERRORES: se basa en el hecho de que la Taq ( polimerasa termoestable,
obtenida del microorganismo Thermus aquaticus) pueden incorporar nucleótidos incorrectos en presencia de
altos niveles de Mg+2 junto con Mn+2 .

A) la PCR propensa a errores simplemente se basa en la pérdida de especificidad de la Taq en presencia de

altas cantidades de iones de Mg+2 o Mn+2
B) la mutagénesis aleatoria sitio-dirigida se basa esencialmente en el mismo principio que la mutagénesis
sitio-dirigida, con la única diferencia de usar primero degenerados en la región de destino. Se crea una
secuencia degenerada en ciertos residuos (N, para cualquier nucleótido) para introducir mutaciones
relativamente aleatorias en esos residuos. Se generan muchas mutantes por lo que luego son necesarios
métodos de alto rendimiento para estudiar los efectos de las mutaciones introducidas.

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La generación de ventanas de mutantes es una de las principales herramientas para comprender la función
génica.
Esto implica la realización de mutantes al azar, lo que implica, generar individuos o líneas de individuos que
portan mutaciones del tipo knock out para genes diferentes.

¿Qué son las mutaciones de tipo knock out?

​Un organismo knock out es por lo general aquel que ha sido modificado genéticamente para desactivar uno o
más genes de forma específica. Los científicos crean knockouts (habitualmente ratones) para poder estudiar el
impacto de la pérdida de un gen y para aprender acerca de su función

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1- GENERACIÓN VENTANA DE MUTANTES
Los procedimientos más utilizados para generar ventanas de mutantes son:
Tratamiento con ENU, Utilización de transposones y Utilización de retrovirus

a. ENU es un compuesto alquilante que transfiere su grupo etilo a cualquier oxígeno o nitrógeno
nucleofílico de los ácidos nucleicos. Esto forma aductos de DNA que derivan en un mal apareamiento
de las hebras, que si no son reparadas correctamente, se introducen como mutaciones puntuales.
Está formado N-etil N-nitrosourea (ENU). Bajos los efectos del ENU, la tasa de mutaciones se eleva,
aproximadamente, 120 veces con respecto a la tasa de mutaciones espontáneas. Siendo que este poderoso
mutágeno actúa totalmente al azar, es lógico esperar muchas mutaciones diferentes e incluso varios alelos de una
misma mutación.

b. El genoma de los mamíferos contiene miles de copias de distintos tipos de secuencias de ADN
llamadas retroposones. Estas secuencias son también una fuente de nuevas mutaciones por inserción.
La inserción no es la única forma en la que los retroposones pueden causar mutaciones. Al encontrarse
dispersos en miles de copias homólogas a lo largo del genoma, estas secuencias pueden favorecer
fenómenos de recombinación con deleción de segmentos de ADN.
c. Los retrovirus poseen genomas de RNA, y durante su ciclo de multiplicación generan un intermediario
de DNA con capacidad integrativa en el genoma celular. Dada esta situación situación, los retrovirus
retrovirus son herramientas herramientas adecuadas para la mutagénesis porque tienen la capacidad de
afectar genes por interrupción. A su vez, los virus tienen la capacidad de transducir células, de modo tal
que su utilización también resuelve el paso de la transferencia horizontal. Los retrovirus aplicados en
mutagénesis son modificados de manera tal que sólo pueden transducir células e integrarse al genoma,
pero no pueden completar un ciclo infectivo. Uno de los más utilizados leucemia murina de Moloney
(M MuLV), son capaces de provocar mutaciones intercalando en un gen bajo la forma de un provirus

2- SELECCIÓN FENOTIPO NEGATIVO

Se procede a caracterizar los individuos en función de los fenotipos que presentan.

3- IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA AFECTADA

Si se realizó una mutagénesis con ENU, se debe posicionar mediante mapeo de ligación. En tanto, si se usaron
transposones y retrovirus el procedimiento usual es la PCR invertida.

DEFINICIONES
Mapeo de ligación: El mapeo es el proceso de elaborar representaciones esquemáticas catalogando los genes y
otras características de los cromosomas mostrando su ubicación relativa. Los mapas citogenéticos se hacen
mediante microfotografías de cromosomas teñidos para revelar variaciones estructurales. Los mapas genéticos
utilizan la técnica del ligamiento para estimar la ubicación relativa de los genes.

PCR invertida: La reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa es una variante de la PCR,
una técnica de laboratorio comúnmente usada en biología molecular para generar una gran cantidad de
copias de ADN, proceso llamado amplificación.

BIBLIOGRAFÍA:
https://secal.es/wp-content/uploads/2014/10/07-GENETICA-Pba-2.pdf.pdf
http://ig2.blog.unq.edu.ar/wp-content/uploads/sites/63/2014/07/Unidad-12.pdf
Mapeo de ligación: https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Mapeo
PCR invertida: https://es.wikipedia.org/wiki/RT-PCR