6.

ANLISIS DEL ADN CROMOSMICO

MEDIANTE MACRORRESTRICCIN:
ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSANTE
(PFGE)
Como se ha expuesto en el apartado
5(procedimientos de restriccin e hibridacin de
ADN) para una especie bacteriana concreta,
podemos encontrar enzimas de restriccin de
baja frecuencia de corte, es decir, enzimas cuyo
lugar de restriccin, por su longitud y secuencia,
se encuentran raramente a lo largo del ADN
cromosmico de la especie bacteriana en
cuestin. El uso de este tipo de enzimas permite
la macrorrestriccin del ADN de la bacteria y la
divisin del ADN en pocos fragmentos (entre 10 y
30). Muchos de estos fragmentos son de gran
tamao, ms de 40 kb, y no pueden separarse por
tcnicas de electroforesis convencional, en las
que se aplica un campo elctrico constante
esttico, sino que requieren tcnicas en las que la
orientacin del campo elctrico es variable
peridicamente, son las denominadas tcnicas de
electroforesis en campo pulsante o pulsed-field
gel electrophoresis (PFGE)
La combinacin de estas dos tcnicas,
macrorrestriccin del ADN y separacin de los
fragmentos por PFGE, se ha aplicado con mucha
frecuencia en estudios epidemiolgicos en
bacteriologa. Se obtienen as, patrones de
restriccin sencillos que representan el ADN
cromosmico bacteriano distribuido en unas
pocas bandas con movilidades electroforticas
distintas. Sin embargo, las caractersticas de
estas tcnicas determinan una serie de cambios a
tener en cuenta en las distintas fases en las que
se divide el proceso de macrorrestriccin y PFGE:
1) el procedimiento de extraccin de ADN, obliga
a inmovilizar las clulas bacterianas en bloques
de agarosa, en los que se llevar a cabo la lisis,
de manera que el ADN cromosmico tambin
quede embebido en agarosa, el objetivo es que el
ADN permanezca ntegro y no se fracture
accidentalmente (al pipetear, agitar ...) lo cual
desvirtuara los patrones de restriccin y afectara
a la reproducibilidad de la tcnica, 2) la restriccin
del ADN debe hacerse tal y como ste est
preparado, es decir, inmovilizado en los bloques
de agarosa, utilizando enzimas de baja frecuencia
de corte, y 3) la tcnica de electroforesis utilizada
para la separacin de fragmentos debe ser una
PFGE, con las caractersticas diferenciales
propias de sta.
6.1. TRATAMIENTO PREVIO DE LOS
MICROORGANISMOS Como se ha apuntado

previamente, para poder obtener patrones de

restriccin reproducibles por PFGE que permitan
la comparacin de los genotipos de una serie de
microorganismos, el objetivo es aislar el ADN
cromosmico ntegro, sin fracturas y, a la vez, en
las mejores condiciones de pureza para que los
enzimas de restriccin puedan cortar
correctamente,
evitando
restricciones
incompletas. Para ello deben observarse una
serie de precauciones con relacin al
procesamiento y tratamiento previo de los
microorganismos:
6.1.1.
Crecimiento
bacteriano
Los
microorganismos se pueden obtener a partir de un
cultivo en medio lquido o bien realizar una
suspensin procedente de un medio slido. En
cualquier caso se debe tratar de cultivos puros, en
medios no selectivos, de no ms de 18-24 horas
de incubacin. Es conveniente estandarizar el
inculo mediante espectrofotometra (ver
documento tcnico correspondiente), sta ser
una medida indirecta de la concentracin de ADN
que se obtendr durante el procedimiento.
Seguidamente, se mezcla parte del inculo con el
mismo volumen de agarosa de bajo punto de
fusin fundida, y se deja solidificar en un molde
especialmente diseado para ello. De esta
manera conseguimos inmovilizar un nmero de
clulas bacterianas equivalente para cada cepa
que incluimos en el estudio. A partir de este
momento, el resto del procesamiento se realizar
utilizando el bloque completo. La agarosa en la
que se encuentran embebidas las clulas permite
fluir a su travs las soluciones de lisis o restriccin
en las que vamos a sumergir el bloque, y a la vez
va a proteger las molculas de ADN de la rotura
mecnica y de la degradacin nucleoltica.
6.1.2. Lisis Para conseguir la lisis de los
microorganismos, los bloques se sumergen en
una solucin de lisis que contenga los enzimas
precisos para romper las clulas. La composicin
de la solucin de lisis es variable en funcin de la
especie bacteriana con la que estemos trabajando
(ver documento tcnico correspondiente). Como
los enzimas deben actuar en el interior de la malla
de agarosa en que estn embebidas las clulas,
se precisan enzimas ms concentrados e
incubaciones prolongadas.
6.1.3. Lavados Una vez que las clulas estn
lisadas es preciso someter a los bloques a
sucesivos lavados con una solucin TE (10 mM
Tris-HCl, 1 mM EDTA ). Los lavados consisten en
introducir los bloques en TE y agitarlos durante, al
menos, 30 minutos, esta operacin se repite
cuatro o cinco veces. El objetivo de los lavados es

arrastrar fuera del bloque de agarosa restos

celulares procedentes de la lisis, as como
eliminar componentes que puedan inhibir la
restriccin posterior (proteinasa K, detergente o
EDTA). Algunos protocolos publicados para el
procesamiento rpido de ciertas bacterias por
PFGE, prescinden de los lavados y para ello se
eliminan ciertos compuestos del procesamiento
previo, como el tratamiento con proteinasa K.
6.1.4. Restriccin La actividad de los enzimas de
restriccin viene definida sobre ADN en ausencia
de agarosa. En general, la presencia de agarosa
conlleva cierto grado de inhibicin de la reaccin
de digestin, por tanto es preciso aumentar el
nmero de unidades de enzima por reaccin. El
tiempo de incubacin de la reaccin de restriccin
tambin debe incrementarse, teniendo en cuenta,
no obstante, que algunos enzimas pierden su
actividad tras las primeras horas de incubacin.
En este caso, se debera aadir a la reaccin una
segunda alcuota del enzima. En relacin a la
seleccin del enzima de restriccin ms
adecuado, en estos momentos se pueden
encontrar en la bibliografa cientfica
especializada publicaciones sobre prcticamente
cualquier especie bacteriana estudiada por PFGE
(en el anexo 3 del documento tcnico
correspondiente, se incluye una tabla con los
microorganismos y enzimas ms frecuentes para
su estudio). A la hora de seleccionar un enzima
de restriccin para PFGE que genere pocos
fragmentos de ADN y estos sean de gran tamao,
debe tenerse en cuenta que ello depende de la
longitud y de la secuencia del lugar de restriccin
del enzima. En general, los enzimas con un lugar
de restriccin rico en G+C, son adecuados para
tratar el ADN bacteriano de especies con genoma
rico en A+T y, a la inversa, enzimas que
reconocen secuencias A+T, son adecuados para
digerir ADN rico en G+C. Sin embargo, en la
prctica, es difcil predecir la utilidad de un enzima
para estudiar por PFGE una determinada especie
bacteriana. Por ltimo, destacar que el estudio por
PFGE de un grupo de cepas con un enzima de
restriccin primero, y con un segundo enzima
distinto despus, puede mejorar la capacidad
de discriminacin de la tcnica.
6.2. FUNDAMENTOS Y VARIANTES TCNICAS
Durante los aos 70, se observ que bajo la
accin de un campo elctrico, las molculas de
ADN se reorientaban y se desplegaban
avanzando en direccin al polo positivo. Cuando
el campo elctrico cesaba, las molculas de ADN
se relajaban recuperando su estado inicial. La
aplicacin de un segundo campo elctrico, con

una orientacin distinta del primero, obligaba al

ADN a cambiar su conformacin y reorientarse de
nuevo para poder avanzar en la direccin del
segundo campo elctrico.El tiempo requerido
para esta reorientacin era dependiente de la
longitud de la molcula, esto es de su peso
molecular. Tras el cambio de orientacin del
campo elctrico, las molculas grandes tardan
ms tiempo en alinearse y poder comenzar el
avance a travs del gel de lo que tardan las
molculas de ADN ms pequeas. Mientras los
campos elctricos que se alternen tengan la
misma intensidad y voltaje, la migracin final del
ADN se recoger en forma de lnea recta, aunque
el patrn final de separacin de los fragmentos
revelar la suma de todos los avances cortos en
zig-zag que el ADN ha realizado. Este principio
fue el que llev a Schwartz y Cantor en 1984 a la
descripcin de las tcnicas de PFGE y su utilidad
en la separacin de molculas grandes de ADN,
del orden de varios cientos de kb. Desde la
descripcin original del sistema, se disearon
distintos aparatos con diferencias en la geometra
de los electrodos o en la trayectoria migratoria del
ADN. Todos los sistemas eran capaces de
separar un amplio rango de molculas de ADN de
diferentes tamaos (entre 1 y 7000 kb), aunque
diferan en la velocidad de separacin y en la
resolucin obtenida en un rango de peso
molecular dado. De todos los sistemas
desarrollados, el ms extendido ha sido el CHEF
(clamped
homogeneous
electric
field
electrophoresis). Sus mayores ventajas son la
facilidad de manejo y la capacidad de separar
mltiples muestras generando patrones de
bandas rectos, que hacen mucho ms fcil la
comparacin entre ellos. Este sistema dispone de
veinticuatro
electrodos
dispuestos
perifricamente y fijos a un contorno hexagonal
(figura 6). El voltaje generado por la fuente de
electroforesis o generador de corriente se divide
entre los electrodos, de manera que se crea un
gradiente constante a lo largo de todo el gel. El
ngulo de reorientacin debe ser superior a 90,
habitualmente se trabaja con ngulos de 120
aunque existen modelos del sistema en el
mercado que permiten modificar este parmetro.
Por ngulo de reorientacin, se entiende el ngulo
que forman los vectores correspondientes a los
dos campos elctricos que se alternan y que
refleja los grados de reorientacin de una
molcula de ADN para poder avanzar en la
direccin de los campos elctricos que se
apliquen al gel.

Las tcnicas de PFGE normalmente requieren

voltajes elevados durante muchas horas, lo cual
hace necesaria la recirculacin y refrigeracin del
tampn de electroforesis. As los cuatro
componentes bsicos de un sistema de PFGE
son los siguientes: Unidad de control de pulsosgenerador de corriente. Normalmente, en la
misma unidad se renen la fuente de
electroforesis (generador de 350 V) y el
dispositivo que controla los 24 electrodos y la
duracin de la alternancia de los pulsos elctricos.
Cubeta de electroforesis. Es una cubeta acrlica
en la que se encuentran los 24 electrodos
distribuidos en forma hexagonal y en cuyo centro
se coloca el gel de agarosa, sumergido en el
tampn de electroforesis correspondiente. La
recirculacin del tampn de electroforesis es
esencial por dos motivos: 1) para refrigerar y
mantener una temperatura constante en la cubeta
y en toda la superficie del gel y 2) para mantener
la capacidad de tampn de la solucin, alterada
por el proceso de electrolisis. Por tanto desde la
cubeta hay un tubo de salida del tampn hacia
una unidad de refrigeracin y desde sta un tubo
que conecta de nuevo con la cubeta. La
recirculacin se lleva a cabo con una bomba.
Bomba de recirculacin del tampn. Aspira el
tampn de electroforesis de la cubeta, lo empuja
a travs de la unidad de refrigeracin y lo
devuelve a la cubeta. Es preferible que sea de
flujo regulable, recomendndose un flujo de 0,5-1
litro/min. Unidad de refrigeracin.Suele ser un
aparato de refrigeracin porttil. El tampn de
PFGE circula a travs de un nico tubo de
aluminio que se encuentra en contacto con la
solucin de refrigeracin. La refrigeracin del
tampn de electroforesis permite mantener
constante la temperatura de la cubeta
(generalmente se recomienda 14C), utilizar
voltajes superiores y por tanto electroforesis ms
rpidas.
6.2.2. Variables que afectan a la resolucin del
PFGE
Los resultados de las tcnicas de PFGE son muy
sensibles a variaciones en prcticamente todos
los parmetros electroforticos. Las condiciones
para obtener la mejor resolucin por PFGE estn,
por supuesto, en funcin del rango de tamao de
las molculas a separar y del enzima de
restriccin
seleccionado,
pero
tambin
intervienen variables tcnicas como la duracin y
alternancia de los pulsos elctricos, el voltaje, la
temperatura de la cubeta, el tiempo de
electroforesis, el tampn utilizado o el ngulo de
reorientacin.

Pulsos: duracin y alternancia. Los sistemas de

PFGE consiguen separar fragmentos grandes de
ADN al inducir la reorientacin de las molculas
mediante cambios peridicos en el campo
elctrico. La duracin de los campos elctricos
que se alternan determina el tamao del ADN que
puede separarse. As pues, denominamos pulso
al campo elctrico alternante, y su duracin o
intervalo hace referencia a cunto tiempo est
actuando en una direccin u otra. Los pulsos
pueden durar fracciones de segundo, para
separar molculas de pocas kb, o pueden durar
algo ms de una hora para separar molculas
mayores de 5 Mb. Puesto que nos estamos
refiriendo a la aplicacin de PFGE en la
tipificacin bacteriana, el rango de peso molecular
que interesa separar suele oscilar entre las 20 kb
y las 600-800 kb, lo cual se consigue con tiempos
que oscilan entre los 0,5 segundos y los 50-60
segundos. En general, cuanto mayor es la
molcula de ADN, mayor tiempo de reorientacin
se requiere; las molculas pequeas, que pueden
reorientarse con rapidez invierten gran parte del
tiempo del intervalo de pulso en avanzar a lo largo
del gel. Como habitualmente interesa separar un
rango amplio de fragmentos de ADN con distintos
tamaos, los sistemas de PFGE, permiten
establecer un incremento progresivo en la
duracin de los pulsos a lo largo de la duracin
total de la electroforesis. Por ejemplo, en una
electroforesis de 14 horas los pulsos pueden
alternarse cada 5 segundos al principio del gel y
acabar en la hora 14 con alternancias cada 30
segundos. Los sistemas comerciales de PFGE
ms utilizados actualmente, establecen una
distribucin lineal de la duracin de los pulsos
durante el tiempo de electroforesis. La aplicacin
de esta distribucin lineal mejora la resolucin en
la separacin de fragmentos, pero no garantiza
una relacin lineal constante entre tamao y
movilidad, de hecho, si se separan las mismas
muestras con distintos intervalos de pulsos se
obtienen patrones con movilidades muy distintas.
Por esta razn es muy importante, colocar en
todos los geles de PFGE controles de peso
molecular adecuados que faciliten la comparacin
entre patrones y la identificacin de determinados
fragmentos de ADN.
VoltajeEl gradiente de voltaje es la diferencia
entre el potencial elctrico de los electrodos, este
valor representa la fuerza que conduce el ADN a
travs del gel. Por tanto, el gradiente de voltaje
debe expresarse en unidades de voltaje por
distancia. Por ejemplo, si la fuente de
electroforesis genera un

voltaje de 180 V a una cubeta en la que los

electrodos estn separados 30 cm, el gradiente
de voltaje ser de 6 V/cm. El tamao del gel
utilizado no modifica este parmetro, siempre que
la distancia entre los electrodos o el voltaje
aplicado no vare. El uso de distintos voltajes
afecta no slo la distancia de migracin sino
tambin el rango de tamaos que pueden
separarse. As, para obtener una resolucin
comparable en geles procesados a diferentes
voltajes, debe modificarse no slo el tiempo de
electroforesis, sino los intervalos de pulsos para
compensar las diferencias en la migracin de
ADN. Utilizar un voltaje inferior requiere intervalos
de pulso ms largos para obtener resultados
similares. A voltajes bajos, las molculas de ADN
requieren ms tiempo para reorientarse y avanzar
tras la alternancia del pulso elctrico.
Temperatura de electroforesis Como se ha
mencionado previamente, la recirculacin del
tampn de electroforesis y el mantenimiento de
una temperatura constante son condiciones
indispensables para obtener resultados
reproducibles. Temperaturas entre 12C y 15C
son 22 las ms habituales. A medida que la
temperatura aumenta, el ADN avanza ms rpido
pero disminuye la resolucin de las bandas en el
gel. Por ejemplo, a 24C el ADN avanza un 50%
ms rpido de lo que lo hara a 13C, sin embargo
la disminucin en la calidad de los patrones de
bandas no justifica la reduccin del tiempo de
electroforesis. Temperaturas ms bajas, 8C10C, pueden ser recomendables para
microorganismos cuyo ADN se degrada con
facilidad (por ejemplo Streptococcus pneumoniae
o Clostridium difficile), de este modo se obtienen
patrones con bandas mejor definidas, para
compensar el enlentecimiento de la electroforesis
deben, entonces, modificarse otros parmetros
como voltaje, duracin de la electroforesis, etc.
Tiempo de electroforesis Debe intentarse
mantener el tiempo mnimo de electroforesis
necesario para obtener una resolucin adecuada.
En electroforesis largas la presencia de nucleasas
residuales puede contribuir a la degradacin del
ADN, adems, las bandas pierden definicin en la
zona ms distal del gel. Para mejorar la resolucin
de una PFGE, deben intentar ajustarse otras
variables, como el intervalo de los pulsos,
aumentar el tiempo de electroforesis slo
aumentar el espacio entre las bandas que ya se
hubieran separado, no ayudar a separar bandas
que migran conjuntamente al inicio del gel.

Tampn de electroforesis. En general se

recomienda el uso de TBE (x0,5; ver composicin
en documento tcnico correspondiente). En el
caso de necesitar separar molculas de gran
tamao (>2 Mb), se recomienda utilizar TAE (x1),
puesto que es ms rpido al generar una corriente
elctrica ms potente. ngulo de reorientacin.
Como se ha mencionado, por ngulo de
reorientacin, se entiende el ngulo que forman
los vectores correspondientes a los dos campos
elctricos que se alternan. Para obtener una
resolucin adecuada por PFGE se requieren
ngulos de reorientacin de ms de 90. El
estndar, cuando el sistema de PFGE tiene este
parmetro fijo, es de 120. En la actualidad
existen modelos que permiten modificar este
ngulo, disminuyndolo, lo cual es til para
separar molculas de ADN de gran tamao (> 2
Mb).
6.3. CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIN
DE RESULTADOS
El objetivo final de las tcnicas de tipificacin
molecular aplicadas al anlisis de brotes de
infeccin, es el poner de manifiesto que los
aislamientos relacionados epidemiolgicamente,
lo estn tambin genticamente. Es
imprescindible conocer los fundamentos de las
tcnicas de PFGE y cmo ciertos cambios
genticos pueden alterar los patrones de bandas
obtenidos por PFGE, para interpretar
correctamente los resultados. En una situacin
ideal, los patrones de PFGE de los aislamientos
que representan una cepa epidmica deberan
ser idnticos y fcilmente diferenciables de los
aislamientos
epidemiolgicamente
no
relacionados. Sin embargo, con frecuencia
cambios genticos, que ocurren muchas veces de
forma aleatoria, alteran el perfil de los patrones de
la cepa epidmica en el curso de un brote. A pesar
de todo, la comparacin e interpretacin de los
patrones de restriccin tiene un importante
componente de subjetividad por parte del
observador. Es importante tener en cuenta la
naturaleza de la coleccin de aislamientos que
nos proponemos estudiar. Son ms fciles de
interpretar los patrones obtenidos de cepas
aisladas en un periodo de tiempo corto y que han
dado lugar a un brote de infeccin recortado. En
ocasiones, aislamientos no relacionados
epidemiolgicamente pueden presentar un
genotipo idntico o muy parecido, particularmente
si pertenecen a una especie o subtipo con una
diversidad gentica limitada. Este es el caso de
ciertos microorganismos multirresistentes,