1.

Succinato deshidrogenasa
a) ¿Para qué se añade el aceite a las muestras?
Se añade para crear una barrera entre la atmosfera y el medio donde se esta desarrollando la
reacción, esto porque se está llevando a cabo la reducción del azul de metileno por acción del
complejo II, lo cuál provoca que el indicador se vuelva incoloro y, si no estuviera esta barrera,
el azul de metileno podría oxidarse de nuevo con el oxígeno presente en el aire y retornar a su
coloración azul, por lo que tendríamos resultados erróneos.

b) Represente en imagen o dibujo el resultado obtenido y describa los cambios observados.

El tubo número 3 que contenía la enzima, el azul de metileno y el

24 hrs succinato, perdió un poco la coloración inicial del azul de metileno,
esto se debe a que por acción de la enzima el azul de metileno se
redujo, pero al haber un contacto directo con el ambiente se volvió a
oxidar, regresando a la coloración inicial.

El tubo número 2 permaneció igual, ya que solo contenía el

24 hrs succinato, el azul de metileno y el aceite, pero al no tener la enzima
el azul de metileno no se reduce y aunque tenga aceite el azul de
metileno se encuentra oxidado.

El tubo número 1 perdió casi en su totalidad la coloración del azul de

24 hrs metileno, ya que, al tener la presencia de la enzima y el aceite, el
azul de metileno se redujo y el aceite no permitió que el oxígeno del
aire interactuara con este y de esta forma no se volvió a oxidar.
2. Citocromo oxidasa.
a) Represente en imagen o dibujo el resultado obtenido y describa los cambios observados.

Tubo 1: En este se agregó el sustrato con

la enzima y llevado a un volumen con agua,
en este del color inicial que teníamos (color
paja tenue) pasó a color café, esto
demuestra el poder oxidante de la solución
ya que el color del ion férrico es el obtenido
(obtenido del ferroso presente en la p-
fenilendiamina), por lo que se puede
concluir que la citocromo oxidasa realizó
este proceso.

Tubo 2: En este se añadió lo mismo que en

el tubo 1 pero también cianuro de potasio,
en este hubo prácticamente nada en
cambio de color, ¿Qué quiere decir esto?
Que el cianuro es inhibidor de la citocromo
oxidasa, por esto no se realizó la oxidación
del ion ferroso.

Tubo 3: Solo se añadió P-fenilendiamina y

agua, en este lo incoloro se mantuvo,
comprobando que no hubo oxidación del
ion ferroso, se concluye que el agua no
influye en la oxidación y la enzima es la que
causa la oxidación

3. Fosforilación oxidativa
a) Calcule la concentración de los tubos, la curva patrón de fosfato de potasio monobásico en
cada tubo en mM y complete el siguiente cuadro:
𝐶1 𝑉1
C1V1=C2V2 𝐶2 = 𝑉2

(1𝑚𝑀)(0.5𝑚𝐿)
Tubo 1: 𝐶2 = = 0.1 𝑚𝑀
5 𝑚𝐿

*Los cálculos para la concentración de fosforo inorgánico en los demás tubos se realizó de la
misma manera.
Tubos Fosfato de potasio monobásico 1mM Absorbancia Concentración de fósforo inorgánico
(mL) (mM)
1 0.5 0.062 0.1
2 1.0 0.107 0.2
3 1.5 0.114 0.3
4 2.0 0.129 0.4
b) Elabore la curva patrón de fosforo inorgánico, graficando absorbancias vs concentración
(mM).
Universidad Autonóma de San Luis Potosí
Facultad de Ciencias Químicas
Laboratorio de Bioquímica Metabólica
Práctica No. 5
0.13 Absorbancia vs Concentración de fosforo inorgánico (mM)

0.12

0.11
Absorbancia

0.1

0.09
0.088

0.08

Concentración de fósforo
0.07
Absorbancia
inorgánico (mM)
0.069
0.1 0.062
0.2 0.107
0.3 0.114
0.4 0.129
0.06 0.1519
0.1154
0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45
0.1364 Concentración (mM)
c) Obtenga la concentración de fosforo inorgánico libre por acción de la ATPasa en cada tubo
problema (interpolando o por regresión lineal). Utilizando la curva patrón de fosfato de potasio
monobásico y complete el siguiente cuadro:

Tubos Absorbancia Concentración de fósforo inorgánico (mM)

1 0.081 0.1364mM
2 0.088 0.1519mM
3 0.069 0.1154mM

4. Discuta los resultados obtenidos en el experimento de succinato deshidrogenasa,

citocromo oxidasa y fosforilación oxidativa.
Los resultados obtenidos concuerdan con la teoría vista previa a la práctica, para el experimento
con la Succinato Q- deshidrogenasa, esperábamos que el azul de metileno se redujera en
presencia de la enzima y el succinato se oxidara, pero por acción del ambiente el azul de
metileno se podía oxidar de nuevo, por esto en el tubo de ensaye que contenía la enzima,
succinato, azul de metileno y aceite se observó una decoloración por la reducción del azul de
metileno, pero en el que tenía lo mismo a excepción del aceite, como se esperaba se oxidó
nuevamente, y por último en el tubo que no contenía enzima mantuvo la coloración del azul de
metileno ya que se conservó en su forma oxidada. Para el experimento con la citocromo
oxidasa, se preparó un tubo de ensaye con la enzima y con P-fenilendiamina, se esperaba que
la enzima oxidara a la P-fenilendiamina, ya que esta actuaría como Fe+2 y se oxidaría a Fe+3,
por lo que observamos un cambio de coloración a café oscuro indicando que el Fe+2 se oxidó a
Fe+3. También se prepararon dos tubos más, a uno se le adicionó cianuro de potasio ya qué
este es un inhibidor de la Citocromo oxidasa por lo que se observó un cambio mínimo de
coloración a café, en ultimo tubo solo se coloco el sustrato por lo que no hubo cambios en la
muestra. Para el experimento con ATPasa, se esperaba que en el tubo con la enzima y ATP la
absorbancia fuera mayor, ya que esta ATPasa hidroliza al ATP y la absorbancia mediría la
cantidad de fosforo inorgánico formado, en el caso del tubo que solo tenía la enzima se
esperaba una baja absorbancia por si en el medio se encontraba una pequeña cantidad de ATP
no conocida y por último en el tubo que solo tenía Tris HCl esperábamos una absorbancia muy
baja ya que sin la enzima no se puede formar fosforo inorgánico, y los resultados concordaron
con éstas predicciones.

5. Escriba sus conclusiones

Se cumplieron los objetivos de la práctica, observamos la actividad de la Succinato

deshidrogenasa y la Citocromo oxidasa por medio de reacciones de óxido-reducción; la
succinato deshidrogenasa además de ser una enzima de la cadena respiratoria es la enzima
que cataliza la oxidación de Succinato a Fumarato en el ciclo de Krebs, por lo que en el
experimento se utilizó como sustrato Succinato y para observar la actividad de la enzima se
utilizó azul de metileno el cual tiene como característica que cuando se encuentra reducido
pierde su coloración azul, por ello fue posible observar la actividad de la succinato
deshidrogenasa. Como observamos en este experimento el azul de metileno se redujo, pero
en la cadena respiratoria, estos protones son liberados al medio, lo que genera una diferencia
de potencial electroquímico e impulsa la síntesis de ATP, por ello se dice que actúan como
bombas de protones. La Citocromo oxidasa oxida el Citocromo c reducido con la reducción de
O2 a dos moléculas de agua, por ello se utilizó P-fenilendiamina para oxidarla a Fe+3, que
también se observó con un cambio de coloración a café. Por último, se observó la actividad de
la ATPasa que es la enzima que se encarga de la síntesis de ATP al final de la cadena
respiratoria por el flujo de protones, pero también puede hidrolizar ATP, por lo que en la
práctica se observó su actividad hidrolítica, de forma que se midió la absorbancia por fosforo
inorgánico producido en la hidrolisis del ATP.
El ATP es la moneda de energía de la célula, y gran parte de este ATP se obtiene de los
procesos catabólicos, de todos los procesos catabólicos que se llevan a cabo en el organismo
humano se estima que el 90% de esta energía libre se obtiene de la fosforilación oxidativa en
la cadena respiratoria, por lo que el que se lleve a cabo de forma adecuada es de suma
importancia. Como se observó en el experimento de la Citocromo oxidasa, el cianuro de
potasio inhibió la actividad de la enzima, si lo relacionamos con la vida, el que una persona se
intoxique con cianuro podría causar su muerte ya que al inhibir la enzima también inhibe la
cadena respiratoria, así como la intoxicación por fármacos como amobarbital que es un
inhibidor de la fosforilación oxidativa.

Bibliografía:

Rodwell V. W., Bender D.A., Botham K. M., Kennelly P. J., Weil P. A. (2018). Harper Bioquímica
Ilustrada. 31aedición. México: Mc Graw Hill Education.