CONTENIDO TEMÁTICO

LABORATORIO CLÍNICO N° III

1. MICROBIOLOGÍA
2. EL CONTROL DE CALIDAD
3. TINCIÓN DE GRAM
4. TINCIÓN DE WRIGHT
5. TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN
6. TINCIÓN NEGATIVA
7. TINCIÓN DE AZUL ALGODÓN DE LACTOFENOL
8. RECUENTO DE RETICULOCITOS Y PLAQUETAS
9. LEUCOGRAMA
10. CRITERIOS PARA EL DESARROLLO DE UN LEUCOGRAMA
11. ALTERACIONES ERITROCITARIAS
12. ALTERACIONES EN LA FORMA
13. ALTERACIONES DE COLOR
14. INCLUSIONES ANORMALES
15. ANEXO A: PREPARACIÓN DE COLORANTES Y SOLUCIONES
MÁS USADOS EN HEMATOLOGÍA
16. ANEXO B: PREPARACIÓN DE ANTICOAGULANTES

Hojas de texto reproducidas con fines de Capacitación

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 MICROBIOLOGÍA

Las tinciones en microbiología son las primeras herramientas que se utilizan en el

laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Desde hace más
de un siglo han ayudado a resolver problemas de etiología microbiana. Hay una
gran variedad de tinciones, que se han ido desarrollando para la detección de los
diferentes agentes infecciosos –en los que se incluyen bacterias, parásitos y
hongos–.

La tinción de Gram se considera básica en la valoración inicial de muestras para

análisis bacteriológico, mientras que la tinción de Wright se ocupa para el
diagnóstico de enfermedades muy particulares en el rubro de la parasitología. Hay
técnicas tintoriales específicas de gran utilidad, como la tinción de Ziehl-Neelsen,
que se utiliza para el diagnóstico de enfermedades crónicas como la tuberculosis o
la actinomicosis, o la tinción de azul de lactofenol, que preserva e identifica a los
componentes estructurales de los hongos.

Las diferentes tinciones en el laboratorio microbiológico tienen una utilidad

fundamental para el diagnóstico y tratamiento oportuno de múltiples patologías de
etiología infecciosa.

En microbiología el microscopio se utiliza de forma rutinaria, ya que proporciona

importante información para la identificación temprana y definitiva de los
microorganismos. En la valoración de las muestras, es trascendente el poder de
resolución del microscopio, el cual se define como la capacidad que posee un
objetivo para distinguir la distancia mínima entre dos puntos del objeto para que se
puedan visualizar como dos puntos separados.

El poder de resolución de un objetivo es el responsable de la calidad, claridad,

nitidez y fineza detallada de la imagen, y depende de la longitud de onda (λ) del haz
de luz utilizado y de la apertura numérica del objetivo empleado. El máximo poder
de resolución en un microscopio de luz emitida es de 0.2 μm, por lo que se requiere
de una amplificación entre 1000-1400x, mientras que el poder de resolución del
ojo humano es de aproximadamente 0.2 mm.

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Para aprovechar esta ventaja de los microscopios, se han desarrollado técnicas
tintoriales que destacan las características morfológicas de los microorganismos.
Existe una gran variedad de tinciones que pueden ser aplicadas dentro del campo
de la microbiología.

Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a células, tejidos,
fibras, etcétera. De acuerdo con su origen, se pueden dividir en: colorantes
naturales, los cuales son extraídos de plantas o animales, y colorantes artificiales,
que son aquellos de minerales procesados y manipulados en el laboratorio.

Químicamente, el colorante está constituido de un componente cromóforo y un

auxócromo. El cromóforo es todo grupo aislado, covalente e insaturado, que tiene
una absorción característica en la región ultravioleta o visible; dicho de otra forma,
es la capacidad que tiene la molécula para que sus electrones absorban energía o
luz visible, se exciten y emitan diversos colores de acuerdo con la longitud de
emitida como resultado del cambio en el nivel energético. Cabe mencionar que
esta longitud de onda corresponde al rango de espectro visible.

Los cromóforos se pueden presentar en dos formas fundamentales: en sistemas

conjugados pi o complejos metálicos. Los cromóforos son principalmente grupos
funcionales con dobles y triples enlaces carbono-carbono, anillos aromáticos,
grupos carbonilos, imino, diazo, nitro y enlaces entre carbono-y (y es un átomo con
pares libres).Los auxócromos son grupos funcionales o radicales que constituyen
una molécula y poseen carga parcial positiva; tienen la función de intensificar la
formación de color mediante la acción de grupos de átomos no saturados; su
función es desplazar a los cromóforos hacia longitudes de ondas largas para
aumentar la intensidad.

Los siguientes grupos funcionales son considerados auxócromos: grupo metilo,

halógenos, hidroxi, alcoxi y amino. Aunque los microorganismos vivos se pueden
observar directamente en fresco al microscopio óptico, la mayoría de las veces es
necesario teñirlos para que por medio del uso de colorantes, sea mucho más fácil
su identificación; además, la presencia de ciertas estructuras, así como su reacción
a determinadas técnicas, nos permite clasifi car a las bacterias. Así pues, los
colorantes tienen las siguientes funciones:

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 1. Permiten hacer visibles a los objetos microscópicos y transparentes.
2. Revelan su forma y tamaño.
3. Muestran la presencia de estructuras internas y externas.
4. Producen reacciones químicas específicas.

Las tinciones se pueden clasificar como simples cuando toda la muestra se tiñe del
mismo color y se utiliza un sólo colorante (azul de lactofenol o tinta china); tinción
diferencial, cuando se visualiza más de un color porque se utiliza más de un
colorante (Gram o Ziehl-Neelsen); tinción específica, cuando se utilizan anticuerpos
marcados con una molécula fluorescente para identificar una estructura celular en
particular (inmunocitoquímico).

EL CONTROL DE CALIDAD

El control de calidad de los métodos tintoriales es importante, ya que así se

asegura que la preparación de la muestra haya sido adecuada, por lo que se
recomienda realizar al mismo tiempo de la evaluación de la muestra clínica, la
tinción de un agente infeccioso ya identificado mediante esa tinción, el cual
funcionará como un control positivo.

Algunas técnicas tintoriales como Gram o Ziehl-Neelsen requieren antes de su

proceso la fijación de las muestras, con la finalidad de preservar la arquitectura
estructural y química de las células.

Existen dos tipos de fijadores: físicos y químicos. Entre los procesos de fijación
físicos se tienen los siguientes: desecación, calor seco, calor húmedo, ultrasonido y
microondas, mientras que los procesos de fijación químicos se pueden clasificar
como oxidantes y reductores, de acuerdo con sus propiedades químicas.

Entre los agentes químicos oxidantes se encuentran: óxido crómico, ácido acético,
ácido pícrico, acetona, dicromato de potasio. Los agentes químicos reductores son:
formaldehído, glutaraldehído, etanol, metanol, paraldehído, etcétera.

Quizá el método físico con mayor utilización en microbiología es el calor seco, que
consiste en exponer directamente la laminilla a la flama del mechero, con esto se

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logra detener los procesos vitales de las células y los microorganismos. Sin
embargo, la sobreexposición, o la exposición en una zona incorrecta de la flama
(zona fría, zona caliente y zona de fusión) repercutirán en el efecto deseado; es
muy común provocar alteraciones morfológicas y destrucción celular.

Este método preserva el extendido por poco tiempo, por lo que se recomienda
utilizar un método químico, que precipite proteínas, antes de teñir. Los métodos
químicos ofrecen mejores resultados para la fijación, ya que son líquidos con
potencial alto de difusión intracelular y detienen procesos enzimáticos que
provocan autolisis. Los reactivos poseen la capacidad de interactuar con
biomoléculas como proteínas, glicoproteínas, peptidoglicanos, lípidos, glicolípidos,
lipoproteínas, pigmentos, ácidos pécticos y nucleicos.

El metanol es el reactivo que se encuentra al alcance de todos los laboratorios; es

un reactivo reductor, deshidratador, y es clasificado como fijador coagulante, de tal
manera, coagula proteínas y las hace insolubles, pero sin desnaturalizarlas. Se
preserva la arquitectura de la pared celular y evita la sobrecoloración. El metanol
tiene un potencial reductor mayor que el etanol. La concentración ideal es > 99%.

El metanol preserva la integridad de los ácidos nucleicos, por lo que también es

ideal para inmunohistoquímica e hibridación in situ.

A continuación se mencionarán las principales técnicas de tinción utilizadas en

microbiología, así como su fundamento e interpretación para realizar la correcta
identificación de los microorganismos.

TINCIÓN DE GRAM

Esta tinción es un procedimiento de gran utilidad empleado en los laboratorios

donde se manejan pruebas microbiológicas. Es definida como una tinción
diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifica a las bacterias en dos grandes
grupos: bacterias Gram negativas y bacterias Gram positivas. Fue desarrollada por
el científico danés Hans Christian Gram en 1884; hoy en día, sigue siendo una de las
tinciones más utilizadas universalmente debido a lo económico, sencillo y eficaz
que resulta.

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En microbiología clínica resulta de gran utilidad, ya que a partir de muestras clínicas
directas provenientes de sitios estériles se puede saber de manera rápida las
características de la muestra y hacer una diferencia de los potenciales
microorganismos causantes de una infección. Los principios de la tinción de Gram
están basados en las características de la pared celular de las bacterias, la cual le
confiere propiedades determinantes a cada microorganismo.

La pared celular de las bacterias Gram negativas está constituida por una capa fi na
de peptidoglicano y una membrana celular externa, mientras que las bacterias
Gram positivas poseen una pared celular gruesa constituida por peptidoglicano,
pero no cuentan con membrana celular externa; así pues, la composición química y
el contenido de peptidoglicano en la pared celular de las bacterias Gram negativas
y Gram positivas explica y determina las características tintoriales (Figura 1).

La tinción de Gram se basa en colocar como colorante primario cristal violeta, el

cual tiene afinidad con el peptidoglicano de la pared bacteriana. Posteriormente, se
coloca lugol, el cual sirve como mordiente e impide la salida del cristal violeta por la
formación de un complejo cristal violetayodo que satura los espacios del
peptidoglicano de la pared bacteriana. En seguida, se coloca una mezcla de alcohol-
acetona, la cual deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros de la misma,
también destruye la membrana externa de las bacterias Gram negativas debido a
que ésta es soluble a la acción de solventes orgánicos, como la mezcla de
alcoholacetona.

Las bacterias Gram positivas, al contener una gran cantidad de peptidoglicano,

retienen con mayor fuerza este complejo, mientras que las Gram negativas no lo
pueden retener por tener menos cantidad de peptidoglicano. Por último, se coloca
safranina, la cual funciona como un colorante secundario o de contratinción y sirve
para teñir las bacterias que no pudieron retener el complejo cristal violeta-yodo.

Hay bacterias de un mismo género que pueden observarse en la misma muestra

como Gram positivas y como Gram negativas, a este evento se le llama tinción
Gram variable secundaria a alteración en nutrientes, temperatura, pH o
concentración de electrolitos. No todas las bacterias se pueden teñir por esta
técnica, ya que carecen de pared celular (micoplasma) o su pared celular tiene una

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composición química diferente (micobacterias, que cuentan con una gran cantidad
de ácidos micólicos). Las muestras útiles para su uso son líquidos estériles, biopsias
para cultivo, abscesos, hisopados, crecimiento de colonias aisladas en medios de
cultivo. Las bacterias Gram positivas se observan de color azul obscuro a morado,
mientras que las Gram negativas se observan de color rosa a rojo (Figura 2).

TINCIÓN DE WRIGHT

La tinción de Wright es una técnica que se emplea generalmente para la

diferenciación de elementos celulares de la sangre y es clasificada como una
tinción policromática, dado que puede teñir compuestos ácidos o básicos presentes
en una célula.20 Fue desarrollada por el patólogo James Homer Wright en 1902 a
partir de la modificación de la ya existente tinción de Romanowsky,

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utilizada para diferenciar elementos formes de la sangre. Esta tinción tiene diversos
usos en microbiología; en la parasitología, se le emplea en la búsqueda de
hematozoarios como Plasmodium spp. El reactivo de Wright está compuesto por
eosina y azul de metileno, cuando éste se oxida se conoce como azur B a una
concentración de 0.8 g/L empleando como solvente alcohol metílico. La eosina es
un colorante ácido que tiene afinidad por componentes alcalinos. Existen dos
compuestos conocidos como eosina y que están intrínsecamente relacionados:
eosina Y, conocida también como tetrabromofluoresceína –o, comúnmente, eosina
amarilla–, y la eosina B, conocida como dibromodinitrofluoresceína o eritrosina B
azulada.

Ambos compuestos son intercambiables, sin que sean notables las diferencias
entre ellos en el resultado de la tinción, por lo que la preferencia de una sobre otra
no sigue un criterio objetivo. A pesar de ello, la eosina Y es la más utilizada en
procedimientos rutinarios.

Es un compuesto ácido cuya propiedad está basada en su polaridad negativa, lo

que le permite enlazarse con constituyentes celulares de carga positiva; por esta
razón, colorea componentes citoplasmáticos y se les conoce como acidófilos. La
tonalidad resultante de la tinción con eosina es rosada-anaranjada para
citoplasmas, y rojo intenso en el caso de los eritrocitos. El típico color de los
núcleos celulares, mayoritariamente morado, se basa en la interacción molecular
entre eosina y un complejo azul de metileno-DNA. La intensidad de la coloración
depende del contenido de azur B y de la relación con la eosina amarilla.

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El resultado de la tinción puede ser influido por diferentes factores, como el valor
del pH de los colorantes y de la solución amortiguadora, esto debido a que la
tinción se fundamenta en la relación de las características ácido-base, y la variación
de estos factores podría cambiar las características tintoriales de la muestra a teñir
al verse favorecida por características más ácidas o básicas.

Las muestras útiles para su uso son el frotis de sangre periférica y frotis de médula
ósea. Los diferentes colores que se observan en la célula provocan el llamado
efecto Romanowsky, que tiñe de púrpura a los núcleos y gránulos neutrofílicos y de
color rosa al citoplasma. Los ácidos nucleicos se tiñen de azul, permitiendo así
distinguir a los parásitos en el interior de los eritrocitos. Esta tinción es utilizada en
la búsqueda de Plasmodium spp. (en México, principalmente, Plasmodium vivax),
Leihsmania spp., (principalmente Leishmania mexicana), Trypanosoma cruzii, y en
la búsqueda intencionada de filarias (Figura 3). En micología, esta tinción es de gran
ayuda en la búsqueda de Histoplasma capsulatum (hongo dimórfico) en extendidos
de médula ósea.

TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN

La tinción de Ziehl-Neelsen es la técnica comúnmente usada en el diagnóstico

rutinario de tuberculosis. Es una técnica rápida, fácil y de bajo costo, lo que permite
que se pueda realizar en casi cualquier laboratorio clínico. Esta tinción permite
diferenciar a las bacterias en dos grupos: aquellos que son capaces de resistir la
decoloración con alcohol-ácido y aquellos que no lo son. La sensibilidad de esta
tinción para identificar bacilos ácido-alcohol resistentes es del 74% y la
especificidad del 98%, teniendo un límite de detección de 5,000-10,000 bacilos/mL
de muestra.

El agente etiológico de la tuberculosis fue descrito por Heinrich Hermann Robert

Koch, quien, basándose en las características de las micobacterias, desarrolló una
de las primeras tinciones utilizando azul de metileno seguido de la tinción de
Bismarck. Sin embargo, fueron los trabajos de Paul Ehrlich los que definieron la
resistencia a la decoloración por alcohol-ácido, y las últimas modificaciones a la
tinción fueron realizadas por los científicos alemanes Franz Ziehl y Karl Adolf
Neelsen. El género Mycobacterium es el único miembro en la familia
Mycobacteriaceae y está relacionado con otros géneros que contienen ácidos

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micólicos Gordonia, Tsukamurella y Rhodococcus), los cuales también pueden ser
teñidos con esta tinción. La pared celular de las micobacterias es extremadamente
compleja en cuanto a su composición bioquímica; dicha característica es la que se
ha aprovechado para realizar la tinción de Ziehl-Neelsen. La pared celular está
compuesta por ácido mesodiaminopimélico, alanina, ácido glutámico, glucosamida,
ácido murámico, arabinosa y galactosa (Figura 4).

Los ácidos micólicos (70-90 número de átomos de carbono) junto con lípidos libres
(ej. trealosa-6,6´-dimicolato) proveen a la célula de una barrera hidrofóbica. Otros
ácidos grasos importantes son: ceras, fosfolípidos, ácidos micoséricos y phtienoico.

La tinción se basa en colocar carbol-fucsina y calentar la preparación ligeramente

para solubilizar las ceras, lípidos y otros ácidos grasos de la pared celular para que
permita el paso libre del colorante, el cual tiene una enorme afinidad por los ácidos
micólicos presentes en la pared. Al enfriar con agua, los componentes de la pared
vuelven a solidificar, resistiendo la acción abrasiva del alcohol-ácido, y el azul de
metileno se utiliza como contratinción (Figura 5). Las muestras clínicas útiles para
su uso son múltiples, como el líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido
sinovial, líquido pericárdico, biopsias para cultivo, abscesos, aspirados, crecimiento
de colonias aisladas en medios de cultivo, expectoraciones, aspirados

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endotraqueales y lavados bronquioalveolares. Una tinción positiva es aquélla en la
que se observan bacilos ácido-alcohol resistentes, los cuales son de color rojo
fucsia. La evaluación y reporte de las laminillas se realiza de acuerdo al cuadro I.

TINCIÓN NEGATIVA

La tinción negativa fue desarrollada originalmente para microscopia de luz con el

fin de rodear y delinear las bacterias no teñidas u otros materiales biológicos.
Utilizamos diferentes métodos de tinción negativa para evaluar estructuras
individuales, tan pequeñas como las vesículas sinápticas e incluso de gran tamaño,

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como los microorganismos unicelulares. Este método es muy útil, aunque está
limitado por la presencia de un fondo oscuro que no permitirá la correcta
identificación de forma nítida y detallada de los componentes de dichas
estructuras. En microbiología, la tinción negativa proporciona un resultado
presuntivo de la presencia de Cryptococcus neoformans, microorganismo causante
de meningitis en pacientes con inmunosupresión, siendo la técnica más utilizada
para poner de manifiesto su cápsula. Este hongo presenta dos formas durante su
ciclo vital: una forma asexual y una forma sexual; en la primera se presenta como
levaduras encapsuladas que se reproducen por gemación y puede ser visualizada
por medio de la tinta china.

El principio es simple, ya que sólo se requiere depositar una gota de la muestra

clínica sobre un portaobjetos, posteriormente se coloca el colorante y se observa al
microscopio sin necesidad de fijación, algunas estructuras difundirán el colorante y
otras no, lo que permitirá un contraste de las estructuras observadas. Se han
utilizado diferentes colorantes: uno de ellos es la mencionada tinta china, la cual
tiñe el fondo de la muestra de un color oscuro y la cápsula del C. neoformans
permanece sin teñir.

La principal dificultad con la tinción negativa es que los microorganismos tienden a

contraerse durante el periodo de secado; para evitarlo, se ha optado por usar la
tinción negativa húmeda, en la cual los organismos se suspenden en una película
de tinta china o mancha oscura y el contorno de la cápsula puede ser observado sin
el peligro de contracción.

Además de ser una técnica sencilla, es muy barata, ya que no requiere equipos o
material costoso para su realización. Pueden producirse falsos positivos en

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presencia de levaduras de los géneros Rhodotorula, Candida y otras especies de
Cryptococcus, igual que por artificios como los leucocitos. Es importante
diferenciar bien la levadura con doble pared refringente, con su cápsula, y siempre
hay que confirmar el diagnóstico inicial con cultivo. En los pacientes con
diagnóstico previo de criptococosis que se encuentren bajo tratamiento, es
probable que la cápsula no se observe, ya que el tratamiento antifúngico está
dirigido hacia ésta; sin embargo, pueden observarse estructuras levaduriformes.

Además de proporcionar información temprana sobre un microorganismo

patógeno y propiciar así el inicio del tratamiento adecuado, se considera un
examen útil para la monitorización del tratamiento y pronóstico de los pacientes.
Se recomienda utilizar como control negativo una gota de tinta china y colocarle un
cubreobjetos; esto permitirá discernir entre burbujas formadas al agregar el
cubreobjetos o el acúmulo de partículas que podrían crear una zona de
aclaramiento que pudiera confundir al realizar la revisión de las laminillas.

Durante el procedimiento de la tinción se deben tener precauciones, por lo que se

debe realizar en una campana de bioseguridad 2A. La muestra más útil para su
aplicación es el líquido cefaloraquídeo, por la predisposición que tiene este hongo
en los pacientes inmunosuprimidos para infectar el sistema nervioso central. La
cápsula aparece como un halo claro y nítido en torno a una levadura redonda,
delimitada por las partículas de carbón en suspensión coloidal de la tinta china,
exhibiendo un nítido contraste (Figura 6).

TINCIÓN DE AZUL ALGODÓN DE LACTOFENOL

El examen microscópico es de gran importancia en micología para la observación

de las diferentes especies de hongos de interés clínico. Se deben utilizar tinciones
que logren preservar la integridad de las estructuras fúngicas. Para la correcta
identificación de hongos de interés clínico, ya sea con fines de diagnóstico o
estudios taxonómicos, es necesario observar las estructuras fúngicas con una alta
calidad y contraste; para ello se utilizan diversos compuestos químicos que
permitan la tinción entre la pared y el citoplasma de las células fúngicas. La tinción
de azul algodón de lactofenol no es considerada una tinción diferencial, sin
embargo, posee características tintoriales que permiten observar cada uno de los

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componentes fúngicos y apreciar fácilmente las estructuras para una adecuada
identificación. El fenol inactiva las enzimas líticas de la célula e impide que ésta se
rompa; de igual forma, destruye la flora acompañante e inactiva a la célula,
quitándole el grado de patogenicidad; además, actúa como mordiente cuando se
usa en combinación con colorantes. El ácido láctico preserva las estructuras
fúngicas al provocar un cambio de gradiente osmótico con relación al interior
fúngico, lo que genera una película protectora. El azul de algodón es un colorante
ácido, que tiñe el citoplasma y la quitina presente en las células fúngicas, mientras
que el glicerol mantiene húmeda la preparación.

Una vez preparado el colorante, se debe colocar la muestra microbiológica en un

portaobjetos por medio de una impronta (proceso en el cual se coloca una
impresión de la muestra sobre una estructura utilizando una cinta adhesiva
transparente).

Preparación de la impronta

1. Colocar el material necesario en la campana de seguridad tipo 2A.

2. Seleccionar las colonias para realizar las improntas.
3. Cortar segmentos de cinta adhesiva transparente aproximadamente de 1
cm2.
4. Pegar los segmentos de cinta en un asa micológica.
5. Poner una gota de azul de algodón en el portaobjetos.
6. Con el lado adhesivo de la cinta, tocar la parte superior de hongo.
7. Colocar la cinta sobre la gota de azul de algodón y poner otra gota de azul de
algodón.
8. Poner un cubreobjetos sobre la preparación.
9. Observar en 40x. Ver Figura 7.

La manipulación de los hongos filamentosos siempre debe llevarse a cabo en una

campana de seguridad tipo 2A, ya que la mayoría de éstos son patógenos, y realizar
una técnica inadecuada puede poner en riesgo al personal. Cuando se identifique la
presencia de un hongo filamentoso, se sugiere realizar el pase a una placa en
medio dextrosa Sabouraud, para poder realizar una mejor manipulación e

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identificar con mayor facilidad las características macroscópicas, tanto en la parte
anterior como posterior de la placa.

Se debe realizar la impronta con cuidado de no oprimir demasiado las estructuras,

ya que se pueden dañar. Una vez hecha se debe realizar su pronta lectura, ya que
en muchos casos la formación de esporas o conidias es muy importante para la
identificación, y en ocasiones es difícil la observación en cultivos viejos o
demasiados jóvenes.

En algunas ocasiones sólo se llegan a observar hifas sin lograr definir otras
estructuras (cultivos jóvenes, se observan micelios infértiles), por lo que se
recomienda someter al hongo a condiciones donde no se favorezca su crecimiento,
como por ejemplo, el uso por corto tiempo de luz UV (para hongos productores de
pigmento) o la siembra en medios con pocos nutrientes, como agar-agua, agar
dextrosapapa, agar hojuelas de maíz (cornmeal, en inglés), e incluso utilizar un
soporte de celulosa, como papel filtro estéril, esto favorece la conidiación y
esporulación.

Es de suma importancia apoyarse de un atlas micológico para la interpretación

microscópica. Muestras útiles para su uso son los hongos filamentosos aislados en

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medios de cultivo. Las estructuras fúngicas se observarán de color azul sobre un
fondo blanco (Figura 8).

Conclusiones

Las tinciones utilizadas en el laboratorio de microbiología permiten el diagnóstico

oportuno y sugerente de los agentes infecciosos, por lo que juegan un papel
importante en la decisión del tratamiento inicial de las enfermedades infecciosas.
Se debe practicar la tinción adecuada de acuerdo con el agente infeccioso en
sospecha y el tipo de muestra clínica. Las tinciones son herramientas elementales,
vigentes y de uso universal que coadyuvan al diagnóstico microbiológico.

RECUENTO DE RETICULOCITOS Y PLAQUETAS

1. RECUENTO DE RETICULOCITOS

Los reticulocitos son glóbulos rojos inmaduros formados por ARN y protoporfirina
en el citoplasma.

FUNDAMENTO

Los reticulocitos contienen una fina red de ARN y protoporfirina que se puede teñir
con el azul de cresil brillante. Este colorante en combinación con una misma
cantidad de sangre anticoagulada se mezcla y con la ayuda de la temperatura (baño

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 maría) se produce la coloración de estos eritrocitos jóvenes visualizándose en los
frotices sanguíneos por microscopía.

MATERIALES:

  Láminas portaobjetos.
  Tubos de ensayos de 12 x 75 mm.
  Embudo.
  Filtro de papel.
  Pipetas Pasteur con chupones.
  Contador manual (no imprescindible).
 Solución saturada de azul de cresil brillante (filtrada).

PROCEDIMIENTO:

 En el tubo de ensayo colocar dos gotas de sangre total con anticoagulante.


 Inmediatamente adicionar con la ayuda de una pipeta Pasteur la misma
 cantidad de colorante.
  Mezclar la solución.
  Se coloca luego en baño maría por espacio de 10 a 15 minutos.
  Se realizan frotices sanguíneos.
 Se lee con objetivo de 100x.

RESULTADOS:

Examine por lo menos 100 eritrocitos con el objetivo de inmersión. Cuente

cuidadosamente:

  Cantidad total de glóbulos rojos.

 Número total de reticulocitos que haya entre ellos.

El recuento se ha venido haciendo clásicamente de forma manual mediante la

observación en el microscopio óptico. El resultado se da en porcentaje sobre cada
100 hematíes. Es más útil calcular el número de reticulocitos por litro, mediante la
fórmula:

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OBSERVACIÓN:

En la actualidad existe la posibilidad de hacer el recuento rutinario de forma

automática, mediante aparatos específicamente diseñados al respecto, bien a
través de adaptaciones de los clásicos autoanalizadores para hemogramas. En estos
casos se puede conocer, además, las distintas proporciones de reticulocitos según
su grado de maduración, su volumen medio y el índice de maduración.

VALORES DE REFERENCIA:

Adultos 0,5 - 1,5%

Al nacer 2,5 - 6,0%

CAUSAS DE AUMENTO:

El número de reticulocitos aumenta en todas las circunstancias en las que existe un

incremento de la eritropoyesis, tales como en la hemólisis, como respuesta a
sangrados o tras el inicio de un tratamiento antianémico que ha resultado eficaz.

CAUSAS DE DISMINUCIÓN:

Como la producción de reticulocitos es necesaria para compensar las pérdidas

fisiológicas de glóbulos rojos maduros, una disminución de su número es la
expresión de un estado arregenerativo o hiporregenerativo de la serie roja. Esta
circunstancia es típica de anemias aplásicas, anemias carenciales y enfermedades
inflamatorias y neoplásicas.

2. RECUENTO DE PLAQUETAS

El recuento de plaquetas se realiza directamente en un microscopio de contraste

de fases, previa lisis de los hematíes, o también se puede observar en un
microscopio convencional.

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 RECUENTO EN CÁMARA

MATERIALES

  Hemocitómetro o cámara de Neubauer.

  Solución de procaína (Anexo A).
  Pipetas automáticas de 100 a 1000 mL y 0 a 100 mL.
  Cámara húmeda.
  Tubos de plástico de 12 x 75.
 Microscopio convencional.

MÉTODO:

 Mezclar bien la muestra de sangre obtenida con EDTA.


 Hacer una dilución de 20 uL de sangre total con 380 uL de solución de
 procaína en un tubo de plástico de 12 x 75 (dilución 1/20).
  Dejar en reposo por 15 minutos en una gradilla.
  De esta dilución, llenar en cámara de Neubauer.
 Dejar en reposo por 15 minutos en cámara húmeda.

 Enfocar con objetivo de 45x y contar las plaquetas en el retículo central de
1mm2 cuadrado.

 Calcular el número total de plaquetas según la fórmula que se lee a
continuación:

RESULTADOS: Se aplica la siguiente fórmula:

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 VALORES DE REFERENCIA:
150 000 - 450 000 plaquetas/mm3

RECUENTO EN LÁMINA

Se cuentan 10 campos con objetivo de 100x y se multiplica por 1000 que es la

fórmula convencional para recuento de plaquetas.

VALORES DE REFERENCIA:
150 000 - 450 000 plaquetas/mm3

CAUSAS DE AUMENTO (TROMBOCITOSIS)

 La trombocitosis puede ser secundaria a un estímulo medular inespecífico

(posthemorrágica o tras una crisis hemolítica), paraneoplásica o
posquirúrgica. Es especialmente importante la que se produce tras la
esplenectomía.

 La trombocitopenia esencial aislada es muy rara, pero puede aparecer
asociada a trastornos mieloproliferativos. En estos casos, las plaquetas
pueden ser funcionalmente inoperantes y cursar, paradójicamente, con
hemorragias.

CAUSAS DE DISMINUCIÓN (TROMBOPENIA)

 Es fundamental descartar que no se haya producido un error de lectura

como consecuencia de una agregación parcial de las plaquetas en la muestra
estudiada. Especialmente llamativos son los casos en los que existe una
agregación precisamente en presencia de EDTA, que es el anticoagulante
utilizado para mantener incoagulable la muestra de sangre en la que se ha
de realizar la lectura.

 Las verdaderas trombopenias pueden obedecer a una causa central
(generalmente asociada a leucopenia y anemia), periférica (inmunológica,
secuestro, consumo) o mixta (vírica). La púrpura trombocitopénica
idiopática es relativamente frecuente.

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 LEUCOGRAMA

Los leucocitos de dividen en:

1. GRANULOCITOS

Aquellos que tienen gránulos específicos: neutrófilos, eosinófilos y basófilos. Los

gránulos observados en extendido están cargados de lisosomas y enzimas
hidrosolubles que son agentes antibacterianos necesarios para la digestión de
partículas fagocitarias. Aquí tenemos:

1.1. Neutrófilos

Neutrófilos abastonados (Fig. 1)

Es el granulocito en banda. Mide de 10m a 14m, núcleo condensado que puede

presentar una ó dos constricciones, pero no tiene puente de cromatina. El
citoplasma presenta gránulos específicos e inespecíficos, membrana celular lisa,
citoplasma de color ligeramente rosado dependiendo de la coloración.

Neutrófilos segmentados (Fig. 2)

Mide igualmente de 10m a 14m, núcleo que presenta mayor condensación y está
formado por varios lóbulos (hasta 4) unidos por puentes de cromatina. El
citoplasma está cargado de gránulos.

Alteraciones leucocitarias de los neutrófilos

 Granulaciones tóxicas: Son gránulos basófilos más oscuros que lo normal y

se observan durante el transcurso de infecciones severas y estadios tóxicos.

 Vacuolas tóxicas (Fig. 4): Se observan en el citoplasma de los neutrófilos
durante infecciones severas y estados tóxicos.

 Cuerpos de Dohle (Fig. 5): Son áreas teñidas de azul en el citoplasma de los
polimorfonucleares neutrófilos y se encuentra en infecciones,
especialmente en neumonías.

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  Palillo de tambor (Fig. 6): Es un pequeño apéndice (cromatina sexual) que
permite conocer el sexo del individuo mediante una simple observación en
un frotis de sangre periférica en los neutrófilos. Se presenta en las mujeres.

 Polisegmentación (Fig. 7): Son neutrófilos con 5 o más lobulaciones. Se
observa en las anemias por deficiencia de vitamina B-12 y ácido fólico,
Síndrome de Down y otras anomalías.

Además existe aumento (neutrofilia) en:

  Infecciones bacterianas por agentes piogénicos.

  Abscesos y septicemias.
  Procesos inflamatorios y necrosis tisular.
  Trastornos metabólicos por intoxicación.
  Procesos malignos: Carcinoma.
  Hemorragias y hemólisis.
  Postesplenectomía.
 Desviación a la izquierda

Significa el aumento de las formas inmaduras (en banda o cayado, y juveniles)

dentro de los neutrófilos. Constituye un importante valor diagnóstico y pronóstico.
Puede observarse en: infecciones e intoxicaciones.

 Desviación a la derecha

Corresponde a la hipersegmentación nuclear. La mayoría de PMN presentan más

de 5 lobulaciones. Ocurre en:

  Anemia perniciosa.
  Hipersegmentación constitucional hereditaria.
  Reacciones mieloides de la sepsis.
  Afecciones hepáticas.
  Leucemia mieloide.
 En la agonía.

Existe disminución (neutropenia) en:

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  Aplasia medular
  Mieloptisis de la médula ósea
  Agentes citotóxicos
 Granulopoyesis inefectiva (anemias megaloblásticas).

1.1. Eosinófilos (Fig. 8)

Son parecidos a los neutrófilos, pero son algo mayores. Generalmente el núcleo es
bilobulado y lo que más caracteriza a esta célula es la presencia de gránulos color
naranja-marrón vistos claramente, muchas veces estos gránulos hacen que se
pierda la membrana celular por el rompimiento de ésta, ya que estas células son
muy frágiles.

Patología: Existe aumento en:

  Infecciones parasitarias.
  Reacciones alérgicas.
  Enfermedades cutáneas.
 Neoplasias.

1.2. Basófilos (Fig. 9)

La característica más importante de esta célula es la cantidad de gránulos de color

azul negruzco que se encuentra ocupando toda la célula (esto cuando la célula es
madura) y parte de la célula cuando ésta es inmadura. Presenta un núcleo que
muchas veces no logra observarse por la cantidad de gránulos que contienen
histamina y heparina.

Patología: Existe aumento en:

Leucemia por basófilos.

2. AGRANULOCITOS. }

No poseen gránulos. Aquí tenemos a los linfocitos y monocitos.

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 2.1. Linfocitos. Pueden ser:

- Linfocitos grandes.
- Linfocitos pequeños.

Linfocitos grandes (Fig. 11a)

Miden de 15m a 25m, presentan generalmente un núcleo ligeramente oval

discretamente indentado, la cromatina es densa pero no tanto como en el linfocito
pequeño (esto lo puede confundir con el monocito). Citoplasma abundante, azul
pálido y puede contener gránulos azurófilos inespecíficos.

Linfocitos atípicos (Fig. 12)

Llamados también virus linfocitos, células linfomonocitoides, células activadas de

Turk, células de Turk, virocitos, inmunoblastos, etc. Miden de 15m a 30m, núcleo
irregular, indentado, excéntrico y puede observarse nucleolos. El citoplasma es
amplio, color azul tenue, y puede presentar gránulos azurófilos y vacuolas.

Estas células pueden observarse en mononucleosis infecciosa, hepatitis viral,

herpes zoster, enfermedades autoinmunes y normalmente pueden hallarse hasta
en 5%.

 Linfocitos con mitosis o binucleados (Fig. 13)

Pueden encontrarse en enfermedades virales.


 Linfocitos vacuolados (Fig. 14)

En caso de linfocitos que reaccionan por efecto de la radiación ultravioleta o

respuesta a tratamientos de quimioterapia.

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  Linfocitos pequeños (Fig. 11b)

Miden de 9m a 15m, presentan un núcleo que ocupa casi toda la célula, excéntrico,
cromatina fuertemente densa. El citoplasma es escaso, basófilo y puede contener
gránulos azurófilos inespecíficos.

2.2. Monocitos (Fig. 10)

Son los leucocitos de mayor tamaño en la sangre (14m a 20m). Su núcleo es

generalmente excéntrico, aunque puede ser central.

Su cromatina nuclear es laxa, distribuida en forma regular, la forma del núcleo

generalmente es de una madeja de lana o arriñonada, aunque puede tener forma
de un abastonado. El citoplasma es de color gris y puede presentar gránulos
inespecíficos (azurófilos) que carecen de significado clínico.

Patología: Están elevados en:

  Tuberculosis.
  Endocarditis bacteriana.
  Enfermedades virales como sarampión, rubéola, etc.
 Colagenosis, neoplasias, etc.



3. CRITERIOS PARA EL DESARROLLO DE UN LEUCOGRAMA

- Se considera leucocitosis cuando la cifra de glóbulos blancos excede de 10

000.
- Se considera leucopenia cuando la cifra de glóbulos blancos es inferior a 5
000.
- No olvidar que el ejercicio produce leucocitosis fisiológica de consideración,
de allí que el recuento debe hacerse en condiciones basales.
- En los granulocitos debe informarse el número de lobulaciones del núcleo. A
mayor edad de la célula mayor el número de lóbulos y lo contrario.

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ALTERACIONES ERITROCITARIAS

Aquí se encuentran incluidas las células progenitoras de la serie roja que

normalmente se encuentra en la médula ósea, pero cuando éstas pasan a sangre
periférica antes de su maduración en normocitos o hematíes pueden indicar alguna
patología como leucemias, anemias u otras alteraciones celulares. Aquí tenemos:

PRONORMOBLASTO (Fig. 1a)

Es una célula primitiva (inmadura) de aproximadamente 25m a 35m de diámetro,

citoplasma basófilo, presencia de 1 a 2 nucleolos, existe una condensación ligera de
la cromatina, citoplasma ligeramente excéntrico. Esta célula se divide en:

NORMOBLASTO BASÓFILO (Fig. 1b)

Es ligeramente menor que el pronormoblasto, 12m a 18m, citoplasma igualmente

basófilo, pero, se diferencia del anterior en que ya no presenta nucléolos y su
cromatina nuclear es más condensada ya que es un elemento menos inmaduro. El
siguiente paso en la maduración es:

NORMOBLASTO POLICROMATÓFILO (Fig. 1c)

Es una célula que mide de 12m a 16m, aunque usualmente puede ser mayor que el
normoblasto basófilo, presenta núcleo excéntrico y lo que más caracteriza a esta
célula es que ya presenta pequeñas cantidades de hemoglobina citoplasmática que
se traduce en un color violeta (azul y rojo). Su cromatina es más condensada que la
anterior.

NORMOBLASTO ORTOCROMÁTICO (Fig. 1d)

Mide de 10m a 14m, esta célula es bien característica y no debe confundirse con el
linfocito ya que prácticamente es un hematíe nucleado, como también se le
conoce. Presenta su citoplasma rosado, núcleo totalmente excéntrico como una

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 bola maciza. Este normoblasto ya no se divide, sino que pierde su núcleo por un
mecanismo de expulsión y se convierten en:

RETICULOCITOS (Fig. 2)

Estos todavía presentan en su citoplasma restos de ARN y protoporfirina resultados

de la conversión del normoblasto ortocromático a reticulocito y solo se pueden
observar con coloraciones especiales. En sangre periférica se les puede observar
como elementos macrocíticos y policromatófilos.

NORMOCITOS O HEMATÍES (Fig. 3)

Discos cuya biconcavidad hace que aparezcan con cierta palidez central al no captar
el colorante en esa zona. Miden aproximadamente de 7,2m a 7,4m y puede llegar
hasta ocho. Presenta un pigmento respiratorio que le da el color rosado
característico que es la hemoglobina que se encarga del transporte de oxígeno.
Más adelante se explicarán las alteraciones más frecuentes de estos elementos
celulares.

Se dividen en:

  Alteraciones en tamaño.
  Alteraciones en su forma.
  Alteraciones de color.
  Inclusiones anormales.
 Alteraciones en el tamaño

Llamadas también anisocitosis. Pueden ser de dos tipos:

Macrocitos (Fig. 4): Hematíes que presentan un tamaño superior al normal (más de
9m) y su expresión máxima es el megalocito. Suelen aparecer en la anemia
megaloblástica debida a déficit de vitamina B12 o ácido fólico.

Se suele observar cuando hay un aumento de la actividad eritropoyética, como un

mecanismo de compensación a la pérdida de los hematíes, sea por anemia severa o

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 hemorragias. En la sangre periférica se pueden observar como hematíes grandes
policromatófilos o reticulocitos.

Microcitos (Fig. 5): Hematíes que presentan un tamaño inferior al normal (menos
de 6m) y se encuentran en pacientes con anemia ferropénica y talasemias.

  ALTERACIONES EN LA FORMA
Llamadas también poiquilocitosis. Entre éstos tenemos:

Esferocitos (Fig. 6): Son hematíes esféricos como unas pelotas, no son bicóncavos,
presentan un diámetro inferior al normal pero más grueso. Su vida media es de 14
días, producen taponamiento de los vasos sanguíneos. Se encuentran en la
enfermedad esferocitosis hereditaria o enfermedad de Mihkowski-Chauffard
(defecto congénito de la membrana eritrocitaria). También pueden ser adquiridos
por factores extraeritrocitarios.

Codocitos (Fig. 7): Llamados también dianocitos. En la región central presentan un

área con mayor contenido hemoglobínico (zona densa). La interfase entre la
membrana celular y el centro es transparente. Se encuentran en
hemoglobinopatías, talacemias, anemia ferropénica y en algunas hepatopatías
crónicas con aumento de colesterol y fosfolípidos.

Drepanocitos (Fig. 8): Son hematíes cuya membrana hemática se altera y se hace
falciforme (forma de hoz o media luna). Su apariencia es propia del estado
homocigoto de la hemoglobina S. Su enfermedad se conoce como drepanocitosis
hereditaria.

Eliptocito (Fig. 9): Los hematíes son alargados (ovalocitos). Se encuentran en la

enfermedad llamada ovalocitosis hereditaria. Su presencia se debe a una alteración
congénita de la membrana del hematíe, aunque puede ser adquirida en caso de
una anemia megaloblástica, ferropénica o arregenerativa.

Crenocitos (Fig. 10): Son aquellos que presentan membrana ondulante e irregular.
Se encuentran en algunas anemias hemolíticas. Este fenómeno puede ser inducido

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in vitro exponiendo los hematíes a una solución hipertónica. Cuando la
característica es muy notable puede emplearse el término equinocito.

Equinocitos (Fig. 11): También llamados acantocitos. Las prominencias de la

membrana eritrocitaria son más aguzadas (alargadas) y distribuidas irregularmente.
Se encuentran en la acantocitosis que se caracterizan por la ausencia de
lipoproteínas plasmáticas.

Dacriocitos (Fig. 12): Son hematíes en forma de lágrima. Se encuentran en la

anemia ferropénica, anemia megaloblástica y talasemia.

Esquistocitos (Fig. 13): Son fragmentos hemáticos. Se encuentran en anemias

hemolíticas, microangiopatías, quemaduras y con más evidencias en individuos
esplenectomizados.
Estomatocitos (Fig. 14): Son hematíes que en lugar de una depleción central clara
tienen una banda pálida central que les da un aspecto de boca. Se hereda como
carácter autosómico dominante. Esta enfermedad es causada por anormalidad
hereditaria de la membrana eritrocitaria.

Selenocitos (Fig. 15): Son eritrocitos alterados que adoptan forma semilunar. Es un
artificio de técnica que aparece especialmente en frotices sanguíneos de pacientes
anémicos.

Excentrocitos: Son hematíes con distribución irregular de la hemoglobina. Su

tamaño es inferior al normal y se caracteriza por poseer contornos parcialmente
arrugados, pero además se observa una distribución irregular de la hemoglobina
que aparece desplegada de la parte interna hacia uno de los extremos.

Qnizocito: Son hematíes que presentan un estoma o boca en la región central

completamente coloreada y lo demás incoloro. Morfológicamente es todo lo
contrario a las características del estomatocito. Se encuentran en algunas anemias
como las ferropénicas.

 ALTERACIONES DE COLOR: Aquí observamos las diferentes tonalidades de

color de los hematíes dependiendo del contenido hemoglobínico. Tenemos:

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Hipocromía (Fig. 16): Son hematíes con disminución del contenido de la
hemoglobina y dependiendo de la cantidad de este pigmento es que observamos a
los hematíes con diferentes caracteres de color. Aquí están incluidos los anulocitos,
que son hematíes en forma de anillo en que solo la membrana eritrocitaria está
coloreada y que se traduce en una hipocromía de grado severo (+++).

Hipercromía (Fig. 17): Son hematíes ávidos de hemoglobina. Pueden encontrarse

en caso de enfermedades como la policitemia vera o la policitemia fisiológica y
esferocitosis hereditaria.

Policromatofilia (Fig. 18): Presencia de hematíes con tonalidad (azul y rojo)

morada. Se le relaciona con inmadurez celular, células nucleadas, presencia de
reticulocitos, macrocitos, etc. Esto debido a su elevada cantidad de ARN.

Anisocromía: Diferentes tonalidades de color como hematíes hipocrómicos,

hipercrómicos, normocrómicos y policromatófilos. Se encuentran en ciertas
anemias refractarias.

 INCLUSIONES ANORMALES

Punteado basófilo (Fig. 19): Son gránulos basófilos presentes en el citoplasma de

los hematíes. Puede tratarse de un reticulocito por su elevado contenido de ARN.
Se encuentra en una intoxicación por plomo llamada saturnismo.

Cuerpos de Heinz (Fig. 20): Son formaciones redondeadas de hasta 3m de

diámetro localizadas habitualmente en la periferia de la célula. Se observan con
colorantes para reticulocitos. Estos cuerpos son abundantes en sujetos
esplenectomizados.

Anillos de Cabot (Fig. 21): Se cree que sean restos de membrana nuclear
eritroblástica o restos después de una mitosis anormal. Se observan en forma de
anillo u ocho invertido. Pueden ser precipitados de ARN o proteína carente de
importancia diagnóstica.

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Cuerpos de Howel-Jolly (Fig. 22): Son restos de cromatina nuclear, resultados de la
pérdida del núcleo por parte del normoblasto ortocromático hasta la conversión
del hematíe. Se les considera signos de regeneración celular.

Se observan en pacientes esplenectomizados.

Siderocitos (Fig. 23): Son hematíes con contenido de hierro libre no hemoglobínico
de color verde azulado.

Gránulos de Shuffner: Son gránulos que presentan algunos hematíes en caso de

parasitismo por plasmodium vivax.

Gránulos de Maurer: Son gránulos de color violeta oscuro que se encuentran en

pacientes con parasitismo por plasmodium falciparum.

Granulacion azurófila: Son pequeñas granulaciones eritrocitarias color violeta

púrpura y corresponden a restos de normoblastos ortocromáticos producto de la
cariorrexis y del paso de un elemento inmaduro a otro maduro. Se observa tanto
en síndromes diseritropoyéticos congénitos o adquiridos.

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Página 34
ANEXO A:
PREPARACIÓN DE COLORANTES Y SOLUCIONES MÁS USADOS
EN HEMATOLOGÍA

A.1 SOLUCIÓN DE GOWER

A.1.1 Reactivos

Sulfato de sodio 12,5 g

Ácido acético glacial 33,3 mL
Agua destilada c.s.p 200 mL

A.1.2 Procedimiento

A.1.2.1 Disolver el sulfato de sodio y el ácido acético glacial en el agua destilada.

Guardar en lugar fresco.

A.2 SOLUCIÓN DE HAYEM

A.2.1 Reactivos
Bicloruro de mercurio 0,5 g
Sulfato de sodio 5,0 g
Cloruro de sodio 1,0 g
Agua destilada 200 mL

A.2.2 Procedimiento
A.2.2.1 Se mezclan todos los reactivos y se guarda en frasco de vidrio en lugar
fresco.

A.3 SOLUCIÓN SALINA FISIOLÓGICA AL 0,9%

A.3.1 Reactivos

Cloruro de sodio 0,9 g

Agua destilada c.s.p. 100 mL

Página 35
A.3.2 Procedimiento
Mezclar el cloruro de sodio en el agua destilada. Guardar en lugar fresco.

A.4 SOLUCIÓN DE TURK

A.4.1 Reactivos

Ácido acético glacial 2,0 mL

Solución acuosa de violeta de genciana al 1% 1,0 mL
Agua destilada c.s.p. 100 mL

A.4.2 Procedimiento
Mezclar los reactivos y guardar en frasco ámbar en lugar fresco.

A.5 REACTIVO DE DRABKIN

A.5.1 Reactivos

Bicarbonato de sodio 1,0 g

Cianuro de potasio (KCN) 50 mg
Ferricianuro de potasio (K3Fe2 (CN)6) 200 mg
Agua destilada c.s.p. 1000 mL

A.5.2 Procedimiento
Mezclar todo y guardar en frasco oscuro protegido de la luz. Es estable un mes.

A.6 SOLUCIÓN AMORTIGUADORA TAMPONADA

A.6.1 Reactivos

Hidrofosfato disódico (Na2HPO4 2H20) 3,76 g

Fosfato de potasio dihidrogenado 2.10 g
Agua destilada c.s.p. 1000 cc

Ajustar a un pH de 7,2 para coloraciones de Wight o Leishman.

Página 36
A.6.2 Procedimiento
Mezclar todos los reactivos y guardar en frasco de vidrio en lugar fresco.

A.7 COLORANTE DE GIEMSA

A.7.1 Reactivos

Colorante Giemsa en polvo 1,0

Metanol (CH3 OH) 66,0 mL
Glycerol 66,0 mL

A.7.2 Procedimiento

A.7.2.1 Disolver el colorante con el glicerol.

A.7.2.2 Adicionar el metanol, mezclar bien y dejar a temperatura ambiente de 7 a
14 días (maduración).
A.7.2.3 Filtrar antes de su empleo. Guardar en frasco color caramelo.

A.8 COLORANTE DE LEISHMAN

A.8.1 Reactivos

Colorante de Leishman 1,5 g

Metanol (CH3 OH) 100 mL.

A.8.2 Procedimiento

A.8.2.1 Disolver el colorante en metanol y trasvasarlo a un frasco oscuro o color

caramelo, agitar, luego filtrar.

A.9 COLORANTE DE WRIGHT

A.9.1 Reactivos

Colorante de Wright 0,3 g

Metanol (CH3 OH) 97,0 mL
Glycerol 3,0 mL

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A.9.2 Procedimiento

A.9.2.1 Disolver en un mortero el colorante con el glicerol. Una vez disuelto se

adiciona el metanol trasvasándolo a un frasco oscuro (color caramelo), luego agite.
Filtrar antes de usar.

A.10 COLORANTE DE MAY-GRUNWALD

A.10.1 Reactivos

Colorante May-Grunwald en polvo 0,3 g

Alcohol metílico absoluto 100 mL

A.10.2 Procedimiento

A.10.2.1 Calentar la mezcla a 56ºC hasta la disolución completa del colorante.

Dejar enfriar en nevera a 4ºC durante 24 horas, agitando de vez en cuando. Filtrar
antes de su empleo.

A.11 COLORANTE DE MAY-GRUNWALD-GIEMSA

A.11.1 Es el resultado de combinar el colorante de Giemsa con la de May-Grunwald

y se le conoce con el nombre de tinción panóptica. En esta coloración resalta
especialmente las granulaciones de los neutrófilos, eosinófilos y basófilos.

A.12 SOLUCIÓN DE PROCAÍNA

A.12.1 Reactivos

Procaína (polvo) 3g
Cloruro de sodio 200 mg
Agua destilada c.s.p. 1000 mL

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A.12.2 Procedimiento

A.12.2.1 Mezclar los reactivos en agua destilada y completar hasta llegar a un litro.
Guardar en refrigeración a 4ºC.

ANEXO B: PREPARACIÓN DE ANTICOAGULANTES

B.1 ANTICOAGULANTE DE WINTROBE

B.1.1 Reactivos

Oxalato de Amonio (NH4)2 C2O4 H2O) 1,2 g (3 partes)

Oxalato de Potasio (K2C2O4 H2O) 0,8 g (2 partes)
Agua destilada c.s.p. 100 mL

B.1.2 Procedimiento

B.1.2.1 Mezclar y disolver todos los reactivos en el agua destilada y colocar en

frasquitos 0,1 mL de la solución por cada mL de sangre; usualmente 0,3 a 0,4 mL y
poner a secar en estufa hasta que se observe un polvo blanco por
aproximadamente 20 minutos.

B.2 ANTICOAGULANTE CITRATO DE SODIO al 3,8%

B.2.1 Reactivos

Citrato de Sodio 3,8 g

Agua destilada c.s.p. 100 mL

B.2.2 Procedimiento

B.2.2.1 Se mezcla el citrato de sodio en el agua destilada.

B.2.2.2 Para pruebas de hemostasia se emplea a razón de 1/9 (1 volumen de
anticoagulante para 9 volúmenes de sangre) y para la VSG la proporción de 1/4 (un
volumen de anticoagulante para 4 volúmenes de sangre).

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 B.3 SOLUCIÓN DE ACD (ÁCIDO CÍTRICO-DEXTROSA)

B.3.1 Reactivos

Ácido cítrico monohidratado 8g

Citrato trisódico dihidratado 22 g
Dextrosa 25 g
Agua destilada c.s.p. 1000 mL

Se emplea en proporción de ¼ (1 vol. de ACD + 4 vol. de sangre).

B.3.2 Procedimiento

B.3.2.1 Se mezcla todos los reactivos con el agua destilada.

B.3.2.2 Se emplea en proporción de 1:4 (1 volumen de ACD + 4 volúmenes de
sangre.

OBSERVACIONES:

 Observar el número aproximado de plaquetas (normales, disminuidas,

elevadas). Asimismo las alteraciones cualitativas y cuantitativas.

 Ver la morfología, tamaño, inclusiones y contenido hemoglobínico en
los hematíes.

 Observar la morfología, tamaño, inclusiones granulocitarias
 y agranulocitarias.
 Otras observaciones (presencia de normoblastos, hemoparásitos, etc).

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 CUESTIONARIO DE EXAMEN
LABORATORIO CLÍNICO N° III

1. ¿En qué consiste el control de calidad en microbiología?

2. ¿En qué consiste la técnica de tinción de Gram?
3. Explique la técnica de tinción de Ziehl-Neelsen.

4. ¿En qué condiciones resulta adecuado el uso de la técnica de tinción

de azul algodón de lactofenol?
5. ¿Cómo se realiza el recuento de plaquetas?
6. ¿Qué es un leucograma y cuáles son los criterios para su desarrollo?
7. Mencione las principales alteraciones eritrocitarias.
8. ¿Qué tipo de inclusiones se consideran anormales?

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