TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ACAPULCO

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA

MICROBIOLOGÍA GENERAL
TINCIONES

GRUPO B
ALUMNO: EDGAR JORDI CLAUDIO RAMIREZ
NO. CONTROL: 16320349
NO. EQUIPO: 1

ACAPULCO DE JUÁREZ, GRO A 01 DE FEBRERO DEL 2019

Contenido
INTRODUCCIÓN......................................................................................................................... 3
Tinción de Gram.................................................................................................................... 3
Ilustración 1. Esquema de las diferencias estructurales entre las bacterias Gram
negativas y Gram positivas..................................................................................................4
Ilustración 2. Fotomicrografía donde se observan bacterias Gram negativas en cultivo
directo (izquierda) y Gram positivas en hemocultivo (derecha) (aumento 100x)..................4
Tinción de Wright................................................................................................................... 5
Ilustración 3. Fotomicrografía detrofozoitos jóvenes de Plasmodium vivax observados
mediante la tinción de Wright (aumento 100x).....................................................................5
Tinción de Ziehl-Neelsen.......................................................................................................5
Ilustración 4. Fotomicrografía de una muestra de expectación donde se observan los
bacilos de color fucsia (Mycobacterium spp) (aumento 100x)..............................................6
Tinción negativa.................................................................................................................... 6
Ilustración 5. Preparación de Cryptococcus neoformans en tinta china que revela la
llamativa cápsula que circunda a las levaduras de gemación (aumento 40x)......................6
Tinción de azul algodón de lactofenol.................................................................................7
Ilustración 6. Fotomicrografía de hongos filamentosos con el método de azul algodón de
lactofenol. Exserohilum sp. (izquierda); Mucor sp. (derecha) (aumento 40x).......................7
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA........................................................................................7
JUSTIFICACIÓN......................................................................................................................... 8
OBJETIVO GENERAL................................................................................................................8
OBJETIVOS ESPECÍFICOS.......................................................................................................8
MATERIALES Y MÉTODOS.......................................................................................................8
Reactivo a utilizar.................................................................................................................. 8
Muestras a analizar................................................................................................................9
Metodología............................................................................................................................ 9
Referencias bibliográficas......................................................................................................11
INTRODUCCIÓN

Existe una gran variedad de tinciones que pueden ser aplicadas dentro del
campo de la microbiología. En microbiología el microscopio se utiliza de manera de
forma rutinaria, ya que proporciona importante información para la identificación
temprana y definitiva de los microorganismos.
Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color como a células,
tejidos, fibras, etcétera. De acuerdo con su origen, se pueden dividir en: colorantes
naturales, los cuales son extraídos de plantas o animales, y colorantes artificiales, que
son aquellos de minerales procesados y manipulados en el laboratorio. Los colorantes
tienen las siguientes funciones:
 Permiten hacer visibles a los objetos microscópicos y transparentes.
 Revelan su forma y tamaño.
 Muestra la presencia de estructuras internas y externas.
 Producen reacciones químicas específicas.
Las tinciones se pueden clasificar como simples cuando toda la muestra se tiñe
del mismo color y se utiliza un solo colorante (tinta china o azul de lactofenol); tinción
diferencial, cuando se visualiza más de un color porque se utiliza más de un colorante
(Gram o Ziehl-Neelsen); tinción específica, cuando se utilizan anticuerpos marcados
con una molécula fluorescente para identificar una estructura celular en particular
(inmunocitoquímico). El control de calidad de los métodos tintoriales es importante, ya
que así se asegura que la preparación de la muestra haya sido adecuada, por lo que se
recomienda realizar al mismo tiempo de la evaluación de la muestra clínica, la tinción
de un agente infeccioso ya identificado mediante esa tinción, el cual funcionará como
un control positivo. Las principales técnicas de tinción en microbiología se mencionarán
a continuación.

Tinción de Gram.

Esta tinción es un procedimiento de gran de utilidad empleado en los

laboratorios donde se manejan pruebas microbiológicas. Es definida como una tinción
diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifica a las bacterias en dos grandes
grupos: bacterias Gram negativas y bacterias Gram positivas. Esta técnica fue
desarrollada por el científico danés Hans Christian Gram en 1884. Los principios de la
tinción de Gram están basados en las características de la pared celular de las
bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a cada microorganismo. La
pared celular de las bacterias Gram negativas está constituida por una capa fina de
peptidoglicano y una membrana celular externa, mientras que las bacterias Gram

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 positivas poseen una pared celular gruesa constituida por peptidoglicano, pero no
cuentan con membrana celular externa; así pues, la composición química y el
contenido de peptidoglicano en la pared celular de las bacterias Gram negativas y
Gram positivas explica y determina las características tintoriales (Ilustración 1)

Ilustración 1. Esquema de las diferencias estructurales entre las bacterias Gram negativas y Gram positivas.

Las muestras útiles para su uso son líquidos estériles, biopsias para cultivo
abscesos, hisopados, crecimiento de colonias aisladas en medios de cultivo. Las
bacterias Gram positivas se observan de color azul obscuro a morado, mientras que las
Gram negativas se observan de color rosa a rojo (Ilustración 2).

Ilustración 2. Fotomicrografía donde se observan bacterias Gram negativas en cultivo directo (izquierda) y Gram positivas en
hemocultivo (derecha) (aumento 100x).

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 Tinción de Wright

La tinción de Wright es una técnica que se emplea generalmente para la

diferenciación de elementos celulares de la sangre y es clasificada como una tinción
policromática, dado que puede teñir compuestos ácidos o básicos presentes en una
célula. Esta técnica fue desarrollada por el por el patólogo James Homer Wright en
1902 a partir de la modificación de la ya existente tinción de Romanowsky, utilizada
para diferenciar elementos formes de la sangre. Esta técnica se emplea para la
búsqueda de hematozoarios como Plasmodium spp (Ilustración 3). El reactivo de
Wright está compuesto por eosina y azul de metileno, cuando se oxida se conoce como
azur B a una concentración de 0.8 g/L empleando como solvente alcohol metílico.
Las muestras útiles para su uso son el frotis de sangre periférica y frotis de
médula ósea. Los diferentes colorantes que se observan en la célula provocan el
llamado efecto e Romanowsky, que tiñe de color púrpura a los núcleos y gránulos
neutrofílicos y de color rosa el citoplasma. Los ácidos nucleicos se tiñen de azul,
permitiendo así distinguir a los parásitos en el interior de los eritrocitos.

Ilustración 3. Fotomicrografía detrofozoitos jóvenes de Plasmodium vivax observados mediante la tinción de Wright (aumento
100x).

Tinción de Ziehl-Neelsen.

La tinción de Ziehl-Neelsen es la técnica comúnmente usada en el diagnóstico

rutinario de tuberculosis. Es una técnica rápida, fácil y de bajo costo, lo que permite que
se pueda realizar en casi cualquier laboratorio clínico. Esta tinción permite diferenciar a
las bacterias en dos grupos: aquellos que son capaces de resistir la decoloración con
alcohol-ácido y aquellos que no lo son. La sensibilidad de esta tinción para identificar
bacilos ácido-alcohol resistentes es de 74% y la especificidad del 98&, teniendo un
límite de detección de 5,000-10,000 bacilos/mL de muestra. Los trabajos de Paul
Ehrlich fueron los que definieron la resistencia a la decoloración por ácido-alcohol, y las

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 últimas modificaciones a la tinción fueron realizadas por los científicos alemanes Franz
Ziehl y Karl Adolf Neelsen. En la siguiente imagen (ilustración 4) se observa una
muestra de expectación en la cuál se aplica la tinción de Ziehl-Neelsen.

Ilustración 4. Fotomicrografía de una muestra de expectación donde se observan los bacilos de color fucsia ( Mycobacterium
spp) (aumento 100x).

Tinción negativa.

La tinción negativa fue desarrollada originalmente para microscopia de luz con el

fin de rodear y delinear las bacterias no teñidas u otros materiales biológicos. En
microbiología, la tinción negativa proporciona un resultado presuntivo de la presencia
de Cryptococcus neoformans, microorganismo causante de meningitis en pacientes
con inmunosupresión, siendo la técnica más utilizada para poner de manifiesto su
cápsula. En la imagen (ilustración 5) se presencia una fotomicrografía de la tinción
negativa.

Ilustración 5. Preparación de Cryptococcus neoformans en tinta china que revela la llamativa cápsula que circunda a las
levaduras de gemación (aumento 40x).

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 Tinción de azul algodón de lactofenol.

La tinción de azul de algodón de lactofenol no es considerada una tinción

diferencial, sin embargo, posee características tintoriales que permiten observar cada
uno de los componentes fúngicos. Y apreciar fácilmente las estructuras para una
adecuada identificación. El fenol inactiva las enzimas líticas de la célula e impide que
ésta se rompa; de igual forma, destruye la flora acompañante e inactiva a la célula,
quitándole el grado de patogenicidad; además, actúa como mordiente cuando se usa
en combinación con colorantes. El ácido láctico preserva las estructuras fúngicas al
provocar un cambio de gradiente osmótico con relación al interior fúngico, lo que
genera una película protectora. En la siguiente imagen (Ilustración 6) se observa una
fotomicrografía de la técnica azul algodón de lactofenol.

Ilustración 6. Fotomicrografía de hongos filamentosos con el método de azul algodón de lactofenol. Exserohilum sp.
(izquierda); Mucor sp. (derecha) (aumento 40x).

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Las tinciones son técnicas muy precisas para la identificación de organismos

microscópicos. Existen variedad de técnicas de tinciones; cada una de ellas tienen una
función y utilización para identificar organismos microscópicos específicos. Son
técnicas que usan en distintas áreas, desde medicina hasta la industria de alimentos,
por ello son técnicas globales. Es por ello que cada técnica de tinción tiene un objetivo
específico como el caso de la tinción de Gram para la identificación y diferenciación de
las bacterias Gram negativas y Gram positivas; la tinción de Wright que es usada para
la identificación de hematozoarios; la tinción de Ziehl-Neelsen, la cual se usa para
identificar bacterias que puedan resistir y no puedan resistir la decoloración con ácido-
alcohol; la tinción negativa que es usada para identificar al Cryptococcus neoformans; y

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la tinción azul algodón de lactofenol, que usada para observar e identificar
microorganismos del reino Fungi. Estas técnicas usan distintos reactivos para la
identificación de microorganismos en muestras a analizar.

JUSTIFICACIÓN

Las técnicas de tinciones son de gran de importancia para revolución en la

microbiología. Desde tiempos inmemorables estás técnicas han ayudado a identificar
microorganismos ya sea patógenos y no patógenos con el fin de poder buscar una
solución a los problemas que presentaba el ser humano con propósito de ayudar a
mejorar el bienestar de otras personas que padecían problemas desde épocas
remotas. Todo esto también ayudó a revolucionar otros campos, desde la medicina
hasta la industria de alimentos.

OBJETIVO GENERAL

 Identificar microorganismos que presentan las muestras obtenidas mediante las

distintas técnicas tinción que se usan en el laboratorio.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Aprender las distintas técnicas de tinción para el análisis de microorganismos.

 Identificar cuando se deben de emplear las distintas técnicas de tinción y qué
tipo de microorganismos ayuda a identificar cada técnica.

MATERIALES Y MÉTODOS

Reactivo a utilizar.

 Alcohol-acetona
 Safranina
 Solución de yodo yodurado (Lugol)
 Cristal violeta
 Oxalato de amonio

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  Verde malaquita
 Carbolfucsina
 Ácido-alcohol
 Azul de metileno

Muestras a analizar.

 Muestra de gargajo
 Muestra de exudado faríngeo
 Muestra de exudado nasal
 Excremento de niño pequeño (menor a 6 meses)
 Polvo de levadura de panificación.

Metodología.

Para la tinción de Gram

1. Se entiende la muestra recogida (que suele ser líquida o viscosa) en un

portaobjetos y se deja secar al aire.
2. Se aplica metanol al portaobjetos; así, las bacterias quedan pegadas en la
superficie.
3. Se añade safranina o violeta de genciana, esto con el propósito de que las
bacterias se tiñan de un color púrpura y rojo. Esperar un minuto después de
aplicar el colorante.
4. Se lava la muestra coloreada con agua y se añade alcohol-acetona para desteñir
las bacterias que deben teñir con el violeta de genciana. Es la parte más
importante de la prueba, ya que si se deja demasiado tiempo se desteñirían
todas las bacterias. Después se lava de nuevo con agua para eliminar el alcohol.
5. Se añade fucsina; otro colorante que tiñe de rosa las bacterias que no se han
teñido de color púrpura. Así se pueden observar al microscopio, aunque serán
Gram negativas.
6. El microbiólogo estudia la muestra con un microscopio e identifica las bacterias
teñidas.

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Para la tinción de Wright

1. Realizar una extensión sanguínea.

2. Colocamos el puente de tinción sobre el cristalizador y sobre el puente de tinción
ponemos el frotis.
3. Con una pipeta Pasteur vertemos en la extensión 1 mL de azul de metileno.
4. Dejamos actuar a la eosina-azul de metileno durante 1 minuto y lavamos con
solución tampón pH 7.2.
5. En un tubo de ensayo diluimos 0.5 mL de eosina-azul de metileno con 0.5 mL de
solución tampón pH 7.2.
6. Mezclamos suavemente y con ayuda de una pipeta Pasteur cubrimos la
extensión con esa mezcla.
7. Dejamos que se tiña durante 3-5 minutos y lavamos con agua destilada del
frasco lavador.
8. Se vuelve a lavar con solución tampón pH 7.2, y dejamos escurrir en posición
vertical.
9. Cuando la extensión esté seca, añadimos una gota de aceite de inmersión y
observamos al microscopio con el objetivo de 100x.

Para la tinción de Ziehl-Neelsen.

1. Preparar un frotis bacteriano.

2. Secado del frotis.
3. Calentar la muestra.
4. Cubrir la mancha
5. Calentar la mancha
6. Lavar la mancha
7. Cubrir el frotis con alcohol-ácido.
8. Lavar la macha
9. Cubrir el frotis con colorante
10. Lavar la mancha
11. Drenar
12. Examinar el frotis en el microscopio.
13. Interpretar los resultados.

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 Para la tinción negativa.

1. Tomar una pequeña muestra del microorganismo sembrado en el medio de

cultivo (levadura) y colocarlo en el centro del portaobjetos.
2. Añadir al portaobjetos una gota de nigrosina o de tinta china.
3. Mezclar con el asa de siembra estéril y realizar una extensión.
4. Dejar secar la extensión a temperatura ambiente.
5. Observar la preparación en el microscopio óptico.

Para la tinción de azul algodón de lactofenol.

1. Sobre un portaobjetos limpio y seco depositaremos 2 gotas de azul de metileno.

2. Cortaremos un trozo de cinta celo y la pegaremos en los extremos del asa
estéril.
3. Con cuidado pasaremos el extremo del celo por el borde exterior de la colonia.
4. Pegaremos la cinta celo en el portaobjetos que tiene el colorante retirando con
cuidado el asa.
5. Añadiremos una gota de colorante sobre el celo.
6. Cubriremos la preparación con un cubreobjetos.
7. Observaremos al microscopio.

Referencias bibliográficas

López Jácome, L.E., Hernández Durán, M., Colín Castro, C.A., Ortega
Peña, S., Cerón González, G., y Franco Cendejas, R. (2014). Las tinciones
básicas en el laboratorio. Investigación en Discapacidad, 3(1), 10-18.
Obtenido de: http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf
Como se hace una tinción de Gram – pruebas médicas. obtenido de:
https://www.webconsultas.com/pruebas-medicas/como-se-hace-una-
tincion-de-gram-13402
CUADERNO DE PRÁCTICAS HEMATOLOGÍA: Tinción de Wright.
Obtenido de:

pág. 11
http://deliamm96cuadernopracticashema14.blogspot.com/2014/11/practica
-tincion-de-wright.html
Tinción de Ziehl-Neelsen: Fundamento, Reactivos y Técnica – Lifeder.
Obtenido de: https://www.lifeder.com/tincion-ziehl-neelsen/
Tinción negativa de cápsulas – Blog de laboratorio clínico y biomédico.
Obtenido de: https://www.franrzmn.com/tincion-negativa-de-
capsulas/#Tecnica
Tinción Azul de Lactofenol o azul algodón | PARA TÉCNICAS DE
LABORATORIO. Obtenidos de:
http://paratecnicosdelaboratorio.blogspot.com/2014/10/tincion-azul-de-
lactofenol-o-azul.html

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