PRÁCTICA Nº 05

DETECCIÓN DE Salmonella

I. OBJETIVOS:
- Describir la metodología para realizar la detección, aislamiento e identificación de
Salmonella spp. en muestras de alimentos.

II. INTRODUCCIÓN:

El género Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Son bacilos gram

negativos, de 0,7-1,5 x 2-5 μm, anaerobios facultativos, no formadores de esporas,
generalmente móviles por flagelos perítricos (excepto S. gallinarum). Fermentan
glucosa, maltosa y manitol, pero no fermentan lactosa ni sacarosa. Son generalmente
catalasa positiva, oxidasa negativa y reducen nitratos a nitritos.
Salmonella es una bacteria invasora que causa infecciones humanas, conocidas como
salmonelosis. Puesto que el intestino es el hábitat natural de algunas variedades de
Salmonella, los alimentos sin procesar de una fuente animal ocasionalmente albergan
al patógeno. Por consiguiente, Salmonella se encuentra en productos derivados de
aves de corral, incluidos pollo, huevo y pavo. De igual manera, mariscos, leche y
ensaladas han estado implicados en brotes de salmonelosis. Sólo algunas especies de
Salmonella son patógenas para los seres humanos, pero todas las salmonelas son
inaceptables en alimentos listos para comer. Por tanto, el alimento se analiza para
determinar la presencia o ausencia de Salmonella (Centro de Control y Enfermedades,
CDC).

III. MATERIALES Y EQUIPOS:

01 Probeta 100 ml
01 Matraz Erlenmeyer de 500 ml
01 Balanza analítica
01 Balanza granataria
01 Autoclave
01 Incubadora
01 Refrigerador
01 Espátula
01 Frasco de dilución de 500 ml con tapón de rosca
05 Pipetas de 1ml
04 Pipeta 10 ml
16 Placas de petri de vidrio esterilizadas de 100x15 mm
30 Tubos de prueba
01 Piseta con agua destilada
01 Asa microbiológica
01 Propipeta
Medios de cultivo
Agua peptonada tamponada
Caldo tetrationato
Caldo selenito cistina
Agar verde brillante (BGA)
Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)
Agar Salmonella-Shigella (ASS)
Agar triple azúcar hierro (TSI)
Agar lisina descarboxilasa (LIA)
Agar sulfuro indol movilidad (SIM)
Agar citrato de Simmons (CS)

IV.PROCEDIMIENTO:
a. Preenriquecimiento
1. Pesar en una bolsa de Stomacher estéril, en área aséptica 25.0 g de muestra a
analizar.
2. Verter 225.0 mL de Agua peptonada tamponada estéril en la bolsa.
3. Homogeneizar la muestra con el diluyente durante 30.0 seg a velocidad media en el
Stomacher.
4. Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca
ancha con tapón de rosca y dejar reposar por 60.0 min. a temperatura ambiente con la
tapa perfectamente cerrada.
5. Mezclar bien y determinar el pH de la muestra con papel pH.
6. Mezclar y cerrar suavemente la tapa del matraz
8. Incubar la muestra homogénea a 35ºC durante 24 h.

b. Enriquecimiento selectivo.
1. Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matraces con los cultivos de
preenriquecimiento y agitar suavemente.
2. Transferir 1.0 mL del cultivo de preenriquecimiento (con una pipeta de vidrio de 1
mL, estéril) a un tubo con 10.0 mL de cada uno de los siguientes medios de
enriquecimiento: Caldo tetrationato, Caldo selenito cistina
3. Incubar los tubos inoculados en caldo selenito-cistina, caldo tetrationato a 35ºC
durante 24 h. Para alimentos altamente contaminados deberán incubarse los medios
de enriquecimiento a 42°C por el mismo periodo.

c. Aislamiento diferencial.
1. Homogeneizar el tubo con caldo de enriquecimiento ya incubado.
2. Tomar una muestra del cultivo anterior con asa microbiológica estéril y sembrar en
estría por agotamiento en cuadrantes en cajas de Petri, en cada uno de los siguientes
medios selectivos:
a) Agar XLD
b) Agar VB
e) Agar SS
f) Agar Mac Conkey
3. Incubar las placas ya sembradas en posición invertida a 35ºC durante 24 h.
4. Observar las características macroscópicas de las colonias en los medios sólidos
selectivos.
5. Seleccionar al menos 2 colonias sospechosas de cada medio selectivo, de acuerdo
con las características específicas de desarrollo en cada uno de los medios.
7. Realizar una tinción de Gram a las colonias sospechosas.
8. Registrar las características morfológicas tanto macroscópicas como microscópicas;
anotando la forma de la colonia, su color, color del medio circundante, morfología al
Gram, etc.

d. Pruebas bioquímicas preliminares

4.1. Agar triple azúcar hierro o agar Kligler hierro
4.2. Agar lisina hierro.
5. Pruebas bioquímicas complementarias
5.1. Caldo urea (convencional)
5.2. Caldo urea (rápida)
5.3. Agar citrato de Simmons
5.4. Medio SIM (Sulfuro-indol-movilidad)

V. RESULTADOS, CONCLUSIONES, DISCUSIONES

VI. CUESTIONARIO
1. ¿Porqué es importante detectar la presencia de Salmonella spp. y Shigella spp. en
los alimentos?
2. Indique las características generales de Salmonella y Shigella.
3. ¿Cuál es el fundamento bioquímico de los diferentes medios empleados para la
identificación de Salmonella?
 PRÁCTICA Nº 06

NUMERACIÓN DE Staphylococcus aureus

I. OBJETIVOS:
- Cuantificar mohos y levaduras viables presentes en productos alimenticios
destinados al consumo humano.

II. INTRODUCCIÓN:

El género Staphylococcus se describe como Gram (+) que crece aisladamente, en

parejas, en tétradas o agrupaciones irregulares parecidas a racimos de uvas. Los
Staphylococcus se encuentran en las fosas nasales, la piel y en lesiones de humanos y
otros mamíferos. Su determinación se utiliza como componente de los criterios
microbiológicos para alimentos cocidos, para productos que son sometidos a
manipulación excesiva durante su preparación o después del proceso térmico. Cuando
los alimentos se someten al proceso térmico y muestran altos recuentos de
Staphylococcus generalmente se debe a que la contaminación proviene de la posterior
manipulación, contacto con equipo o aire contaminado y/o conservación inadecuada
del mismo. Este género comprende varias especies dentro de las cuales están S.
aureus, S. epidermidis y S. saprophyticus. Un número elevado de estos
microorganismos puede indicar la presencia de toxinas termoestables, no obstante, un
recuento bajo no significa ausencia de las mismas ya que una población numerosa
pudo haberse reducido a un número más pequeño debido a una etapa del proceso,
por ejemplo, calentamiento o fermentación. El crecimiento de S. aureus en alimentos
tiene gran importancia por tratarse de un microorganismo capaz de producir una
poderosa enterotoxina que al ingerirse causa severas intoxicaciones alimentarias.

III. MATERIALES Y EQUIPOS:

01 Probeta 100 ml
01 Matraz Erlenmeyer de 500 ml
01 Balanza analítica
01 Autoclave
01 Incubadora
01 Refrigerador
01 Espátula
01 Frasco de dilución de 200 ml con tapón de rosca
04 Pipetas de 5ml
05 Pipetas de 1ml con graduación de 0.1 ml
04 Pipeta 10 ml
16 Placas de petri de vidrio esterilizadas de 100x15 mm
08 Tubos de prueba de 16x150 mm
02 Espátulas de Drigaslky
01 Piseta con agua destilada
01 Asa microbiológica
01 Propipeta
Emulsión de yema de huevo

Diluyente
Agua peptonada

Medios de cultivo
Agar Baird Parker
Plasma de conejo liofilizado
2 Huevos frescos de gallina
Peróxido de hidrogeno al 30%
Telurito de potasio al 1%

IV. PROCEDIMIENTO:

1. Preparación de la muestra: Diluciones

1.1. Dilución primaria: Pesar 10 g del alimento en condiciones asépticas, llevar
directamente a un frasco de dilución con 90 ml de agua peptonada para
homogenizar la muestra. Esta dilución corresponderá a 10 -1.
1.2. Diluciones decimales: Se tomará 1 ml de la dilución 10-1 y se transferirá a un tubo
que contiene 9.0 ml de agua peptonada (10 -2). Esta operación se repetirá para
preparar tantas diluciones decimales como sea necesario (10 -3, 10-4, 10-5).
2. Inoculación por la técnica de extensión superficial en placa
2.1. Inocular 0.1 ml de cada dilución en placas de agar Baird Parker, extendiendo
homogéneamente sobre la superficie con una varilla de vidrio en ángulo
previamente esterilizada (perfectamente limpia, desinfectada con alcohol,
flameada y enfriada).
2.2. Invertir las placas de petri e Incubar a 35°C por 24 a 48 h.
3.Interpretación de los resultados
3.1 Completado el tiempo de incubación, seleccionar las placas que contengan entre
30 y 300 colonias aisladas
3.2 Contar y marcar las colonias típicas: centro negro circulares, brillantes, convexas,
lisas, de diámetro de 1 a 2 mm y muestran una zona opaca y un halo claro alrededor
de la colonia sospechosas de ser Staphylococcus coagulasa positiva.
3.3 Considerando las colonias sospechosas de pertenecer al género Staphylococcus,
determinar las unidades formadoras de colonia (UFC) por ml o g.
Seleccionar un número representativo de colonias típicas y atípicas; y transferirlas a
tubos de caldo infusión cerebro-corazón. Incubar a 35°C ó 37ºC por 20 a 24 h.
4. Prueba de Coagulasa
4.1. Agregar 0,1 ml del cultivo a aproximadamente 0,3 ml de plasma de conejo
reconstituido en un tubo estéril. Incubar a 35-37°C. Examinar después de 4 a 6 horas.
El coágulo formado debe ser firme y organizado (3+) o que no se cae al invertir el tubo
(4+).
4.2. Realizar un control empleando 0,1 ml de caldo BHI estéril en lugar del cultivo. Para
que el ensayo sea válido, no debe observarse ningún signo de coagulación.

V. RESULTADOS, CONCLUSIONES, DISCUSIONES.

VI.CUESTIONARIO

1 ¿Cuáles son los principales riesgos sanitarios de la contaminación por Staphylococcus

en alimentos?
3 ¿Cuáles son las medidas preventivas y de control para evitar la presencia de
Staphylococcus de en alimentos?
 PRÁCTICA Nº 07

NÚMERACIÓN DE Bacillus cereus

I. OBJETIVOS:

Describir la metodología para realizar la enumeración de Bacillus cereus por la técnica

de recuento de colonias en placa, en muestras de alimentos.

II. INTRODUCCIÓN:

Bacillus cereus es un microorganismo Gram positivo, con forma de bastón, anaerobio

facultativo y esporoformador. Por tinción de Gram se observan bacilos positivos
grandes de extremos rectos, aislados, en pares o cadenas, la mayoría móvil por
flagelos perítricos. Las condiciones óptimas para su crecimiento son de 30°C a 40ºC,
con un rango de crecimiento entre 4°C y 55ºC. Es mesófilo, pero existen cepas
psicrótrofas.
El pH óptimo para el desarrollo es entre 6.0 y 7.0, con un mínimo de 5.0 y un máximo
de 8.8. La actividad acuosa (aw) mínima para su desarrollo es 0.93. La capacidad de
esporular es una característica importante, porque estas estructuras confieren a la
bacteria resistencia a condiciones adversas, de esta manera pueden seguir viables a
pesar de que las células vegetativas hayan sido destruidas. Luego, si las condiciones
son las apropiadas, la espora germina y el microorganismo puede crecer. La espora se
desarrolla en forma central o subterminal sin deformación del esporangio. Para la
germinación de las esporas, algunas cepas necesitan activación por calor (shock
térmico), una opción es por calentamiento a 80°C durante 10 minutos. Esta propiedad
es utilizada en algunas técnicas analíticas y es de importancia a la hora de establecer el
origen de algunos brotes de ETA causados por este microorganismo.

III.MATERIALES Y EQUIPOS:
01 Probeta 100 ml
01 Matraz Erlenmeyer de 500 ml
01 Balanza analítica
01 Autoclave
01 Incubadora
01 Refrigerador
01 Espátula
01 Frasco de dilución de 200 ml con tapón de rosca
05 Pipetas de 1ml con graduación de 0.1 ml
04 Pipeta 10 ml
12 tubos esterilizados de 16x150 mm
01 Espátula de Drigalsky
09 Placas de petri de vidrio esterilizadas de 100x15 mm
01 Piseta con agua destilada
01 Asa bacteriológica
01 Propipeta
Solución salina peptonada (SFP)
Solución de polimixina (106 U.I. en 100 ml)
Diluyente y soluciones
Agua peptona bufferada (BPW)
Emulsión de yema de huevo
Sangre de oveja desfibrinada
Medios de cultivo
Agar selectivo para Bacillus cereus según MOSSEL

VII. PROCEDIMIENTO:

Suspensión inicial
En un frasco estéril o bolsa de plástico estéril pesar 10 g de la muestra. Agregar una
cantidad del diluyente igual a 9 x g ó 9 x ml (dilución 1/10) y homogeneizar de 1 a 3
minutos dependiendo del alimento.
En el caso de recuento de esporas realizar un tratamiento térmico a la suspensión
inicial, inmediatamente después de su preparación, por ejemplo 10 minutos a 80°C
seguido de un enfriamiento rápido.

Diluciones decimales
Transferir con una pipeta 1ml de la suspensión inicial en un tubo con 9 ml del diluyente
estéril, para obtener la dilución 10-2.

Inoculación e incubación
1. Transferir por medio de una pipeta estéril, 0.1 ml de la muestra si el producto es
líquido ó 0.1 ml de la suspensión inicial (dilución 1/10), por duplicado, a placas de agar
selectivo para Bacillus cereus según MOSSEL. Si es necesario repetir el procedimiento
para las sucesivas diluciones decimales.
3. Distribuir el inóculo tan pronto como sea posible sobre la superficie del medio sin
tocar los bordes de las placas con una espátula estéril. Utilizar una espátula para cada
placa. Dejar las placas con la tapa puesta por 15 minutos a temperatura ambiente para
permitir que el inóculo sea absorbido en el agar.
4. Invertir las placas e incubarlas a 30°C entre 18 y 24 horas. Si no hay colonias
claramente visibles, incubar las placas por 24 horas adicionales antes del conteo.

Recuento y selección de las colonias

Después de la incubación por el período especificado, seleccionar las placas,
preferiblemente en dos diluciones sucesivas.
Las colonias presuntas son grandes, rosas (indicando que no ocurre fermentación del
manitol) y generalmente rodeadas de una zona de precipitación.
NOTA 1. Si las placas contienen numerosos organismos fermentadores de manitol que
producen ácido, la característica de color rosa de las colonias de Bacillus cereus puede
reducirse o desaparecer por completo.
NOTA 2. Algunas cepas de Bacillus cereus producen poco o nada de lecitinasa. Las
colonias deberían también ser sometidas al test de confirmación.

VIII. RESULTADOS, CONCLUSIONES, DISCUSIONES

IX. CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la composición del el agar selectivo para Bacillus cereus según
MOSSEL?
2. ¿Cuáles son las toxinas excretadas por Bacillus cereus y qué síndrome
producen?