Universidad Politécnica de Sinaloa

Ingeniería en biotecnología

Metabolómica

Adrián González Castillo

EVIDENCIA DE DESEMPEÑO II

Portillo Juárez Nicole

BT 8-1

Mazatlán, Sin.

04 de marzo de 2024
Fundamento teórico de las técnicas de cuantificación, identificación y
análisis de los metabolitos.

Cromatografía de gases
La cromatografía de gases es un método de separación de compuestos de una
muestra. La separación de los compuestos se distribuye en dos fases: Una fase
estacionaria y otra móvil. La fase móvil es encargada de percolar a través de la
fase estacionaria. Las técnicas cromatográficas se dividen en dos grandes grupos
según sea la fase móvil. Si esta es un gas la técnica es llamada cromatografía de
gases, y si la fase móvil es un líquido la técnica es llamada cromatografía líquida.
(Gallego, 2016)
En el proceso cromatográfico, se inyecta la muestra mediante una corriente de
gas inerte en una fina columna a elevada temperatura. Los componentes de la
mezcla son arrastrados por la fase móvil a lo largo del lecho estacionario. Debido
a las propiedades de los componentes de la mezcla y a repetidos procesos de
sorción y desorción, se lleva a cabo separación de los compuestos en función de
sus diferencias en las constantes de distribución. Al finalizar el proceso de
separación de los compuestos, estos emergen de la columna a intervalos
discretos. Los compuestos son analizados con un detector. Este detector puede
ser tipo llama o espectrómetro de masas. La información obtenida de cada
compuesto es visualizada en un cromatograma, el cual muestra los picos
correspondientes a cada compuesto en función del tiempo de retención y su
abundancia en la muestra. El tiempo de retención (tR), es el tiempo transcurrido
desde la inyección de la muestra y la detección de un compuesto, el tR de cada
componente es propio de cada compuesto presente en la muestra. (Gallego,
2016)
Espectrometría de masas
La espectrometría de masas es una técnica analítica en la que los átomos o
moléculas de una muestra son ionizados, con mayor frecuencia positivamente,
separados por su relación masa/carga (m/z) y posteriormente detectados y
registrados. La importancia y proyección de la MS es debida a su potencial analítico.
Las ventajas de esta técnica se pueden resumir en los siguientes aspectos:
proporciona una insuperable especificidad en la determinación del peso molecular
debido a la posibilidad de medir exactamente su masa molecular así como
obtener información a partir de los fragmentos iónicos de un analito. Su sensibilidad
es muy elevada y en teoría, laMS permite detectar una única molécula. Se ha
demostrado la detección de moléculas en cantidades de atto moles (10–18 moles)
y femtomoles(10–15 moles). Es muy versátil, ya que permite determinar la estructura
de tipos de compuestos muy diversos. Es aplicable a los elementos y a todo tipo de
muestras, volátiles, no volátiles, polares y apolares, sólidos, líquidos y gases.
(Martin, Ballesteros, 2018)
Metodología de las técnicas aplicadas en la cuantificación, identificación y
análisis de los metabolitos.

Cromatografía de gases
El cromatógrafo de gases Agilent modelo 7890AGC System del CCA, cuenta con
una adecuación para termodesorción de muestras atrapadas en cartuchos
adsorbentes. En la termodesorción (tabla 5.1), un flujo de helio de ultra pureza
direcciona los VOC´s hacia vaporizador con temperatura programada (PTV) en el
cromatógrafo, el cual es usado como trampa criogénica para los VOC´s previo a
la corrida de la muestra. (Gallegos, 2016)
Para el análisis de las muestras en el cromatógrafo de gases, se ha diseñado un
método de trabajo llamado “VOC´s aliento 5. Cuando inicia la corrida en el
cromatógrafo, el PTV pasa de -20 °C a 350°C a una velocidad de 360°C/min,
transfiriendo todos los compuestos hacia la columna capilar de 60 m de longitud.
Seguidamente comienza la separación de los compuestos dentro de la columna
cromatográfica, empezando a -20 °C con un ligero calentamiento de 5°C/min,
hasta llegar a 250°C en un tiempo total de 61.3 minutos. Posteriormente los
compuestos fueron analizados con el espectrómetro de masas, en modo impacto
electrónico a 70 eV, en un barrido de 16 a 200 uma. La información de los
compuestos se visualizó y analizó en el software de Agilent ChemStation. Este
software permite observar el cromatograma de la muestra, hacer pureza de pico
de cada compuesto, identificar compuestos, e integrar los picos entre otras.
(Gallegos, 2016)

Espectrometría de masas

Se tomaron muestras de 9 camarones de cada grupo de tratamiento y control para

el análisis metabolómico. En primer lugar, se recogieron 200 μL de hemolinfa de
cada organismo en crioviales de 2 mL y se colocaron inmediatamente en nitrógeno
líquido. Luego, los tejidos branquiales se cortaron y recolectaron en crioviales de 2
mL y se congelaron en nitrógeno líquido. (Alfaro,2021)

Los metabolitos de la hemolinfa (200 μL) y los tejidos branquiales (5 mg de tejido

seco) se extrajeron con metanol acuoso frío (-20°C) y se trataron por derivatización
con metil cloroformiato (MCF) con modificaciones menores. Se añadió d4-alanina
(20 μL de 10 mM) en cada muestra antes de la extracción como estándar
interno. Las muestras en blanco que contenían solo 20 μL de alanina d4 10 mM se
extrajeron junto con las muestras con fines de control de calidad (QC, por sus siglas
en inglés). (Alfaro, 2021)
Otro tipo de muestras de QC fueron las mezclas de aminoácidos (20 μL, 20 mM)
que se derivatizaron como protocolo para las muestras. Posteriormente, se
agruparon 10 μL de cada muestra para conformar una muestra de QC agrupada
para cada tejido. Las muestras derivatizadas se analizaron con un cromatógrafo
de gases GC7890B acoplado a un espectrómetro de masas cuadrupolos
MSD5977A (Agilent Technologies, CA, USA) con un detector de masa selectivo
cuadrupolo (EI) operado a 70 eV. (Alfaro, 2021)

Resultados del análisis metabólico realizado con las técnicas.

Cromatografía de gases
Se encontró un total de 92 compuestos orgánicos presentes en el aliento de
pacientes sanos y diabéticos. Se muestra un cromatograma con una muestra de
aliento de un paciente sano (azul), un paciente de reciente diagnóstico de
diabetes (negro), y un paciente con diabetes en estado crítico (rojo).
Posteriormente realizó un diagrama de barras en escala logarítmica para observar
las diferencias en la abundancia promedio de los compuestos en el aliento de los
pacientes sanos y diabéticos. (Gallegos, 2016)
Espectrometría de masas

El Sistema Automatizado de Deconvolución e Identificación de Espectros de

Masas (AMDIS, por sus siglas en inglés) arrojó en sus análisis 81 objetivos de 416
componentes tanto para la hemolinfa como para los tejidos branquiales. Después
de la marcación, hubo 84 y 81 metabolitos marcados para hemolinfas y tejidos
branquiales, respectivamente. Estos compuestos pertenecen a categorías
principales que incluyen aminoácidos, ácidos grasos, ácidos orgánicos y otros.
(Alfaro, 2021)

Comparación de los resultados con la respuesta génica correspondiente.

Cromatografía de gases
Para los compuestos presentes en el aliento, se encontró que el coeficiente de
variación intra-individual fue 33.2 ± 6.4%, mientras que el coeficiente de variación
inter-individual fue de 107.8 ± 39.2%, cabe destacar que en este último no se
tuvieron en cuenta parámetros fisiológicos de los pacientes. Un biomarcador de
gran importancia es la acetona, y ha sido el más estudiado en relación con la
diabetes (C. Wang et al. 2010). La acetona presentó una variación intra-individual
de 18.94± 6.4%. Para analizar la relación de la acetona con los niveles de glucosa,
se graficó, el área bajo la curva de acetona de cada paciente y los niveles de
glucosa promedio de pacientes sanos, diabéticos en estado crítico y de reciente
diagnostico. (Gallegos, 2016)
Espectrometría de masas
Este estudio proporciona la primera investigación de metabolómica basada en GC-
MS de inmunoestimulación de fibras de celulosa (fibra vegetal), probióticos, (V.
alginolyticus) y un tratamiento combinado de fibra de celulosa y probióticos para
camarones patiblancos (P. vannamei). Las diferencias en los perfiles de
metabolitos de la hemolinfa y tejidos branquiales del camarón revelaron efectos
significativos de los tratamientos de las fibras de celulosas y probióticos en los
camarones. (Alfaro, 2021)

Los perfiles de metabolitos de la hemolinfa de los tratamientos individuales de fibra

de celulosa y probióticos mostraron poca diferencia en comparación con el control,
mientras que el tratamiento combinado mostró una diferencia notable en
comparación con el control y los otros tratamientos con estimulantes individuales.
Esto sugiere que se puede lograr la mejor estimulación inmunológica con la
aplicación combinada de fibra de celulosa y probióticos. De acuerdo con este
hallazgo, estudios previos en camarones también han demostrado que
la combinación de fibra de celulosa y probióticos produce respuestas inmunes y
supervivencia más altas de L. vannamei contra infecciones, en comparación con los
tratamientos individuales con probióticos o prebióticos. (Alfaro, 2021)

Conclusiones.
Cromatografía de gases

El análisis de compuestos en el aliento es una técnica no invasiva y prometedora

para el diagnóstico oportuno y monitoreo de múltiples patologías. No obstante el
análisis de metabolitos en aliento requiere la estandarización de protocolos de
toma de muestras de aliento así como estudios focalizados a sectores étnicos y
geográficos específicos. Es necesario llevar un control eficiente de las variables
que puedan afectar las medidas, así como también una selección clara del
volumen a muestrear. Para analizar el aire alveolar en los pacientes, es primordial
eliminar el aire del espacio muerto anatómico de los pacientes, que bajo
condiciones corporales es aproximadamente 200 mL. (Gallegos, 2016)
Se determinó, basado en estos estudios la línea basal de compuestos presentes
en la población sana. Para esto solo se tuvieron en cuenta los compuestos que
presentaron diferencias significativas en sus promedios, y que no entrecruzaban
los errores estándar de ambas poblaciones. Del total de metabolitos presentes en
el aliento, 20 de estos permitieron determinar la línea basal: Butano, Etanol,
Acetona, Propanol, 2 Butanona, 3 metil 2 butenal, Ciclohexano, 2 Pentanona, 1
Hepteno, 2 Etoxi etanol, 2,3,5 trimetil hexano, m- xileno, 2,4,6 trimetil heptano,
2,2,6 trimetil octano, Benzaldehído, 2,2,3 Tetrametil pentano, 2,3,3 trimetil octano,
2,6 dimetil decano, Limoneno y Undecano. (Gallegos, 2016)
Espectrometría de masas
Esta evaluación demuestra las bondades de la aplicación de la metabolómica para
revelar información de respuestas metabólicas de camarones expuestos a
diferentes productos inmunoestimulantes. La combinación de fibras de
celulosa como inmunoestimulante y V. alginolyticus como probióticos proporcionó
una mejor estimulación que los tratamientos individuales y el control. (Alfaro,2021)

Con este fin, es necesario realizar más experimentos para investigar los efectos a
largo plazo de la aplicación de estos estimulantes sobre el crecimiento del
camarón y las respuestas del huésped a los desafíos de patógenos. Entre
los metabolitos alterados, el ácido láctico aumentó tanto en la hemolinfa como en
los tejidos branquiales en los camarones expuestos al tratamiento combinado, pero
fue el único metabolito alterado en los tejidos branquiales del grupo de tratamiento
con probióticos. Esto sugiere que el ácido láctico puede ser un metabolito altamente
sensible y potencialmente podría usarse como un biomarcador de estrés en la
camaronicultura. (Alfaro, 2021)

Conclusiones.
Encontrar metabolitos mediante métodos cromatográficos y espectroscópicos es
importante en muchos campos. Estas técnicas son esenciales para encontrar
biomarcadores en medicina que ayuden a diagnosticar y controlar enfermedades.
También son fundamentales para que la industria farmacéutica descubra nuevos
fármacos en plantas o microorganismos. En biotecnología, permiten optimizar
procesos productivos como la fermentación. Además, en ecología son
fundamentales para comprender cómo afecta la contaminación a los ecosistemas y
evaluar su salud. Juntas, estas técnicas nos ayudan a identificar y comprender
compuestos en sistemas biológicos y ambientales, y son esenciales para una serie
de aplicaciones de investigación y tecnología.
Bibliografía.

Gallego Sánchez, Ana María. (2016). Análisis de metabolitos presentes en el

aliento: Determinación de la línea basal. Universidad Nacional Autónoma de
México.
Martin Gómez, Carmen. Ballesteros González, Milagros. (2018). Espectrometría
de masas y análisis de biomarcadores.
Andrea C. Alfaro, Thao V. Nguyen, Jenny A. Rodríguez, Bonny Bayot, Cristóbal
Domínguez-Borbor, Stanislaus Sonnenholzner, Awanis Azizan, Leonie Venter,
Evaluation of immune stimulatory products for whiteleg shrimp (Penaeus
vannamei) by a metabolomics approach, Fish & Shellfish Immunology, Volume
120.