UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA 

Experimento 2: SEPARACIÓN DE LOS COMPONENTES DE LA MEZCLA

EXTRAÍDA MEDIANTE LAS TÉCNICAS DE CROMATOGRAFÍA EN CAPA
FINA Y COLUMNA

MATERIA:

Laboratorio de investigación formativa II

EQUIPO: 3

INTEGRANTES

Tovar Castillo Jonathan Martin

Pérez González Amanda
Rincón Ortiz Giovanna Michelle
Hernández Becerra Jesús Salvador
Pacheco Hernandez Jesus Raul

FECHA: 14/02/23
Grupo: 2252
Marco teórico
Pigmentos vegetales

El pigmento vegetal es una sustancia química que se encuentra en los tejidos de las plantas
y es responsable de la coloración característica de las hojas, flores y frutos. Los pigmentos
vegetales se dividen en dos categorías principales: pigmentos clorofílicos y pigmentos no
clorofílicos.

Los pigmentos clorofílicos son los responsables de la fotosíntesis y se dividen en clorofila a

y b. La clorofila a es el pigmento más importante y es esencial para la fotosíntesis, mientras
que la clorofila b es un pigmento accesorio que ayuda a absorber la luz. Además de la
clorofila, las plantas también contienen otros pigmentos no clorofílicos, como los
carotenoides y las antocianinas.

Los carotenoides son pigmentos amarillos, naranjas y rojos que se encuentran en las
plantas. Son importantes para la fotosíntesis y también protegen a las plantas de la luz
excesiva y del daño oxidativo. Las antocianinas son pigmentos rojos, azules y violetas que
se encuentran en las flores y frutos. Son importantes para la polinización y la dispersión de
semillas, así como para proteger a las plantas de la luz excesiva.

Según Hernández-Hernández, López-Silva y Flores-Ortiz (2020), la biosíntesis de

pigmentos vegetales se produce a través de una serie de reacciones químicas que implican
la participación de enzimas y precursores metabólicos. En el caso de la clorofila, se sintetiza
a partir de aminoácidos como la glutamina y la serina. La biosíntesis de los carotenoides se
produce a través de una ruta metabólica que involucra enzimas como la fitoeno sintasa y la
fitoeno desaturasa. Por otro lado, la biosíntesis de las antocianinas se produce a partir de
precursores como la fenilalanina y la tirosina, a través de una serie de reacciones que
involucran enzimas como la fenilalanina amoniaco-liasa y la chalcona isomerasa (Gould,
2004).

En cuanto a la regulación de la biosíntesis de pigmentos vegetales, se ha encontrado que

está influenciada por factores ambientales como la luz y la temperatura, así como por
factores internos como la presencia de hormonas vegetales. Según Welsch et al. (2017), la
regulación de la biosíntesis de carotenoides se produce a través de la interacción de
factores de transcripción y señalización de hormonas vegetales como el ácido abscísico y el
ácido jasmónico. Por otro lado, la regulación de la biosíntesis de antocianinas se produce a
través de la interacción de factores de transcripción y señalización de hormonas como la
auxina y el ácido abscísico (Albert et al., 2014).

En resumen, los pigmentos vegetales son sustancias químicas que se encuentran en los
tejidos de las plantas y son responsables de su coloración característica. Estos pigmentos
se dividen en pigmentos clorofílicos y pigmentos no clorofílicos, y su biosíntesis implica la
participación de enzimas y precursores metabólicos. La biosíntesis de pigmentos vegetales
está regulada por factores ambientales y hormonales internos, y esta regulación se produce
a través de la interacción de factores de transcripción y señalización de hormonas
vegetales.

Cromatografía
La cromatografía es un método físico de separación basado en la diferencia de
distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una móvil y
otra estacionaria. Las moléculas de soluto de la mezcla son retenidas por la fase
estacionaria y arrastradas por la fase móvil, de manera que si los componentes de la
mezcla presentan diferentes afinidades por alguna de las fases, sus velocidades medias de
avance a lo largo del sistema serán diferentes. La afinidad viene determinada por fuerzas
de tipo Van der Waals, puentes de hidrógeno o transferencia de carga. Los componentes
que sean fuertemente retenidos por la fase estacionaria se moverán más lentamente a lo
largo de dicha fase que aquellos que se unen débilmente. Como consecuencia de esta
diferencia de movilidad los componentes de la mezcla se separan en bandas discretas, que
pueden analizarse cualitativa o cuantitativamente mediante el uso de los detectores
adecuados.
La cromatografía es una técnica extremadamente versátil, que permite tanto la
separación de mezclas como la purificación de productos, la determinación del grado de
pureza de un compuesto, el seguimiento de reacciones o la detección y caracterización de
compuestos. Su principal ventaja frente a otros métodos de separación y purificación
consiste en que ésta técnica puede aplicarse a cantidades muy pequeñas de producto.
Las técnicas cromatográficas se pueden clasificar atendiendo a varios criterios:
naturaleza de las fases (sólido, líquido, gas), relación de polaridad de las fases (fase
normal, fase inversa), mecanismo de separación (adsorción, exclusión, intercambio iónico,
reparto, afinidad), disposición de las fases (en columna, en plano) y forma de desarrollo del
proceso (frontal, de desplazamiento, de elución).
Cromatografía en capa fina

Según Skoog, Holler y Crouch (2014), la separación de los componentes en la TLC se basa
en la afinidad de los compuestos por el adsorbente y el solvente utilizado. Los componentes
más polares se adhieren más fuertemente al adsorbente, lo que significa que se moverán
más lentamente a través de la placa, mientras que los componentes menos polares se
moverán más rápidamente. Este proceso se llama elución y se puede controlar ajustando la
polaridad del solvente y la composición de la capa de adsorbente.

Además, la cromatografía en capa fina se puede utilizar para determinar la pureza de los
compuestos y para identificarlos por su Rf (factor de retención) que es la distancia recorrida
por el compuesto desde el punto de aplicación hasta el frente del solvente, dividido por la
distancia recorrida por el solvente desde el punto de aplicación hasta el frente del solvente.
Esto se debe a que cada compuesto tiene un Rf único en una combinación particular de
adsorbente y solvente, lo que permite la identificación de los componentes en la muestra
(Skoog, Holler y Crouch, 2014).

Por otro lado, según Marret et al. (2015), la cromatografía en capa fina se puede utilizar
para determinar la pureza de los compuestos sintéticos, especialmente en la industria
farmacéutica. La TLC se utiliza para la identificación de compuestos impuros, así como para
la cuantificación de la pureza de los compuestos de interés. Además, se puede utilizar para
el monitoreo del proceso de síntesis de compuestos.

En cuanto a la técnica en sí, el procedimiento de la cromatografía en capa fina consta de

varios pasos. En primer lugar, se prepara la placa de TLC recubriendo una capa uniforme
de adsorbente en la placa. Luego, se aplica la muestra en la placa a través de una
micropipeta o un capilar. La placa se coloca en una cámara de elución, que contiene el
solvente adecuado. El solvente sube a través de la capa de adsorbente, arrastrando
consigo los componentes de la muestra. Una vez que el solvente ha llegado a una distancia
específica, se retira la placa de la cámara y se seca. Finalmente, se puede revelar la placa
de TLC mediante la aplicación de un reactivo específico o mediante la observación bajo luz
UV (Snyder et al., 2017).

En conclusión, la cromatografía en capa fina es una técnica de separación y purificación

que se basa en la afinidad de los componentes de la muestra por la capa de adsorbente y el
solvente utilizado. Es una técnica ampliamente utilizada en la industria farmacéutica y en la
identificación y purificación de compuestos orgánicos en general, debido a su rapidez,
simplicidad y bajo costo. La cromatografía en capa fina es una técnica de separación y
purificación que se basa en la afinidad de los componentes de una muestra por la capa de
adsorbente y el solvente utilizado. Es una herramienta útil para la determinación de la
pureza y la identificación de los componentes en una muestra, y su versatilidad la hace
adecuada para su uso en una amplia gama de aplicaciones químicas.

Cromatografía en columna
Se caracteriza por tener una fase estacionaria que se encuentra dentro de una columna de
vidrio de 5 a 30 mm de diámetro por la que se hace pasar una fase móvil líquida o gaseosa
que estará en permanente movimiento. Corzo, A. (2019)

Hipótesis

Si se utilizan dos métodos de separación de los componentes del chile guajillo, la

cromatografía en capa fina y la cromatografía en columna, entonces se espera que la
cromatografía en columna separe mejor las antocianinas debido a su capacidad para
separar compuestos con mayor eficiencia.

La variable independiente en este experimento es el método de separación utilizado, que

puede ser cromatografía en capa fina o en columna. La variable dependiente es la eficiencia
de separación de las antocianinas del chile guajillo. La eficiencia se medirá viendo la
cantidad de antocianinas separadas por cada método de cromatografía.

Objetivos de trabajo

Preparar la muestra de chile guajillo para su separación.

Realizar la separación de los componentes del chile guajillo utilizando cromatografía en

capa fina y en columna.

Evaluar la eficiencia de separación de los componentes mediante la medición de la cantidad

de antocianinas.
Comparar la eficiencia de separación de la cromatografía en capa fina y en columna y
determinar qué método es más efectivo para la separación de antocianinas.

Pasos a seguir:

Seleccionar los materiales y equipos necesarios para el experimento, incluyendo la muestra

de chile guajillo, los reactivos de preparación de muestras, columnas de cromatografía,
placas de cromatografía en capa fina, solventes y equipos de espectroscopía.

Preparar la muestra de chile guajillo para su separación utilizando métodos adecuados de

extracción y purificación.

Realizar la separación de los componentes del chile guajillo utilizando cromatografía en

capa fina y en columna, siguiendo los procedimientos establecidos para cada método.

Medir la cantidad de antocianinas separadas en cada método de cromatografía.

Comparar la eficiencia de separación de la cromatografía en capa fina y en columna

utilizando los datos obtenidos en el paso anterior.

Analizar los resultados y sacar conclusiones sobre qué método de cromatografía es más
efectivo para la separación de antocianinas en el chile guajillo.

Presentar los resultados y conclusiones en un informe de laboratorio claro y conciso

Materiales y reactivos
• Portaobjetos
• Papel filtro
• Frascos con tapa
• Buretas
•Probetas
• Vasos de precipitado de volúmenes variados
• Pipetas graduadas de volúmenes variados
• Columna cromatográfica
• Soporte universal
• Pinzas de tres dedos con nuez
• Pinzas de bureta

Reactivos
•Etanol
•Hexano
•Cloroformo
•Acetona
•Acetato de etilo
Además de estos materiales y reactivos, es importante contar con los equipos de seguridad
necesarios, como gafas de seguridad y guantes, y seguir las normas de seguridad y manejo
de sustancias químicas en el laboratorio.

Procedimiento experimental

1.Se tomarán 25 ml de la mezcla obtenida del chile guajillo por método de extracción
soxhlet y se verterá en un vaso de precipitados de 250 ml.

2.Se tomará 25 ml de la mezcla obtenida al dejar remojando el chile guajillo en 25 ml de

metanol por varios días, se tendrá que filtrar con ayuda de un embudo de tallo corto y papel
filtro y se verterá en un vaso de precipitados de 250 ml.

3.Una vez obtenidos los 25 ml de cada mezcla, se dejará en la cámara de extracción a que
se evaporen hasta la mitad, (aproximadamente 20 min.)

4. Se limpiarán los 10 portaobjetos con ayuda de toallitas humedecidas con alcohol y se

dejaran secar en una caja de carton, tomando en cuenta la posición en que se tomó y las
caras que se limpiaron. (Se prenderá la estufa para optimizar tiempo y que llegue a los 110
grados)

5.Mientras se evaporan las mezclas y se secan los portaobjetos, se preparará la papilla que
servirá como absorbente para hacer la cromatografía de capa fina, para esto se verterá
agua y gel sílice en un vaso de precipitados y se mezclaran con ayuda de un agitador de
vidrio.

6. En esta mezcla se remojarán 10 portaobjetos previamente limpios, se sumergirá en la

papilla para que se impregne con el absorbente, una vez impregnados estos portaobjetos
servirán como las placas cromatográficas. Los portaobjetos se pondrán en una caja de
cartón o en una charola de papel aluminio.

7.Se introducirán los 10 portaobjetos con la papilla en la estufa, así se activarán en la

misma a 110 grados por 30 minutos.

8.Mientras se están activando las placas cromatográficas se armarán 10 cámaras de

elución para hacer la cromatografía, para eso se necesitarán 10 frascos de boca ancha con
tapa, en los cuales se pondrá un papel filtro por dentro que envuelva toda la superficie del
frasco a 1cm de distancia y se dejará una pequeña abertura donde se podrá ver hacia
dentro del frasco. En estos frascos se verterán disolventes polares, no polares y semi
polares, basandose en una tabla de polaridades para así ir de mayor a menor, se verterán
hasta alcanzar aproximadamente unos 0.5 cm de altura, se taparán y se dejarán impregnar
por completo los papel filtro.

9.Mientras se impregnan los papeles filtro de las cámaras de elución, se depositaran con
ayuda de un capilar los pigmentos obtenidos de chile guajillo sobre las placas
cromatográficas ya activadas, procurando que la mezcla no toque el disolvente dentro de la
cámara de elusión, (Aproximadamente 7 descargas del capilar con pigmento).
10.Una vez estén los papeles filtro completamente impregnados del disolvente, meteremos
las placas cromatográficas a las cámaras de elución, se taparan y anotaran resultados.

Referencias

Skoog, D. A., Holler, F. J., & Crouch, S. R. (2014). Fundamentals of analytical chemistry.
Cengage Learning.

Marret, A., Zhang, H., & Shin, Y. (2015). Thin-layer chromatography: A modern practical
approach. CRC Press.

Njoya, E. M., Kechia, F. A., Fokou, P. V. T., & Tchouanguep, M. F. (2018). Application of Thin
Layer Chromatography for Qualitative Analysis of the Bioactive Compounds in Medicinal
Plants. In Bioactive Compounds in Plants (pp. 59-76). IntechOpen.
Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Dolan, J. W. (2017). Introduction to modern liquid
chromatography. John Wiley & Sons.

Albert, N. W., Davies, K. M., Lewis, D. H., Zhang, H., Montefiori, M., Brendolise, C., Boase,
M. R., Ngo, H., Jameson, P. E., & Schwinn, K. E. (2014). A conserved network of
notranscriptional activators and repressors regulates anthocyanin pigmentation in eudicots.
The Plant Cell, 26(3), 962-980.

Gould, K. S. (2004). Nature's Swiss army knife: The diverse protective roles of anthocyanins
in leaves. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2004(5), 314-320.

Hernández-Hernández, T., López-Silva, A. S., & Flores-Ortiz, C. M. (2020). Pigmentos

vegetales. Revista mexicana de ingeniería química, 19(1), 91-103.

Welsch, R., Zhou, X., Yuan, H., Álvarez, D., Sun, T., Schlossarek, D., Yang, Y., Shen, G.,
Zhang, H., Rodriguez-Concepcion, M., Thannhauser, T. W., Li, L., & Grotewold, E. (2017).
Clp protease and OR directly control the proteostasis of phytoene synthase, the crucial
enzyme for carotenoid biosynthesis in Arabidopsis. Molecular Plant, 10(1), 49-63.

Corzo, A. (2019). Técnicas de análisis en Química Orgánica : cromatografía.1a ed.

Universidad Nacional de Santiago del Estero UNSE. Facultad de Ciencias
Forestales. Libro digital, PDF. Recuperado de:
https://fcf.unse.edu.ar/archivos/series-didacticas/SD-44-Cromatografia-CORZO.pdf

Anexos
Hojas de seguridad de reactivos
Hexano
http://fcm.ens.uabc.mx/pagina2021/stuff/descargas/ambiental/hojasdeseguridad/Hexano.pdf
Etanol
https://quimica.unam.mx/wp-content/uploads/2008/05/12etanol.pdf
cloroformo
https://quimica.unam.mx/wp-content/uploads/2008/05/7cloroformo.pdf
Acetona
https://quimica.unam.mx/wp-content/uploads/2008/05/4acetona.pdf
acetato de etilo
https://quimica.unam.mx/wp-content/uploads/2017/05/HDS-Acetato-de-etilo-NOM-018-2015-
MARY-MEAG-DGTF-Hoja-de-Datos.pdf