FASE 2

Diseña los pipelines necesarios para evaluar lo siguiente:

6. Cambios en el transcriptoma de las Arabidopsis wild type (wt) vs. mutantes

6.1Diseño experimental

Se debe extraer tejido para poder realizar la extracción de ARN, esto sería de las hojas
de Arabidopsis en sus primeras etapas de crecimiento, el cual proporciona un rendimiento
más alto de ARN para la extracción de ARN (Rodríguez-Galán et al., 2018). Sería 1 muestra
por triplicado de cada uno de los genotipos, con una edad de 10 días (Salas, 2010). Para las
condiciones sería 8 horas de luz y 16 horas de oscuridad en cámaras a 22°C y 60% de
humildad. El medio de cultivo para fomentar el crecimiento con 0.5x medio MS y 0.8% agar
(Sánchez, 2008).

6.2 Metodología de extracción de ácidos nucleicos y purificación de mRNA

En primer lugar, se realiza la preparación de muestras. Luego, la extracción de ácidos

nucleicos y purificación de mRNA. Se utiliza un kit comercial PureYield™ RNA Miniprep
System (Promega) el cual es utilizado en el artículo de Xu et al.( 2022( para extraer el ARN
de las muestras. Luego una columna de oligo (dT) para seleccionar el mRNA. Para poder
realizar la preparación de la biblioteca de cDNA y secuenciación. El mRNA seleccionado se
convertiría en cDNA, el cual es fragmentado y se ligaría a adaptadores antes de la
secuenciación en la plataforma Illumina. (Xu et al. 2022).

6.3 Selección de equipo y celda de análisis de transcriptoma basado en el número

de muestras y Mbp calculado del experimento entero

Se cuenta con 9 muestras y asumiendo que buscamos una profundidad de

secuenciación de aproximadamente 20-30 millones de lecturas por muestra para un análisis
de expresión diferencial, por lo cual se necesitará alrededor de 180-270 millones de lecturas
en total. NovaSeq 6000 S1: genera hasta 650-800 millones de lecturas, por lo que la celda S1
sería más que suficiente y una de las opciones más económicas (NovaSeq 6000 System
Specifications | Output, run time, and more, s. f.).

6.4 Descripción de los pasos del análisis transcriptómico partiendo de los

archivos .fastq hasta la obtención de los transcritos diferencialmente expresados
(incluye los análisis estadísticos pertinentes)

Después de obtener los archivos .fastq de la secuenciación, lo primero que se realiza

es un control de calidad de las secuencias con FastQC lo cual nos proporcionará una visión
general de la calidad de las secuencias, este análisis incluye; la distribución del tamaño de las
secuencias , la presencia de secuencias de adaptadores y la calidad del Phred Score el
contenido de GC. Se continúa con un Trimming o recorte de Secuencias. Dependiendo de los
resultados del control de calidad, puede ser que necesite eliminar adaptadores o
eliminar/recortar las secuencias de baja calidad. Se puede utilizar Trimmomatic (NIH, 2022,)
Como siguiente paso se procede a una alineación de las secuencias a un genoma de
referencia. La herramienta de alineación será HISAT2, ya que es un algoritmo de alineación
eficiente que proporciona una velocidad de alineación rápida. Con las secuencias están
alineadas, el siguiente paso es realizar un conteo de secuencias alineadas a cada gen, lo cual
se realiza utilizando herramientas como HTSeq. Posteriormente de obtener el conteo de
lecturas, se procede a identificar los genes que se expresan diferencialmente entre las
muestras. Para ello, es necesario usar paquetes estadísticos como DESeq2 o edgeR, que están
disponibles en Rstudio. Estas librerías utilizan modelos estadísticos para identificar los genes
que muestran diferencias significativas en la expresión entre las condiciones experimentales.
Ya identificados los genes diferencialmente expresados, se realiza un análisis de
enriquecimiento para identificar las rutas biológicas o los procesos que pueden estar
implicados en las diferencias observadas. DAVID es una herramienta la cual puede ser útil
para esto. Finalmente, validamos nuestros resultados de expresión diferencial utilizando
qRT-PCR en un subconjunto de genes de interés.Por último se diseñaron primers específicos
para los genes que deseamos validar y con una enzima transcriptasa inversa para convertir el
ARN en cDNA para la PCR (GEN Tools - Gene Expression nebulas, s. f.)

5. Cambios en el metaboloma de las Arabidopsis wt vs. mutantes

5.1 Diseño experimental

Tejido a extraer: Hojas de plántulas (las primeras hojas) de Arabidopsis thaliana

(Rodríguez y Kressler, 2018).

Se propone 1 muestra por triplicado por cada genotipo. Con 2 meses de edad
aproximadamente (Böttcher, 2008).

Los autores concluyeron que el fotoperiodo es un factor importante, el cual influye en

la expresión génica en las plantas. Por lo cual recomiendan 8 horas de luz a 23°C y 16 horas
de oscuridad a 18°C. Con un crecimiento de hidroponia con la solución de Hoagland que
cuenta con micro y macro nutrientes como:nitrógeno, hierro, fósforo, boro, potasio,
manganeso, calcio, magnesio, zinc, cobre, azufre y molibdeno (Schmidt et al. 2014).

5.2 Metodología de extracción de metabolitos polares

Esta metodología es una adaptación entre dos metodologías ya establecidas (Grosser y

Van Dam, 2017) y (Doheny-Adams et al. 2017).

1. Se liofiliza el tejido vegetal y posteriormente se pesa la muestra.

2. Se introduce muestra liofilizada en tubos de ensayo de 2 mL

3. Se agrega 1 mL de metanol 70% y vortexear brevemente

4. Se sellan los tubos y se introducen en un baño maría (75°C) por diez minutos para apenas
hervir el metanol, se agita manualmente cada dos minutos.

● Se calienta la muestra sirve para desactivar la mirosinasa, y así evitar la

hidrólisis enzimática de los glucosinolatos.

5. Se centrifugaron las muestras a 4000 rpm por diez minutos a temperatura ambiente.

6. Se preparan columnas para la desulfuración de los glucosinolatos:

● 2g de perlas DEAE Sephadex en 30 mL de ácido acético 2M.

● Se activan las columnas con 2 mL de formiato de imidazol 6M.
● Se lava la columna dos veces con 1 mL de agua.
● Se lava la columna dos veces con 1 mL de acetato de sodio (pH 4)

7. Se agrega el sobrenadante a la columna de desulfuración

● El grupo sulfato de los glucosinolatos se unirá a la columna.

8. Se agrega 1 mL de metanol 70% a la columna para remover componentes apolares como la

clorofila.

9. Se agrega 1 mL de agua para remover el metanol y posteriormente 1 mL de buffer NaOAc

para crear condiciones óptimas para la reacción de sulfatasa.

10. Se agrega 20 μL de sulfatasa y se incuba por 24 horas a temperatura ambiente.

11. Se eluyen los glucosinolatos desulfurados con 1 mL de agua ultrapura.

12. Se guardan las muestras en un refrigerador a 4°C.

5.3 Selección de equipo adecuado de LC-MS, columna de separación, fases

móviles y tipo de ionización y rango de masas a cubrir

El artículo de Schmidt et al. (2014) recomienda el uso de la cromatografía líquida de

alta resolución acoplada a ionización por electrospray y espectrofotometría de masas de
tiempo de vuelo de cuadrupolo (HPLC-ESI-QTOF-MS/MS) para la identificación y
cuantificación de metabolitos polares de extractos vegetales. Esta técnica utiliza una
combinación de cromatografía líquida (HPLC) y espectrometría de masas (MS) para separar
y caracterizar los compuestos de una muestra.

Primero, para separar los glucosinolatos se utiliza una columna C18 de fase reversa,
con una fase móvil polar de 70:30 agua desionizada : acetonitrilo. Se usa como referencia se
sinigrina, un glucosinolato que se encuentra en la familia Brassicaceae. Los glucosinolatos
serán cuantificados midiendo absorbancia a 229 nm (Doheny-Adams, 2017).

Para introducir se usará ionización electrospray, es donde los glucosinolatos entran a

la fuente de ionización como el efluente de HPLC. La solución de glucosinolatos se pasa por
un capilar de metal cargado, el cual provoca la formación de pequeñas gotas de efluentes
altamente cargados. Conforme se evapora el solvente, las moléculas del analito se repelen
hasta que su repulsión de las cargas vence la tensión superficial del solvente y producen
moléculas cargadas del analito. Posteriormente, los iones se mueven hacia el analizador de
masas.

Se usa como analizador de masa cuadrupolar como el QTOF (Quadrupole Time of

Flight) es caracterizado por su alta precisión y fuerte capacidad de cuantificación así como
alta sensibilidad y rapidez. Ya que se combinan los instrumentos TOF y cuadrupolar, teniendo
como base cuatro barras paralelas en par con un cuadrupolo operando como filtro de masas,
el cual selecciona iones dependiendo en su masa-carga (m/z). La segunda parte del
cuadrupolo tiene el fin de funcionar como una celda de colisión, donde tiene el propósito de
fragmentar los iones despues de ser bombardeados con moléculas de un gas neutro, como
nitrógeno o argón. Posteriormente, los iones se introducen en el analizador de TOF, donde los
más ligeros atraviesan más rápido el tubo hacia el detector. Los espectros serán analizados en
el rango m/z de 100-1700 Da, en el modo de ionización negativa que visualiza a los
glucosinolatos (Doheny-Adams et al. 2017).

5.4 Selección de una corrida cromatográfica adecuada para el estudio (puede ser
una publicada)

Com el método de Doheny-Adams, 2017 del análisis HPLC de glucosinolatos. Se

tiene que equilibrar una columna C18 durante 3 h en fase móvil de de 80 ml (0,02 M) de
TBA (bromuro de tetrabutilamonio) y con 20 ml de ACN (acetonitrilo) con una detección a
229 nm. Para esto los glucosinolatos se cuantifican utilizando el cromatograma de 229 nm. El
caudal se fija a 1.0 ml/min y se utilizan 2 soluciones (Son preparadas como se menciona en el
artículo) :

● Solución A: 100 % TBA (0,02 M)

● Solución B: 70:30, TBA (0.02 M): acetonitrilo,

Finalmente, se realizaron curvas patrón utilizando distintos reactivos como; sinigrina

pura (Sigma Aldrich), glucotropaeolina, glucorafenina, glucorafanina, glucerucina,
glucobrassicina, gluconasturtina, sinalbina, progoitrin y glucoiberina (phytoplan). Se utiliza
un detector MS Bruker maXis UHR-TOF para identificar glucosinolatos, se utiliza un corrida
utilizada por Doheny-Adams, 2017 con los siguientes ajustes: Fuente de electrospray
estándar (flujo 1/10 de LC) Nebulizador: 2.0 bar, gas seco: 6.0 L/min, calentador de gas seco:
25 °C, voltaje capilar: 3500 V, polaridad de iones: positivo y tasa del espectro: 1 Hz

5. 5 Descripción de los pasos del análisis metabolómico partiendo de los archivos

.xml hasta la obtención de los metabolitos diferencialmente expresados (incluye los
análisis estadísticos pertinentes).

Primero se tiene que realizar una preparación de los datos. Los datos en formato .xml
suelen contener información sobre la concentración de los metabolitos en las muestras. Está
normalmente representada en forma de tablas o gráficos. En esta etapa, es importante realizar
una serie de comprobaciones para asegurarse de que los datos son correctos y completos
(Lamb et al. 2012) .

Después se procede a filtrar los datos. En esta etapa, se borran los datos que no
cumplen con los criterios de calidad establecidos. Son datos que se encuentran fuera del
rango de tolerancia establecido (Moeller and Richter, 2011).
 Para seguir en la normalización de los datos se ajustan los datos para que sean
comparables entre sí en RStudio esto por si existe alguna diferencia ajustar la profundidad de
secuencia como TMM. Posteriormente un PCA (análisis de componentes principales) para
poder ver las variabilidad entre las muestras y poder ver los patrones de agrupamiento y
percatarnos de cualquier patrón de agrupamiento (Finley et la. 2009).

Después realizar un análisis de calidad de datos para poder ver la calidad, la

distribución de expresión y la proporción de los genes expresados para poder asegurarnos que
los datos sean confiables (Moeller and Richter, 2011).

Para analizar los datos para identificar los metabolitos diferencialmente expresados.
Esto se puede hacer mediante una serie de métodos, como la prueba t de Student, la prueba
ANOVA o la prueba de Wilcoxon. Pero se recomienda más ANOVA (Lamb et al. 2008).

6. Proponer un modelo murino en el cual evaluar el efecto de la sobreexpresión de la

síntesis de glucosinolatos en Arabidopsis thaliana. Explicar la metodología de evaluación
que se utilizará.

Para evaluar el efecto de la sobreexpresión de la síntesis de glucosinolatos en

Arabidopsis thaliana en un modelo murino, se puede integraron diferentes protocolos para
desarrollar el siguiente protocolo:

Se propone un modelo de Ratones BALB/c hembras, de 6-8 semanas de edad para

determinar la efectividad de los glucosinolatos indólicos que se logran sobreexpresar con la
transformación de A. thaliana. La línea celular del carcinoma mamario 4T1 crece en ratones
BALB/c. Esta línea celular tiene una alta densidad tumoral e invasiva, la cual llega a hacer
metástasis espontáneamente desde un tumor primario en la glándula mamaria a múltiples
sitios, entre ellos la sangre, hígado, cerebro y huesos (Pulaski BA et. al. 2001).

Se propone un diseño experimental en ratones BALB/c con la inducción de la línea

celular 4T1, teniendo un control negativo y un control positivo, alimentando a uno con
indol-3-carbinol constantemente, así observaremos el desarrollo de la línea celular y
probaremos la efectividad de la prevención del crecimiento del tumor en las glándulas
mamarias. Teniendo como hipótesis la inhibición significativa del crecimiento tumoral en el
ratón experimental, una respuesta cancerígena en el ratón de control positivo, y un desarrollo
normal en el ratón con control negativo.

Primero que nada se necesita generar ratones transgénicos que expresen de forma
constitutiva el gen de la síntesis de glucosinolatos de Arabidopsis thaliana. Esto se puede
hacer mediante la transfección de células embrionarias de ratón con un vector de expresión
que contenga el gen de interés. Una vez que se cuenten con los ratones transgénico se deben
seleccionar aquellos que expresan de forma correcta el gen de interés. Esto se puede hacer
mediante la detección de la expresión del gen utilizando técnicas como la PCR o la
inmunohistoquímica (Moeller and Richter, 2007).

Con los ratones seleccionados se necesita realizar una trasplante de células tumorales,
para esto se puede realizar con una inyección intraperitoneal o intratumoral que cuente con
las células tumorales de la línea celular 4T1. Para poder evaluar el crecimiento de los tumores
a lo largo del tiempo,se realizarán mediciones periódicas del tamaño del tumor usando un
calibrador vernier. Además, los ratones se pesarán regularmente para monitorizar su estado de
salud general y se recogerán muestras de sangre para análisis clínicos. De igual forma esto se
puede hacer mediante técnicas como la tomografía computarizada (TC), la resonancia
magnética (RM) o la ecografía. (Van Diest et al. 1987).

Posteriormente, para poder investigar serán sacrificados y se llevarán a cabo autopsias

para visualizar si existe la presencia de metástasis en otros órganos. También se realizan
análisis histológicos en las secciones de los tumores para estudiar los cambios celulares y
tisulares (Silverberg, S. J. 2003). De igual forma, para validar los resultados in vivo, se
propone unos estudios in vitro con la línea celular 4T1 para investigar y entender los
mecanismos moleculares subyacentes a los efectos observados y conocidos. Estos estudios
son variados, pueden ser ensayos de viabilidad celular, análisis de la inducción de la
apoptosis, y la evaluación de las alteraciones en los niveles de expresión de genes al igual que
las proteínas relevantes para la progresión del cáncer. Finalmente, los resultados obtenidos
brindaron una base sólida con el cual se pueda desarrollar una estrategias de prevención y
tratamiento del cáncer basadas en el uso de glucosinolatos (Junqueira et al. 2009).

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