Aplicación de la Metabolómica en el Estudio

Y Diagnóstico de Enfermedades

Adrián Rodríguez Fernández.

Huelva

04/04/2016
Introducción

Las principales técnicas ómicas desarrolladas durante los últimos años son la genómica,
la transcriptómica, la proteómica y la metabolómica, sin embargo, cada una de ellas han ido
ramificándose. Todas ellas aportan grandes avances en el conocimiento de temas biológicos,
además de traer consigo un enorme desarrollo en el campo del análisis de la funcionalidad
celular.

Metabolómica

La metabolómica cataloga y cuantifica las moléculas pequeñas que se encuentran en los

sistemas biológicos. Es una nueva rama en bioquímica analítica que está relacionada con el
metabolismo. Los subproductos del metabolismo, conocido como metabolitos, se encuentran
en muestras biológicas tales como orina, saliva y plasma sanguíneo. La metabolómica se
refiere al estudio de estos perfiles metabólicos como producto de muestras biológicas. En el
caso de la biología vegetal, muestras de tejido específico se utilizan para perfilar metabolitos.

Figura 1. Ejemplo de señales y analitos obtenidos mediante el estudio metabolómico.

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 Existen dos enfoques complementarios que se utilizan para las investigaciones
metabolómicas: diseño de perfiles metabólicos y metabolitos de rastro digital. En la
generación de perfiles metabólicos, los métodos de análisis cuantitativos se utilizan para medir
metabolitos de una clase determinada. En la huella metabólica, las huellas dactilares se
comparan para determinar si los metabolitos han cambiado debido a la enfermedad o la
exposición a las toxinas. Para hacer este tipo de comparación podrían utilizarse
cromatogramas y métodos estadísticos. Es un método semicuantitativo que realmente puede
aplicarse a una amplia gama de metabolitos. Este nuevo enfoque para el estudio del perfil
metabólico no se hubiese podido producir sin los últimos avances tecnológicos, tanto en la
resonancia magnética nuclear (RMN) como en la espectrometría de masas (MS). No obstante,
a su vez, dichos avances no hubieran sido suficientes sin una evolución en paralelo de las
herramientas informáticas y de tratamiento estadístico necesario.

Se espera que la metabolómica pueda ayudar al cuidado de la salud de muchas

maneras. Debe ser capaz de producir medicamentos más seguros y mejorar la identificación de
grupos de personas que puedan beneficiarse de un medicamento. También puede contribuir a
diagnosticar enfermedades y controlar diversos tratamientos de salud. Integrada con la
proteómica y genómica, la metabolómica se utiliza, por ejemplo, para averiguar por qué
algunas personas son más susceptibles a daño hepático por parte de ciertos fármacos. Se
espera que proporcione biomarcadores para estudiar la exposición a enfermedades y toxinas
(Figura 2).

Figura 2. Búsqueda de metabolitos clave (biomarcadores).

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 Como parte de la genómica funcional, la metabolómica puede ser una herramienta para
estudiar la función de los genes, a través de la mutación o inserción de los mismos. La
metabolómica podría servir para correlacionar los perfiles de metabolitos de fluidos y órganos
con patologías, constitución genética y dietas.

Donde realmente puede ser útil la metabolómica es en la medicina personalizada.

Actualmente, cuando elegimos un tratamiento para una persona enferma, conocemos muy
poco sobre su fenotipo y sobre las probables reacciones frente al tratamiento elegido. El
conocimiento de las variables metabolómicas debería servir para predecir la reacción de un ser
vivo a la administración de los medicamento y/o alimentos, de tal manera que el tratamiento
podría particularizarse para cada individuo, eligiendo el mejor principio activo y la dosis más
efectiva.

Otro ámbito realmente interesante al que la investigación metabolómica puede contribuir

es la detección de factores de riesgo en poblaciones. A partir de un análisis de orina (o suero),
sería extraordinario poder conocer para un individuo determinado, qué factores de riesgo
presenta, a qué tipo de enfermedades está predispuesto (antes de desarrollarlas), y una
estimación sobre la probabilidad de desarrollarlas. Han surgido nuevas aproximaciones
“ómicas” para separar los distintos tipos de metabolitos relacionados con la enfermedad de la
obesidad; lipodómica (estudio de lípidos y ácidos grasos); glucómica (estudio de carbohidratos)
y otros (Figura 3).

Figura 3. Integración de la metabolómica con las otras ciencias ómicas.

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Procedimiento Experimental

El tratamiento de las muestras de suero se realizó de manera que se pudiera obtener

el mayor número de metabolitos posible. Debido a la gran diversidad de metabolitos el
tratamiento de suero se realiza mediante una extracción secuencial de dos etapas: una
primera en la que se eliminan las proteínas y se extraen los metabolitos polares, y una segunda
etapa en la que se recuperan los metabolitos con carácter lipofílico.

Las proteínas del suero se precipitan para reducir los efectos que puede ejercer la
matriz en el análisis e incrementar la reproducibilidad de la extracción ya que se evita el
enmascaramiento de metabolitos de bajo peso molecular y metabolitos polares. En un tubo
Eppendorf se mezclan 100 μL de suero con 400 μL de una mezcla 1:1 metanol / etanol (1:1 v/v,
MeOH:EtOH) y se agita durante 5 min en vórtex a temperatura ambiente, seguido de
centrifugación durante 10 min a 4000 rpm a 4ºC.

También se ensayó con dos mezclas orgánicas distintas: metanol/etanol (1:1) y

acetonitrilo/metanol/acetona (1:1:1). El análisis de los extractos obtenidos con ambos
métodos proporcionaron resultados similares (tanto en metabolitos extraídos como en
sensibilidad). Sin embargo, con el primer método se consigue un extracto más “limpio”, con
menos partículas en suspensión.

Posteriormente, se lleva a sequedad el extracto polar (sobrenadante) con la ayuda de

una corriente de nitrógeno, para luego ser resuspendido en el momento del análisis con una
mezcla 8:2 de metanol:agua (MeOH:H2O) con 0,1% que favorece la ionización de las especies
en la modalidad de ESI + en el análisis.

Por otra parte, el precipitado producido anteriormente (pellet) se somete a una

segunda extracción con una mezcla 1:1 de cloroformo:metanol para la obtención del extracto
apolar o lipofílico. De nuevo, la mezcla se somete a agitación en el vórtex durante 5 minutos y
se centrifuga a 10000 rpm durante 10 minutos a 4 ºC.

El sobrenadante se lleva a sequedad con ayuda de la corriente de N2 y se reconstituye

con una mezcla 6:4 de diclorometano:metanol y 10 mM de acetato de amonio (AcNH4).

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Identificación de metabolitos

La identificación de metabolitos se realizó mediante MS/MS y con ayuda de bases de

datos. El empleo del sistema híbrido QqQ-TOF permite, además de obtener resultados con
elevada resolución y exactitud de masas, llevar a cabo la identificación estructural de
metabolitos mediante MS/MS. Para ello, los metabolitos precursores (preseleccionados en el
primer cuadrupolo) son fragmentados en la cámara de colisión (en este caso el Q2) empleando
un gas de colisión (N2) y una diferencia de potencial (energía de colisión, CE). Los fragmentos
generados llegan al TOF, donde son detectados, obteniéndose así un espectro de masas
característico del metabolito estudiado para las condiciones experimentales empleadas
denominado perfil de fragmentación.

Figura 4. Comparativa del funcionamiento de un sistema Q-TOF

en modo full scan (superior) y MS/MS (inferior).

El conocimiento de la masa exacta del analito junto a su perfil de fragmentación

permite llevar cabo la identificación de la estructura. Para ello se utilizaron bases de datos
disponibles en la red. Una de las bases de datos más importantes en estudios de
metabolómica en salud es la Human Metabolome DataBase (http://www.hmdb.ca), que
proporciona acceso a una gran cantidad de información sobre metabolitos humanos
(propiedades físicas, espectros de masas y de RMN, rutas metabólicas en las que se ve
implicado, etc).

También fue utilizado el Mass Bank (http://www.massbank.jp), de gran interés en

estudios de espectrometría de masas. Otra base de datos que también se empleó en este
estudio fue la Metlin (http://metlin.scripps.edu), con un gran número de entradas (>20000
metabolitos).

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Tratamiento de Datos

Debido a que el número de muestras y variables en el estudio es muy elevado, es de

gran utilidad el empleo de herramientas estadísticas. En metabolómica, el análisis
multivariante del conjunto de espectros permite establecer relaciones de diferencia y similitud
entre los individuos que se están estudiando. De esta manera, se pueden encontrar las
variables que causan las diferencias entre los grupos y construir modelos predictivos.

El primer grupo de modelos de análisis multivariante es el de los modelos no

supervisados, en los que el análisis estadístico se lleva a cabo sin un conocimiento a priori de a
qué grupo pertenecen las distintas muestras estudiadas. Entre ellos se pueden nombrar el
análisis de componentes principales (PCA) - (Principal Components Analysis) - y el análisis de
clusters (CA) (Cluster Analysis). En el PCA, para llevar a cabo el reconocimiento de pautas, el
elevado número de variables del experimento deben reducirse, encontrando nuevas variables
(combinaciones de las originales, denominadas componentes) que sean capaces de explicar la
mayor variabilidad posible de los resultados. Por otro lado, el objetivo del análisis cluster es
clasificar las muestras atendiendo a la similitud en los valores de las distintas variables,
empleando para ello diagramas en forma de dendograma.

Alternativamente, en los modelos supervisados de análisis se indica a qué grupo de

estudio pertenece cada una de las muestras analizadas (por ejemplo enfermos frente a sanos),
de modo que la búsqueda de los elementos diferenciantes se fuerza hacia donde se encuentra
la mayor discriminación entre los grupos indicados, consiguiéndose mejores clasificaciones que
en los no supervisados. Dentro de los modelos supervisados destacan el análisis discriminante
lineal (LDA) y el análisis discriminante de los mínimos cuadrados parciales (PLS-DA), ambos
basados en la búsqueda de combinaciones de las variables originales que expliquen la mayor
variabilidad posible.

El pre-procesado de los datos obtenidos por ESI-QqQ-TOF-MS fue tratado con el

software MarkerViewTM 1.2.1 (AB-Sciex). Para el análisis y visualización de los métodos
estadísticos multivariante se empleó el software estadístico Soft Independent Modeling of Class
Analogy (SIMCA-P 11.0, Umetrics AB, Umea, Sweden).

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Resultados y Discusión

La aplicación de los métodos de análisis anteriormente descritos a extractos de suero

sanguíneo permitió la obtención de una serie de perfiles metabolómicos con una elevada
sensibilidad y reproducibilidad. Estudiando los datos y los resultados obtenidos se consiguió
confirmar la presencia de un buen número de metabolitos en los diferentes perfiles
espectrales, permitiendo así la comparación de dichos espectros para confirmar y concluir qué
metabolitos pueden considerarse como marcador biológico para detectar el cáncer de pulmón.
El análisis del extracto polar procedente del método de extracción secuencial mediante ESI (+)-
QqQ-TOF-MS proporciona un amplio perfil metabolómico, con señales en un rango de m/z
entre 80-850. Una gran parte de estas señales se encuentran a valores de m/z bajos,
correspondientes a metabolitos de bajo peso molecular (Figura 5).

Figura 5. Espectro ESI (+)-QqQ-TOF-MS (extracto polar).

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 A simple vista, por inspección visual de los perfiles, es muy difícil encontrar diferencias
significativas debido a la gran similitud entre los dos grupos de estudio, considerando tanto los
perfiles obtenidos por ESI (+)-QqQ-TOF-MS.

Para el estudio estadístico de estos resultados se ha aplicado el paquete estadístico

multivariante SIMCA-P (Umetrics) como se comentó anteriormente. La técnica se ha aplicado a
los resultados de las muestras.

A su vez es posible realizar las representaciones de:

- “scores plot”, los cuales resumen la variabilidad entre muestras, y por lo tanto, nos
permiten separar los grupos de estudio.

- “loadings plot” que muestran la variabilidad entre las variables de estudio y nos
permiten conocer la importancia de las distintas variables en la separación de los grupos.

Figura 6. PLS-DA para los resultados del extracto polar.

Se puede observar una clara separación entre los diferentes grupos de estudio de
modo que hay una progresión a medida que se avanza tanto en el eje de abscisas como en el
eje de ordenadas. La componente uno separa al grupo de sanos del grupo de enfermos,
quedando el grupo de sanos a la izquierda, el enfermo a la derecha y en medio el grupo de
control, del mismo modo que la componente tres separa estos grupos de manera similar. Hay
una progresión entre los grupos. La enfermedad avanza de izquierda a derecha.
Con el fin de encontrar las variables que permiten discriminar entre los grupos, y que
puedan servir como potenciales biomarcadores se representó el PLS-DA de las clases dos a dos.
Se comparará el Control vs Enfermo con el objetivo de encontrar posibles marcadores que
sirvan para detectar la enfermedad.

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 Figura 7. PLS-DA de los grupos Enfermo (negro) y Control (azul) en el extracto polar.

Conclusiones

1. Las plataformas metabolómicas basadas en análisis directo mediante espectrometría de

masas que se han optimizado presentan un gran potencial para realizar un primer screening
metabólico de múltiples fluidos y tejidos biológicos, gracias a su amplia cobertura analítica,
reducido tiempo de análisis y simplicidad instrumental.

2. La combinación de plataformas metabolómicas complementarias basadas en el

acoplamiento de técnicas de separación ortogonales y posterior detección mediante
espectrometría de masas permite llevar a cabo una investigación más exhaustiva de la
totalidad del metaboloma.

3. La aplicación de estas técnicas metabolómicas permitió detectar numerosas alteraciones

metabólicas en suero sanguíneo asociadas a la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer.

4. Los perfiles metabolómicos de suero de pacientes de Alzheimer y ratones APP/PS1

mostraron grandes similitudes, demostrando el potencial de este modelo transgénico en el
estudio de la enfermedad de Alzheimer.

5. Los perfiles metabolómicos de hígado, riñón, bazo y timo mostraron cambios significativos
en los niveles de múltiples metabolitos, muchos de los cuales son comunes a los ya descritos
en suero y cerebro, confirmando la naturaleza sistémica de este trastorno neurodegenerativo.

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Bibliografía

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