Laboratorio N°4

FUNCIÓN HEPÁTICA

Introducción
El hígado es el órgano de mayor tamaño y complejidad metabólica, realiza muchas funciones sintéticas,
catabólicas, detoxificadoras, digestivas e inmunológicas. La enfermedad hepática puede ser provocada
por virus, fármacos tóxicos, patología de la vía biliar, patología vascular, enfermedades sistémicas o una
situación fisiológica especial como el embarazo.
El hígado se compone de unidades hexagonales llamados lobulillos hepáticos, formados por láminas
fenestradas de hepatocitos, que se ubican cerca de sinusoides sanguíneos. La vena porta irriga al hígado
y procede del intestino. La vena porta junto a la arteria hepática y los conductos biliares forman la triada
portal. La sangre del hígado sale por la vena hepática.
Las vías biliares se inician entre hepatocitos adyacentes, cada lóbulo del hígado (derecho e izquierdo)
tiene su conducto biliar y ambos se unen en un conducto hepático común, el cual se une al conducto
cístico (que sale de la vesícula biliar) para formar el colédoco. Este conducto lleva la secreción biliar al
intestino, antes de llegar se une al conducto pancreático. Antes de desembocar en el intestino se dilata
y forma la ampolla de Vater y su apertura está regulada por el esfínter de Oddi. La obstrucción en
cualquier punto de este circuito produce la colestásis.
Funciones del hígado
El hígado se encarga de metabolizar hidratos de carbono mediante gluconeogénesis, glucogeólisis y
glucogénesis.
Metaboliza lípidos, sintetiza lipoproteínas, colesterol, triglicéridos y ácidos biliares a partir de colesterol.
Sintetiza proteínas plasmáticas como albúmina y lipoproteínas.
Sintetiza factores de coagulación, fibrinógeno, factores K dependientes y globulina aceleradora.
Enfermedades hepáticas: a menudo son silenciosas hasta períodos tardíos.
- Enfermedad hepatocelular: se deben a daño o lesión del hepatocito, puede afectar zonas puntuales
o destruir la mayor parte del órgano, conduciendo a una insuficiencia hepática.
Hepatitis aguda: de origen viral, alcohólica, mononucleosis.
Hepatitis crónica: viral o autoinmunes.
Ictericia obstructiva (obstrucción biliar)
- Enfermedad coletásica: afección en la que el flujo de bilis hacia el duodeno se hace más lento o se
detiene. Las causas pueden ser intra o extrahepáticas.
Intrahepática: asociada a la destrucción del hepatocito. Causas: embarazo, cirrosis, hepatitis víricas o
fármacos.
Extrahepática: causas: cálculos en colédoco, carcinoma de cabeza de páncreas, fibrosis del conducto
biliar.

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PRUEBAS BIOQUÍMICAS DE LA FUNCIÓN HEPÁTICA
Estas pruebas de rutina se realizan para diagnóstico, pronóstico y seguimientos de pacientes con
enfermedad hepática. Estas determinaciones indican la naturaleza del problema y no la causa.
1- Determinaciones enzimáticas
- Transaminasas: GOT y GPT
- Fosfatasa alcalina
- Gammaglutamil transferasa
- 5’nucleotidasa
- Colinesterasa
2- Medición de metabolitos
- Bilirrubina sérica
- Albúmina
- Pruebas de coagulación: tiempo de protrombina (TP) e índice normatizado internacional (RIN)

1- EVALUACIÓN DEL DAÑO HEPATOCELULAR

Transaminasas
El aumento de estas enzimas se observa ante la alteración del hepatocito debido a cualquier causa.
Valores muy altos se dan en necrosis hepáticas y valores moderadamente aumentados en colestasis y
cirrosis.
La GOT (transaminasa glutámico-oxalacética) o ASAT (aspartato aminotransferasa) se encuentra en
mitocondrias y citoplasma mientras que la GPT (transaminasa glutámico pirúvico) o ALAT (alanina
aminotransferasa) solo en citoplasma.
La GPT se eleva más que la GOT en daño hepático moderado y es al revés ante daños más acentuados
como necrosis. La GPT tiene tiempo de vida mayor que GOT.

Determinación de GOT y GPT método colorimétrico

Fundamento
𝐆𝐏𝐓
PPL
alanina + α − cetoglutarato ↔ piruvato + glutamato
𝐆𝐎𝐓
𝐏𝐏𝐋
aspartato + α − cetoglutarato ↔ oxalacetato + glutamato

Como oxalacetato es inestable se transforma en piruvato, este producto reacciona con 2,4-
dinitrofenilhidrazina en medio básico, dando un compuesto coloreado que se mide a 505nm.

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2- EVALUACIÓN DE LA DISFUNCIÓN DE LA CÉLULA HEPÁTICA
Pruebas de conjugación: determinación de pigmentos biliares
La bilirrubina es un pigmento amarillo rojizo que resulta del catabolismo del grupo hemo de la
hemoglobina, circula en plasma unida a albúmina y es captada por el hígado.
A nivel de la membrana del hepatocito, la bilirrubina se separa de la albúmina y es transportada por
proteínas hasta el retículo endoplásmico, allí se conjuga con el ácido glucurónico y forma la bilirrubina
conjugada o directa. La bilirrubina libre se denomina bilirrubina no conjugada o indirecta. La bilirrubina
total es la suma de las dos.
La bilirrubina conjugada es soluble, no tóxica y se excreta a través de la bilis, que llega al intestino donde
es degradada a estercobilinógeno, producto que se oxida a estercobilina. Cuando está muy aumentada
aparece en orina por ser hidrosoluble, como urobilinógeno que se oxida a urobilina.
Los valores elevados indican destrucción excesiva de eritrocitos. El aumento de urobilina o
urobilinógeno pueden indicar hemólisis, daño hepático, hepatitis.
- Ictericia: pigmentación amarilla de la piel debida a una elevación sérica de bilirrubina. Puede
deberse a:
- Aumento de bilirrubina que llega al hepatocito: debido a la destrucción de glóbulos rojos o de
eritrocitos inmaduros en médula ósea.
- Captación y transporte defectuoso por parte del hepatocito: ictericia típica en recién nacidos.
- Trastornos de conjugación: ictericia neonatal, especialmente en prematuros donde el sistema
de la gluconil-transferasa está inmaduro.
- Trastornos de la excreción de bilirrubina: ambas bilirrubinas se ven aumentadas.
Determinación de bilirrubina método colorimétrico
Fundamento
La bilirrubina directa reacciona con ácido sulfanílico diazotado produciendo un pigmento color rojo-
violáceo (azobilirrubina) que se mide a 530nm.
La bilirrubina indirecta también lo hace pero requiere de la presencia de un desarrollador acuoso, se
utiliza benzoato de cafeína para que la reacción ocurra.
Muestra Suero
Procedimiento Se preparan los tubos (blanco, bili directa y bili total) y se mezclan por inversión. La
lectura puede hacerse entre los 4 y 15 minutos pero para la bilirrubina directa se debe leer a los 5
minutos exactos. Si la lectura se hace antes los valores darán por debajo, debido a que la reacción no se
completó, y si se hace después dará valores superiores porque comienza a reaccionar la bilirrubina
indirecta.
Para sueros ictéricos se usa 20 o 50 μL de muestra y luego se multiplican los resultados por los factores
respectivos.

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Curva de calibración de bilirrubina
- Testigo: 500 μg de bilirrubina pura en 5 mL de agua destilada. Mezclar varias veces durante 30
minutos.
- Preparar 3 tubos de concentraciones crecientes y sus respectivos blancos, leer a 530nm. La reacción
es estable 15 minutos.
- Restar a las lecturas de los tubos la del blanco respectivo, con estos valores armar la curva de A vs. C
Factor = bilirrubina (mg/L) / lectura corregida
- Calcular cada factor y sacar el factor promedio
Pruebas de evaluación de la función de síntesis: medición de proteínas plasmáticas y factores de
coagulación
ALBÚMINA
La síntesis de albúmina es una función importante del hígado, a medida que avanza la enfermedad
hepática los valores caen por la menor síntesis. Esto ocurre en hepatopatías agudas y crónicas y es un
índice de gravedad de daño.
La hipoalbuminuria también puede depender de otros factores como el estado nutricional, el
catabolismo, factores hormonales y pérdidas urinarias o gastrointestinales, que deben tenerse en
cuenta al interpretar los resultados.
γ-GLOBULINAS
Estas proteínas aumentan en hepatopatías crónicas, como cirrosis.
- IgA aumenta en cirrosis inicial
- IgG e IgM aumentan en estados cirróticos más avanzados
- IgG aumenta en hepatitis crónicas
TIEMPO DE PROTROMBINA (TP)
El hígado sintetiza factores de coagulación y el daño hepático puede dar pruebas anormales de
coagulación.
El TP mide la tasa de conversión de protrombina en trombina, que requiere de los factores II, V, VII y X, y
refleja la capacidad de síntesis hepática. La vitamina K es necesaria para la gammacarboxilación de los
factores mencionados.
El TP puede estar prolongado en el déficit de vitamina K, la administración de esta vitamina permite
saber si la causa es por malabsorción de grasas. En enfermedades hepáticas graves existe deficiencia de
factores V y I por una fibrinólisis.
3- COLESTASIS: enzimas plasmáticas del conducto biliar
FOSFATASA ALCALINA (FAL): esta enzima cataliza la hidrólisis de fosfatos inorgánicos, a pH alcalino,
principalmente en hígado y huesos pero también se encuentra en intestino, riñón, placenta y leucocitos.

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Su aumento puede ser fisiológico, en el primer trimestre del embarazo y en adolescentes, o patológico,
en la obstrucción de conductos biliares, cirrosis biliar, colestasis provocada por esteroides y anabólicos,
enfermedad hepática o patología ósea.
La FAL hepática se encuentra en la parte canalicular y luminal del epitelio de los conductos biliares, su
aumento puede no verse hasta uno o dos días después de la obstrucción biliar. Existen 8 izoenzimas y
ante un aumento se debe determinar cuál es mediante electroforesis para determinar el daño hepático.
Determinación de FAL método colorimétrico
Fundamento
La FAL hidroliza al p-nitrofenilfosfato, liberando fosfato y p-nitrofenol. El anion p-nitrofenolato tiene
color amarillo y su intensidad es proporcional a la actividad de la enzima. Se lee a 405nm luego de 30
minutos de incubación.
Procedimiento: preparar dos tubos a 37°C, un tubo blanco y un desconocido con el sustrato. Preincubar
unos minutos, adicionar la muestra al desconocido, mezclar e incubar 30 minutos. Luego se agrega
NaOH (20 mmol/L) y se agrega la muestra al blanco. Mezclar y leer a 405nm.
Cálculos

Valores de referencia Adultos 120 – 50 UI/L

Niños 38 – 140 UI/L

FOSFATASA ALCALINA TERMOESTABLE

El suero fresco se divide en dos fracciones, una se inactiva 10 min a 56°C, la otra no. Se determina FAL
en las dos fracciones. La inactiva es la FAL termoestable y la no inactiva es la total.
FAL total ----------------- 100 %
FAL termoestable ------ X %
- Normal: 22 – 33 %
Valores de referencia - En enfermedades esqueléticas menor a 24 % FAL termoestable
- En hepatobiliares mayor de 40 % FAL termoestable
5’ NUCLEOTIDASA
Es una hidrolasa asociada a las membranas plasmáticas sinusoidales y canaliculares. Su presencia en
suero indica acción de sales biliares sobre dichas membranas. Alcanza valores elevados en obstrucciones
intra y extrahepáticas y lesiones infiltrativas del hígado. Se observan valores moderadamente elevados
en lesiones hepatocelulares.

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Determinación de 5’ nucleotidasa método colorimétrico
Fundamento
La 5’nucleotidasa cataliza la desfosforilación de fosfonucleótidos con grupos fosfatos en posición C5 del
anillo de ribosa (como el AMP), con actividad máxima a pH 7,5. A dicho pH el AMP también es
hidrolizado por las fosfatasas alcalinas presentes en la muestra:
FAL +5′nucleotidasa
AMP + H2 O → Adenosina + Pi
La 5' nucleotidasa es inhibida por iones Ni++. La diferencia de medida entre el fosfato liberado en
presencia y ausencia de iones Ni++, es proporcional a la actividad de la enzima.
Procedimiento Se prepara un tubo desconocido total y un desconocido inhibido al que se le agrega
cloruro de niquel. Se lee entre 620 y 650 nm.
Valor de referencia Hasta 15 UI/L
γGT: glutamil transferasa
Es una enzima que se encuentra en membranas celulares de hígado, riñón, páncreas, bazo, corazón,
cerebro y vesículas seminales. Su actividad se encuentra elevada ante colestasis y enfermedades
hepáticas, biliares y pancreáticas.
Determinación de γ-GT método cinético
Fundamento
La γGT cataliza la siguiente reacción:
γGT
γ − glutamil p − nitroanilida + glicil − glicina → γ − glutamil glicil − glicina + p − nitroanilina
Técnica Se coloca el reactivo y la muestra, se mide la absorbancia al tiempo 0 y luego cada 1 minuto (1, 2
y 3). Se saca el promedio de las absorbancias, se multiplica ese valor por el factor y se determina la
concentración de enzima en la muestra.

COLINESTERASA (CHE)
Esterasa que hidroliza ésteres de colina. Hay dos: la colinesterina verdadera o eritrocitaria de tipo I y la
sérica o tipo II que se sintetiza en el hígado y se encuentra en otros órganos (cerebro, riñón, intestino y
páncreas). La síntesis de la colinesterasa tipo II es inhibida por varios compuestos y disminuye en
algunas hepatopatías, como cirrosis.

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Determinación de colinesterasa método cinético
Fundamento
La colinesterasa sérica cataliza la hidrólisis de los éteres de colina con actividad máxima a pH 7,7. La
tiocolina liberada reacciona con ácido 5-5’ditiobis-2-nitrobenzoico dando un compuesto amarillo.
La velocidad de aparición de color es proporcional a la actividad enzimática y se mide a 405 nm.
CHE
butirilcolina + H2 O → tiocolina + butirato

tiocolina + DTNB → 2 − nitro − 5 − mercaptobenzoato

Técnica Preincubar el sustrato y luego adicionar 20 μL de suero. Leer absorbancia al minuto 0 y luego de
30, 60 y 90 segundos. Restar cada lectura de la anterior y promediar los valores.
Páncreas exocrino el páncreas tiene funciones secretoras endocrinas y exocrinas. La secreción exocrina
corresponde al jugo pancreático que contiene bicarbonato que ayuda a neutralizar el contenido
duodenal y enzimas para la digestión de carbohidratos, proteínas y grasas. Esta secreción está regulada
por señales nerviosas y hormonales.
La mayor parte de las enzimas del páncreas se encuentran desactivadas en forma de zimógenos, por lo
que su valoración no es útil para el diagnóstico de enfermedades pancreáticas.
El jugo pancreático contiene α-amilasa y lipasas para la digestión de lípidos, como la triaglicerol
hidrolasa, colesterol éster hidrolasa y fosfolipasa A2.
La determinación de la actividad de amilasa y lipasa es la forma principal de diagnóstico de pancreatitis
aguda y crónica, donde hay un aumento en la liberación de estas enzimas en sangre y orina.
AMILASA
Es una enzima que cataliza la hidrólisis de aminopeptina, amilosa, glucógeno y sus productos
parcialmente hidrolizados. La α-amilasa escinde las uniones α,1-4 glucosídicas de los polisacáridos. La
amilasa libera maltosa y glucosa mientras que la amilopeptina produce oligosacáridos ramificados y no
ramificados.
La α-amilasa disminuye la capacidad de la amilasa y del almidón para teñirse de azul con yodo.
Determinación de amilasa: método amiloblástico yodométrico
Fundamento Se incuba almidón tamponado con la muestra, produciéndose la hidrólisis enzimática. La
reacción se detiene por el agregado del reactivo de yodo, el cual produce color con el remanente de
almidón no hidrolizado (que no reaccionó). La disminución de color respecto a un sustrato sin muestra
es la medida de la actividad enzimática y se expresa en unidades amilolíticas/dL.
Es una reacción inversamente proporcional ya que a mayor cantidad de enzima, mayor es la reacción,
menor el remanente y por lo tanto menor el color final.
Procedimiento se prepara un tubo testigo y un control. Se incuba a 37°C (para que ocurra la reacción
enzimática). Leer a 640 nm.

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Cálculos
𝑈𝐴 𝐴𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 − 𝐴𝑑𝑒𝑠𝑐𝑜𝑛𝑜𝑐𝑖𝑑𝑜
𝐴𝑚𝑖𝑙𝑎𝑠𝑎 ( ) = . 1000
𝑑𝐿 𝐴𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙
Unidad amilolítica: es la cantidad de enzima contenida en 100 mL de muestra, que puede hidrolizar 10
mg de almidón en 30 minutos.

Valores de referencia Normal en suero 60-120 UA/dL

Normal en orina 30-260 UA/dL

También se puede determinar en saliva.

Determinación de amilasa en orina
Toma de muestra El paciente debe descartar la primera orina, luego de dos horas orinar y recoger toda
la orina, así la muestra corresponde a una diuresis de 2 horas. Se diluye a 200 mL con agua destilada. Se
usan 20 μL de la dilución para las mediciones. El resultado se expresa en UA/hora.
LIPASA
Son enzimas muy lábiles al calor y al pH ácido e hidrolizan enlaces éster y ácidos grasos. Actúan mejor
entre pH 7-9 y entre 37 y 39°C. Se encuentra elevada en cirrosis sin pancreatitis.
Determinación de lipasa: método turbidimétrico cinético UV
Fundamento La lipasa pancreática cataliza la hidrólisis de la trioleína según:
lipasa
trioleína + H2 O → monoglicéridos + ácido aleico
El sustrato es una emulsión de trioléina estabilizada con sales biliares, en presencia de co-lipasa como
activador. La velocidad de hidrólisis es proporcional a la actividad de la lipasa en suero. Se determina
midiendo la disminución de la turbiedad en la emulsión, en espectro UV.
Procedimiento Se lee la absorbancia del blanco (con reactivo de trabajo) llevando a cero con agua
destilada. Luego se agrega la muestra y después de 4 minutos se registra la lectura A1. A los 5 minutos
se registra la lectura A2.
Valores de referencia hasta 200 UI/L

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 Laboratorio N°4
MARCADORES BIOQUÍMICOS DE LA FUNCIÓN CARDÍACA

Introducción
El síndrome coronario agudo se refiere a un conjunto de síntomas clínicos originados por una isquemia
(reducción del flujo sanguíneo) miocárdica. Abarca desde una fase reversible hasta la muerte celular
irreversible.
Se define al infarto agudo de miocardio como la necrosis debido a una interrupción aguda del aporte
sanguíneo en un área determinada del miocardio. En general es causada por una ateroesclerosis
(acumulación de grasas en las paredes de arterias) de una o más arterias coronarias. La mayor parte de
los IAM involucran trombosis.
Los factores de riesgo de IAM incluyen: obesidad, tabaquismo, hipertensión arterial, diabetes, estrés,
dislipemias (niveles elevados de grasas), entre otros.
El IAM se caracteriza por la aparición de dolor torácico intenso que puede irradiar hacia el brazo
izquierdo, o ambos, cuello y espalda. Puede ser asintomático en pacientes diabéticos.
Cambios bioquímicos en el IAM
El cese de flujo sanguíneo tiene consecuencias complejas. Dentro de los primeros 30 minutos se ve
disminución en el número y tamaño de los granos de glucógeno en el músculo cardíaco, edema
intracelular, distorsión del sistema tubular, retículo plasmático y mitocondrias, estos cambios son
reversibles si se reperfunde (devolver el flujo sanguíneo) el tejido.
Las células del miocardio usan ATP de la oxidación de ácidos grasos como fuente de energía, en el IAM
bajan estos niveles de ATP, la enzima ATPasa-Na-K dependiente (ingresa 2 iones K y saca 3 Na) se inhibe
y provoca la entrada masiva de sodio y agua, produciéndose edema agudo celular, esto conduce a la
ruptura de la membrana, liberación de enzimas citosólicas y necrosis celular.
La disminución de ATP estimula la vía glucolítica, que tiene menor rendimiento energético, y crea un
ambiente de acidosis láctica: el pH normal es de 7,38 – 7,40 y se reduce a 6,2 – 6,4.
Si se interviene en los primeros 30 minutos administrando estreptoquinasa o uroquinasa que producen
la lisis del coágulo hay posibilidades de salvar el tejido afectado. Luego de los 60 minutos los cambios
producidos empiezan a ser irreversibles.
Marcadores cardíacos
La necrosis del miocardio está acompañada de la liberación de proteínas estructurales y macromoléculas
intracelulares que incluyen a la mioglobina, creatinquinasa, lactato deshidrogenasa, troponina cardíaca I
y T, entre otras.
El diagnóstico del IAM se determina analizando un aumento o disminución de los marcadores cardíacos
junto con alguna evidencia clínica como síntomas o electrocardiograma.

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MIOGLOBINA (Myo)
Es una proteína pequeña citoplasmática que une oxígeno presente en músculo cardíaco y esquelético.
Puede ser liberada al torrente sanguíneo y ser detectada antes que otros marcadores, pudiendo medirse
a la hora del inicio de los síntomas. Su tiempo de permanencia en sangre depende del clearence renal,
tiene pico de actividad máxima entre las 6 y 9 horas, regresando a niveles basales a las 18-24 horas.
Esta proteína tiene alta sensibilidad pero baja especificidad ya que se distribuye en varios tejidos
musculares. Sus valores son más altos en hombres que en mujeres por la diferencia de masa muscular.
La mioglobina puede aumentar también en casos de insuficiencia renal, lesiones del músculo
esquelético, cirugías y ejercicio físico.
La detección de Myo es útil debido a su valor predictivo negativo: si su concentración es normal entre
las primeras 3 a 6 horas de los síntomas significa que la lesión muscular cardíaca no es reciente.
La Myo puede medirse en suero mediante radioinmunoensayo, ELISA, quimioluminiscencia directa,
entre otras técnicas.
CREATINQUINASA (CK)
Es una enzima citoplasmática que cataliza la transferencia de un Pi de alta energía desde creatina
(depósito de energía en el músculo en reposo) a ADP para formar ATP. Se encuentra en músculo
esquelético, cardíaco y otros tejidos.
Es un dímero formado por dos subunidades B (brain) y M (muscle), las cuales pueden combinarse dando
tres isoenzimas:
CK – BB o 1 Se encuentra en SNC, próstata, estómago, intestino, hígado, vejiga, útero y placenta
CK – MB o 2 Hasta el 20 % del total de CK en el miocardio enfermo es de este tipo
CK – MM o 3 Se ubica en músculo esquelético (95 % del total de CK)
Se pueden separar por electroforesis, siendo la CK 1 la de mayor movilidad hacia el ánodo.
CK total
Se ve aumentada a partir de las 4 – 6 horas del inicio de los síntomas. Alcanza un máximo después de las
18 – 24 horas y vuelve a sus valores normales entre el tercer y sexto día.
La determinación de CK por el método cinético tiene sensibilidad del 97 % y especificidad del 67 % ya
que no es una molécula cardíaca específica y sus valores de referencia varían con la edad, raza, masa
muscular y actividad física. Las drogas como alcohol y cocaína y algunos fármacos aumentan su
concentración en plasma.
CK – MB
Entre el 15 y el 20 % de la CK del tejido cardíaco es de este tipo. Su concentración aumenta entre las 3 y
6 horas del inicio de los síntomas y el máximo se alcanza entre las 12 y 24 horas. Vuelve a sus valores
normales entre las 48 y 72 horas.

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Ante un aumento de esta isoenzima es necesario considerar otras patologías si el diagnóstico de IAM no
está definido: traumatismos, enfermedades degenerativas del músculo esquelético, hipotiroidismo. A su
vez las cirugías cardíacas elevan los niveles de CK-MB.
Para diagnosticar un IAM es útil conocer el porcentaje de CK-MB respecto de la CK total, denominado
índice de corte o relativo. Si el porcentaje está entre 6 y 20 % es por un IAM, si está por debajo del 6 %
es probable que el daño derive del músculo esquelético.
Es conveniente efectuar una serie de mediciones las primeras 24 horas y ver si existe incremento de CK-
MB la cual alcanza su pico máximo a las 20 horas del comienzo de la obstrucción coronaria.
La enzima en suero es relativamente inestable y pierde actividad por la oxidación de grupo sulfhidrilo
del centro activo. La actividad puede ser parcialmente restablecida incubando la muestra con
compuestos con grupos sulfhidrilos como N-actilcisteína, monotioglicerol o glutatión.
LACTATO DESHIDROGENASA (LDH)
Es una enzima citoplasmática. Existen 5 isoenzimas de la LDH sérica que se diferencian en su movilidad
electroforética. Está presente en todas las células del organismo, variando la distribución de las distintas
isoenzimas en los tejidos.
LDH-1 y LDH-2 predominan en músculo cardíaco, riñones y eritrocitos. LDH-4 y LDH-5 se encuentran en
hígado y músculo esquelético
El aumento de LDH aparece a las 9 – 12 horas del inicio del IAM, tiene su máximo entre las 24 – 48 hs y
desciende recuperando la normalidad entre los 7 y 14 días siguientes. La elevación de los valores se
observa en la LDH-1, que constituye un 45 % de la actividad de LDH total. También se mide la relación
LDH-1/LDH-2 que habitualmente es menor que 1 pero en el IAM supera la unidad, es decir que aumenta
la LDH-1 sobre la LDH-2.
Estas mediciones son útiles en el seguimiento de la evolución a mediano plazo (4 a 8 días) en caso de no
poder determinar troponinas.
TROPONINAS CARDIACAS (cTn)
La troponina es una proteína miofibrilar del músculo esquelético que regula la contracción muscular en
relación con el ion calcio. Se compone de tres subunidades: troponina T, regula la tropomiosina;
troponina I, inhibe la unión actina-miosina; troponina C, receptor de calcio.
Actualmente la cTn es el componente central de la definición de un IAM: para establecer el diagnóstico
del IAM se necesita un aumento o reducción de los valores de cTn. Se necesita la demostración de un
patrón que sube o baja para distinguir las elevaciones agudas de las crónicas en las concentraciones de
cTn asociadas a la cardiopatía estructural.
Las cTnI y cTnT tienen isoformas cardioespecíficas que no están presentes en músculo esquelético, por
lo que son marcadores muy específicos del daño miocárdico. Eliminan la posibilidad de dar falsos
positivos por el aumento de CK-MB debido a otras causas. Aumentan dentro de las primeras 2 – 4 horas
y persisten durante 7 – 14 días.
Se recomiendan determinaciones seriadas cada 3 – 6 horas.

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Determinación de marcadores cardíacos
Determinación de la actividad de creatinquinasa (CK): método cinético
Fundamento Se basa en las siguientes reacciones:
CK
fosfocreatina + ADP ↔ creatina + ATP
hexoquinasa
glucosa + ATP → glucosa − 6 − P + ADP
g−6−p deshidrogenasa
glucosa − 6 − P + NADP + → 6 − fosfogluconato + NADPH + H +
La velocidad de formación de NADPH determinada por espectrofotometría a 340 nm es una medida de
la actividad de CK. Se debe tener en cuenta que todos los reactivos deben estar en exceso para que el
único factor limitante sea la actividad de CK.
Muestra Suero o plasma con heparina
x La luz afecta la actividad de la enzima y también es susceptible a la desnaturalización térmica.
x No se puede utilizar sueros con hemólisis moderada o severa porque contienen intermediarios de
reacción como ATP, G6P y G6PDH.
Procedimiento Incubar el sustrato unos minutos a 25°C y luego agregar 100 μL de suero, mezclar
suavemente. Colocar en la celda, preincubar 3 minutos y leer a 340 nm los valores de absorbancia cada
60 segundos hasta que tres lecturas seguidas muestren un valor constante.
Promediar las absorbancias y multiplicar por el factor 4,127.

Valores de referencia Hombres: 10-65 UI/L

Mujeres: 10-55 UI/L

Determinación de la actividad de CK-MB

Es el marcador cardíaco más usado para el diagnóstico precoz de IAM. Los niveles se elevan a las 4-6 hs,
con un pico de actividad cerca de las 24 hs. Retornando a valores basales entre las 48 y 72 hs.
Las técnicas más usadas se basan en la inhibición específica de las subunidades M con anticuerpos
monoclonales y luego se mide la actividad de la subunidad B activada con N-acetilcisteína.
Para el ensayo de esta determinación se debe tener en cuenta que luego de adicionar el suero al
sistema, existe un período “lag” o de retraso de 2 o 3 minutos hasta que la cinética se hace lineal con la
pendiente constante.
Muestra Suero o plasma con heparina
Procedimiento Preincubar el sustrato a 25°C, adicionar 100 μL de la muestra y dejar reposar 10 minutos.
Luego leer las absorbancias durante 5 minutos y hacer un promedio de los resultados.
Valor de referencia El límite de actividad es de 10 U/L y no mayor al 20 % del valor total de CK.

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Determinación de la actividad de lactato deshidrogenasa LDH: método cinético UV
Fundamento Se basa en la reacción:
LDH
piruvato + NADH + H + → lactato + NAD+
Los métodos cinéticos se basan en medir la velocidad de desaparición del sustrato de la generación del
producto que se relaciona con la concentración de enzima en solución.

En este método se determina la desaparición de NADH con máximo de absorbancia a 340 nm.

Procedimiento Agregar el reactivo de trabajo y la muestra en una celda de cuarzo, mezclar por inversión
y colocar en el espectrofotómetro iniciando el cronómetro. Registrar la A del tiempo 0 y luego cada 30
segundos. Calcular el promedio de las absorbancias.

LDH (U/I) = ∆A . factor

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 PROTEÍNAS
PROTEINOGRAMA ELECTROFORÉTICO
Introducción
Las proteínas están formadas por una cadena de átomos de carbono y nitrógeno unidos por enlaces
peptídicos entre aminoácidos adyacentes. Están presentes en todos los tejidos y en los distintos líquidos
del organismo como suero, plasma, orina, LCR.
Participan en muchas funciones del organismo: respuesta inmunológica (respuesta inflamatoria y
control de infecciones); transporte de compuestos endógenos y exógenos poco solubles en agua como
hormonas o bilirrubina; catálisis enzimática; procesos de coagulación.
Casi todas las proteínas se sintetizan en el hígado. En su mayoría son catabolizadas por los macrófagos y
las células del endotelio capilar, y las proteínas pequeñas se pierden en el glomérulo renal y la pared
intestinal. Por eso su determinación en suero da información clínica para el diagnóstico, monitoreo y
tratamiento de enfermedades.
Las causas generales de cambios en la concentración total de proteínas tienen que ver con la variación
de la composición acuosa del plasma y las modificaciones de proteínas como albúmina e
inmunoglobulinas. Son más comunes los casos de hipoproteinemia que de hiperproteinemia.
La determinación de proteínas totales no es un índice sensible de cambios en las fracciones de proteínas
individuales. Para la determinación de cada fracción se usan técnicas como electroforesis e
inmunoelectroforesis.
Cuantificación de proteínas totales
- Método gravimétrico: es el método de referencia pero no es de rutina.
- Método de Kjeldahl: determina la concentración de proteínas en base a nitrógeno. Es una técnica
compleja.
- Determinación por energía radiante: se usa para medir la cantidad de proteínas que poseen anillos
aromáticos de tirosina, fenilalanina y triptófano.
- Determinación por unión a colorantes: se forman complejos con propiedades ópticas. Se usa para
cuantificar albúmina y no proteínas totales.
Los métodos más usados son colorimétricos donde un colorante se une a un sitio específico de la
proteína, dando un cambio de color visible.
- Método de Lowry: se basa en la reducción de ácido fosfotúngstico-fosfomolibdico en presencia de
tirosina y triptófano, dando un color azul (650 – 750 nm)
- Método de Bradford: se basa en la unión de azul brillante de Coomassie g-250 a las proteínas. Se
obtiene un complejo azul brillante (595 – 610 nm)
- Método de Biuret: es uno de los métodos más usados. En la reacción se condensan dos moléculas
de urea y se libera amoníaco. La reacción la dan sustancias que tienen dos grupos carbamino unidos
directamente o a través de un solo átomo de C o N.

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El reactivo de Biuret contiene Cu2SO4 en solución acuosa alcalina (KOH o NaOH). Se forma un
compuesto violeta debido al complejo que se genera entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no
enlazados del nitrógeno de los enlaces peptídicos.
El color violeta es una mezcla de azul y rojo: azul debido a la unión del cobre con la amina libre de la
proteína; rojo por la unión del cobre con la unión peptídica.
El máximo de absorción del complejo es a 545 nm.
Este método sirve también para dosar lipoproteínas y glucoproteínas.

ACTIVIDAD PRÁCTICA

La medición de proteínas incluye la medición de proteínas totales, albúmina, globulinas y de la razón

albúmina/globulina.
Determinación de proteínas totales
Fundamento Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el ion cúprico, en medio alcalino,
dando un complejo violeta que se mide a 540 nm.
Muestra Suero
Interferencias Bilirrubina por encima de 100 mg/L
Reactivos Complejo EDTA/Cu en NaOH (medio alcalino) y alquil aril poliéter (AAP)
Solución patrón de albúmina y globulinas

Procedimiento Preparar 3 tubos: blanco, estándar y desconocido

Mezclar e incubar 15 minutos a 37°C
Leer a 540 nm
proteinas totales (g/L) = Amuestra . f
Determinación de albúmina
La albúmina es la proteína más abundante en plasma y su determinación es más útil que la
determinación de proteínas totales, en relación con el estado nutricional y la capacidad de síntesis del
hígado. Esta proteína permite el transporte de ácidos grasos, hormonas esteroideas, bilirrubina y
catecolaminas que son insolubles en medio acuoso.
La albúmina tiene la capacidad de unirse a distintos colorantes de forma selectiva como bromocresol.
Fundamento La albúmina reacciona específicamente con BCF en medio ácido (pH 3,8). El aumento de
absorbancia a 625 nm respecto del blanco de reactivo, es proporcional a la concentración de albúmina.
Muestra Suero. No requiere desproteinización previa porque las globulinas no interfieren.
Reactivos Reactivo BCF: solución de 3, 3’, 5, 5’ – tetrabromo cresolsulfonftaleína. Color verde
Estándar de albúmina y globulinas

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Interferencias Bilirrubina por encima de 200 mg/L; lipemia por encima de 20 g/L
Procedimiento Preparar tubos blanco, estándar y desconocido.
Mezclar con varilla y mantener entre 15 y 28°C durante 10 minutos. No se debe
trabajar a T más alta porque cambia la cinética de reacción y el desarrollo del color no
es completo.
Leer a 625 nm. La estabilidad del color es de 20 minutos.
albúmina (g/L) = Amuestra . f
globulinas (g/L) = proteinas totales − albúmina
albúmina albúmina
relación ( )=
globulinas proteinas totales − albúmina
Valores de referencia Proteínas totales 61 – 79 g/L
Albúmina 35 – 48 g/L
Relación A/G 1,2 – 2,2
Proteinograma por electroforesis
Las proteínas son anfóteras y tienen cargas positivas y negativas en la misma molécula y su carga neta
depende del pH de la solución donde estén. En un intervalo neutro el carboxilo está disociado y el grupo
amino enlaza al H dando una molécula ionizada llamada zwitterion.
El pH donde la molécula es neutra (cargas + y – son iguales) se llama punto isoeléctrico (pI). A pH por
debajo del pI se cargan positivamente comportándose como cationes, por encima del pI se comportan
como aniones (-). Las proteínas se separan por electroforesis debido a esta propiedad.
La electroforesis es una técnica basada en los movimientos de moléculas cargadas en un campo
eléctrico, las cuales se mueven al electrodo de carga contraria.
El grado de migración depende de la carga de la molécula, el tamaño y la forma, la fuerza del campo
eléctrico, la temperatura y las propiedades del medio de soporte. Se usa papel de filtro, acetato de
celulosa, agarosa o poliacrilamida como medio de soporte.
Se denomina proteinograma a la representación gráfica de las fracciones proteicas.
Electroforesis en acetato de celulosa
Se usa para la separación de proteínas. La tira de acetato de celulosa tiene propiedades de adsorción
mínimas lo que ofrece una separación en bandas bien definidas. La separación es relativamente rápida,
se usa poca cantidad de muestra, luego es posible recuperar cada componente por separado porque la
tira puede disolverse.
Se usa un buffer de pH 8,6, todas las proteínas tienen carga negativa ya que sus pI están entre 4,9
(albúmina) y 7,4 (γ-globulinas). La albúmina tiene mayor movilidad mientras que las γ-globulinas tienen
menor movilidad y el resto de las proteínas quedan situadas entre estas dos.

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Materiales - Tiras de acetato de celulosa conservadas en metanol al 40 %
- Puentes de papel de filtro Whatman n°42
- Cubeta de electroforesis y fuente de energía

Reactivos Buffer pH 8,6 Veronal sódico 8,24 g

Agua destilada 1000 mL
Azul de bromofenol al 0,2 % en buffer
Amidoblack 0,5 % Amidoblack 0,5 g
Metanol 45 mL
Agua 5 mL
Ácido acético 10 mL
Decolorante Metanol 45 mL
Agua 45 mL
Ácido acético 10 mL
Transparentador Metanol 87 mL
Ácido acético 12 mL
Glicerina 1 mL
Eluente Ácido acético al 80 % en agua

Procedimiento
Electroforesis ▪ Saturar las tiras de acetato de celulosa en buffer durante 15 minutos.
▪ Eliminar el exceso de buffer absorbiendo con papel de filtro.
▪ Extender las tiras sobre el puente de la cubeta con el corte hacia abajo y la
derecha, usar como puente entre el buffer y las tiras papel Whatman.
▪ Sembrar dos muestras de suero en cada tira, en el extremo cercano al cátodo.
▪ Aplicar diferencia de potencial de 200 V durante 30 minutos.

Revelado ▪ Sumergir las tiras en solución de tinción durante 5 minutos.

Decoloración ▪ Lavar las tiras con decolorante hasta observar las bandas de color azul y el
fondo blanco.

*Transparentado ▪ *En caso de guardar la corrida se colocan de 3 a 5 minutos en baño de

transparencia.
▪ Dejar secar a T ambiente o en estufa a 37°C.

Elución ▪ Cortar cada fracción y en tubo de ensayo agregar 5 mL de eluente, dejar 20

minutos a 37°C.
▪ Mezclar y leer a 620 nm.

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Resultados
Las proteínas se separan en 5 o 6 bandas. En la región
de las β se puede llegar a ver dos bandas (β1 y β2) si el
suero es fresco.
Si se usa plasma en vez de suero se ve una banda que
corresponde al fibrinógeno, entre las gamma y las
beta.

Valores de referencia Valor relativo (%) Valor absoluto (g/L)

Albúmina 55 – 65 43 – 53
Alfa 1 globulinas 3–5 3–5
Alfa 2 globulinas 6–9 5–7
Beta globulinas 9 – 14 7–9
Gamma globulinas 14 – 19 10 – 14

Aplicaciones
La electroforesis de proteínas séricas con acetato de celulosa es una técnica simple y útil para el
diagnóstico de cirrosis hepática, síndrome nefrótico, mieloma múltiple, etc.

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