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Acta Histochemica 125 (2023) 152115

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Acta Histochemica
Página web de la revista: www.elsevier.com/locate/acthis

Documento de investigación

Asociación entre neuropéptidos y mucinas en las células mucosas de la

enfermedad de Crohn
Anthea Miller , aGiuseppina Cutroneob , Giorgia Pia Lombardoc , Roberta D'Angeloc ,
Socrate Pallio , dAlba Miglioratob , Angelo Fumia d,*, Angelo Favalorob , Eugenia Rita Laurianoc ,
Simona Pergolizzi c
a Departamento de Ciencias Veterinarias, Universidad de Messina, Polo Universitario dell'Annunziata, 98168 Messina, Italia
b Departamento de Ciencias Biomédicas y Odontológicas e Imágenes Morfofuncionales, Universidad de Messina, 98125 Messina, Italia
c Departamento de Ciencias Químicas, Biológicas, Farmacéuticas y Medioambientales, Universidad de Messina, 98166 Messina, Italia

d Departamento de Medicina Clínica y Experimental, Universidad de Messina, 98147 Messina, Italia

A R T Í C U L OE A B S T R A C T O
N F O R M A
La enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU) son enfermedades inflamatorias intestinales (EII). A
Palabras clave: diferencia de la CU, que se limita a la mucosa del colon, la inflamación de la EC se caracteriza por ulceraciones
Enfermedad de
crónicas de la mucosa que afectan a todo el tracto gastrointestinal. Las células caliciformes (GC) se encuentran en
Crohn
algunos epitelios de revestimiento, sobre todo en los tractos r e s p i r a t o r i o y digestivo. Las GC representan la
Serotonina
Neuropéptidos principal fuente de mucina, que son los componentes significativos de la capa de moco; en muchas infecciones
Células entéricas se observa hipertrofia de las GC y un aumento de la producción de mucina. El citoplasma de las células
caliciformes caliciformes también puede contener neuropéptidos, como la serotonina, que pueden estar alterados en la
Mucinas enfermedad inflamatoria intestinal (EII). El sistema de defensa del intestino está representado por la barrera
mucosa intestinal, cuya función protectora está estrictamente relacionada con la regulación de la capa mucosa y la
coordinación de la respuesta neuroinmunitaria. Se analizaron tejidos intestinales fijados con paraformaldehído,
obtenidos de quince pacientes con enfermedad de Crohn, mediante inmunotinción para MUC2, MUC4, 5-HT y
VAChT. Este estudio pretende definir la relación entre los neuropéptidos y las mucinas en las células mucosas y su
implicación en el proceso inflamatorio. Nuestros resultados mostraron en células mucosas de pacientes con
enfermedad de Crohn (EC) una elevada expresión de MUC4 y una disminución de la expresión del transportador
vesicular de acetilcolina (VAChT), lo que demuestra la presencia de un estado inflamatorio.

1. Introducción microbios, hongos, virus y otros agentes nocivos de la luz intestinal,

La enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU) son las
principales enfermedades inflamatorias intestinales (EII) que afectan a
los intestinos delgado y grueso (Yang y Geng, 2020). Estas dos
enfermedades se deben a múltiples factores que pueden ser endógenos
o exógenos. La EC y la CU difieren en sus características y
distribución. La primera se distribuye en el intestino delgado y grueso
y se caracteriza por estenosis. La segunda se extiende desde el recto
hasta el colon y presenta ulceraciones de la mucosa (Burke et al.,
2007). Mientras que en la colitis ulcerosa no hay zonas sanas, en la
enfermedad de Crohn hay regiones sanas entre un punto inflamado y
otro (Pergolizzi et al., 2021, 2022). Afecta a millones de pacientes en
todo el mundo, principalmente entre los 15 y los 25 años (Cushing y
Higgins, 2021).
La mucosa intestinal representa una barrera protectora contra
como enzimas destructivas o incluso lesiones mecánicas (Antoni et al.,
2014). Otra función de la mucosa intestinal es coordinar la respuesta
neuroinmunitaria (Dharmani et al., 2009; McGuckin et al., 2009). El
moco, al estar compuesto no solo de carbohidratos, lípidos y proteínas,
sino también de un porcentaje significativo de agua, puede mantener
hidratada la superficie de la mucosa (Maron et al., 2011), además de
tener una capacidad lubricante; el moco también participa en la
defensa innata intestinal, atrapando y eliminando bacterias (M. E.
Johansson y Hansson, 2016). El moco es producido por las células
caliciformes (GC) que están presentes entre los enterocitos desde el
periodo postnatal temprano (Gustafsson y Johansson, 2022). Su
nombre proviene de su morfología típica en forma de copa, estas
células se caracterizan por tener gránulos de mucina que llenan
el citoplasma apical (Birchenough et al., 2015).
La secreción de mucina se ve estimulada por varios factores, como
las toxinas,

* Autor correspondiente.
Dirección de correo electrónico: angelofumia@gmail.com (A. Fumia).
https://doi.org/10.1016/j.acthis.2023.152115
Recibido el 23 de septiembre de 2023; Recibido en versión revisada el 31 de octubre de 2023; Aceptado el 3 de noviembre de 2023
Disponible en línea el 17 de noviembre de 2023
0065-1281/© 2023 Elsevier GmbH. Todos los derechos reservados.
A. Miller et al. Acta Histochemica 125 (2023) 152115

dividieron en 15 pacientes diagnosticados de EC ileal y 7 controles

citoquinas proinflamatorias y neuropéptidos, por lo que se deduce que
examinados en busca de antecedentes familiares de enfermedad
la expresión de las mucinas cambia durante el estado inflamatorio
inflamatoria intestinal. La edad media de los sujetos era de 21,5 años (rango
(Linden et al., 2008; Longman et al., 2006).
18-25 años). El diagnóstico de EC fue
En el intestino delgado las células caliciformes adyacentes a los
enterocitos suministran el bicarbonato necesario para el correcto
despliegue de la mucina, en cambio en el intestino grueso podría
suministrar bicarbonato a través de su transportador de bicarbonato
bestrofina-2 (Birchenough et al., 2015).
Hasta ahora, se han detectado más de 20 genes de mucinas
(Dorofeyev et al., 2013) en el intestino, entre los que se encuentran
mucinas secretoras (MUC2, MUC5AC, MUC5B y MUC6) y mucinas
asociadas a membranas (MUC1, MUC3, MUC4, MUC13 y/o MUC17)
(Dharmani et al., 2009; Linden et al., 2008; Shirazi et al., 2000).
MUC2 es la principal mucina secretada por las células caliciformes del
intestino grueso y delgado, se caracteriza por un amplio dominio central
O-glicosilado y dominios N- y C-terminales ricos en cisteína
(Heazlewood et al., 2008); MUC2 puede formar complejos de red
multiméricos y se considera la principal unidad estructural de la capa
de mucus intestinal (Antoni et al., 2014).
La MUC4, una gran glicoproteína transmembrana de tipo I, se
expresa principalmente en el intestino delgado, pero también puede
detectarse en la membrana apical de las células caliciformes del colon
(Handra-Luca et al., 2005). MUC4 se caracteriza por una subunidad
MUC4α N-terminal y una subunidad MUC4β C-terminal con factor
Von Willebrand tipo D (Das et al., 2016); esta mucina se expresa
diferencialmente durante condiciones inflamatorias del colon
(Dorofeyev et al., 2013).
En un estudio anterior, demostramos la correlación entre las células
dendríticas de la CU, la 5-HT y el transportador vesicular de
acetilcolina (VAChT), demostrando que la señalización bidireccional
en el eje inmuno- endocrino tiene potencial excitatorio durante la
inflamación (Pergo- lizzi et al., 2021).
Entre los neuropéptidos implicados en la respuesta inflamatoria se
encuentra la serotonina periférica, que también es crucial en las
funciones gastrointestinales, como la motilidad, la sensibilidad y la
secreción.
La serotonina (5-hidroxitriptamina; 5-HT) es una indolamina con
múltiples funciones: es un neurotransmisor, tanto en el intestino como
en el cerebro, un mensajero paracrino en el intestino (Alesci et al.,
2021; Gershon y Tack, 2007), así como una hormona periférica.
La regulación anormal de la 5-HT se produce en la enfermedad
inflamatoria intestinal (EII), donde la 5-HT puede tener un papel clave
en la patogénesis de la inflamación intestinal, de hecho, según estudios
recientes, cuando se libera serotonina in- testinal, puede activar
receptores localizados en varios tipos de células, incluidas las células
caliciformes (Engevik et al., 2019; Gross et al., 2012; Tackett et al.,
2017).
La acetilcolina (ACh) es un neurotransmisor periférico, autonómico
y cerebral que interviene tanto en la regulación de varios procesos
biológicos como en la modulación de la respuesta inmunitaria
(Tayebati et al., 2002). La ACh también es producida por varios tipos
de células no neuronales y es transportada por el VAChT, un
transportador vesicular específico de neurotransmisores cuya función
es almacenar ACh -a través de un gradiente electroquímico- en
vesículas sinápticas y luego liberarlo tras la estimulación celular
(Prado et al., 2013; Wessler et al., 2003). El mecanismo de
funcionamiento del VAChT se basa en el intercambio de ACh
citoplasmático por dos protones vesiculares (Parsons, 2000).
En este estudio, centramos nuestra atención en MUC2 y MUC4 para
comprobar cómo se expresan junto con los neuropéptidos en la
enfermedad de Crohn.

2. Materiales y métodos

2.1. Muestras y tratamiento de los tejidos

Se recogieron biopsias de íleon inflamado de pacientes con EC y tejido

de íleon no inflamado de pacientes de control de 22 individuos, hombres y
mujeres, mediante ileocolonoscopia. Los sujetos examinados s e

basándose en los hallazgos microbianos, clínicos, de laboratorio y
endoscópicos. Estos pacientes son reevaluados seis meses después del
diagnóstico inicial. La duración y la gravedad de la patología son
comparables, ya que los pacientes son objeto de seguimiento durante
al menos tres años. Todas las biopsias se per- formaron
endoscópicamente en los últimos 30 cm del íleon, precisamente cada
10 cm se realiza un muestreo, tanto en condiciones normales como
patológicas. La investigación se realizó siguiendo la Declaración de
Helsinki. Todas las muestras se recogieron en la Policlínica
Universitaria (Messina, Italia), todos los sujetos dieron su
consentimiento, y el estudio fue aprobado por el comité ético nº C.E.
prot. 103/19. Para esta investigación se utilizó el tejido incluido en
parafina de nuestro estudio anterior (Pergolizzi et al., 2022).
2.2. Histología
Para teñir las secciones se utilizó azul Alcian/ácido periódico de
Schiff (AB/PAS, 04-163802, Bio-Optica Milano S.p.a., Milán, Italia)
(Alesci et al., 2022a; b,c; Alessio et al., 2021; Lauriano et al., 2021;
Zaccone et al., 2012).
2.3. Inmunofluorescencia
cubrieron con un cubreobjetos y finalmente se montaron con
FluoromountTM Aqueous Mounting Medium (F4680 Sigma-Aldrich,
St. Louis, MO, EE.UU.) para evitar el fotoblanqueo. Se realizaron
experimentos de control excluyendo los anticuerpos primarios (datos
no mostrados)..
2.4. Inmunofluorescencia confocal láser
Se utilizó un microscopio confocal de barrido láser Zeiss LSM
DUO con módulo META (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena,
Alemania) equipado con un láser de argón (458, 488 l) y 2 láseres de
helio-neón (543 y 633 l) para capturar imágenes y analizar secciones.
Todas las imágenes se digitalizaron con una resolución de 8 bits en una
matriz de 2048 × 2048 píxeles. Se utilizó un láser de helio-neón (543
nm) y un láser de argón (458 nm) para adquirir cortes ópticos de
muestras de fluorescencia utilizando una velocidad de barrido de 1
minuto y 2 segundos y hasta 8 promedios. Se obtuvieron secciones de
1,50 µm de grosor utilizando un estenopo de 250; las imágenes
capturadas se procesaron utilizando Zen 2011 (software LSM 700 Zeiss)
(Zaccone et al., 2018). Cada imagen se adquirió rápidamente para
minimizar la fotodegradación. Se utilizó Adobe Photoshop CC (Adobe
Systems, San Jose, CA, EE. UU.) para recortar las imágenes digitales y
crear

Las secciones de 5 μm se desparafinaron, rehidrataron y

Cuadro 2
enjuagaron en PBS. A continuación, para evitar la actividad de la
Resultados de los análisis cuantitativos (valores medios ± desviaciones
peroxidasa endógena, las secciones se incubaron en una solución de H estándar; n = 22).
O22 al 0,3% en PBS y se bloquearon durante 1 h en un anticuerpo
Nº de células caliciformes
basado en albúmina de suero (BSA) al 2,5% (Alessio et al., 2020;
Kuciel et al., 2014; Lauriano et al., 2021). El anticuerpo policlonal Controlar CD

antiserotonina (5-HT) se incubó en una cámara húmeda a 4◦ C con un 5-HT+ 1064.49 ± 84.23 * * 144.31 ± 24.12 *
anticuerpo monoclonal Mucin-2 (MUC2) y Mucin-4 (MUC4), mientras MUC2 + 1243.34 ± 112.14 * 1012.48 ± 29.43 * *
MUC4 + 92.64 ± 12.03 * * 1121.38 ± 109.13 *
que el anticuerpo policlonal antitransportador vesicular de acetilcolina
VAChT 1231.23 ± 120.48 * 123.37 ± 21.49 *
(VAChT) se incubó con el anticuerpo monoclonal 5-HT (Tabla 2). A
continuación, las secciones, tras enjuagarse en PBS, se incubaron * * p ≤ 0.01
durante 1 h con antisueros secundarios: Alexa Fluor 594 donkey anti- * p ≤ 0.05
1Para comparar las medias se utilizaron el ANOVA unidireccional y la prueba t de
rabbit IgG conjugado con TRITC y Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse
Student.
IgG conjugado con FITC (Tabla 2). Tras lavar de nuevo las secciones, se