Universidad Autónoma De Chiapas

Licenciatura en Químico Farmacobiologo

Campus IV

Trabajo:
Reporte de laboratorio

Materia:
Inmunología I

Profesora:
M.C. Kenia Francelly Rodríguez Gómez

Alumnos:
Luis Gilberto López López
José María López Santizo
Jorge Iván Nájera González
Guillermo Andrés Ramírez Deleon
Héctor Iván Reséndiz López

Semestre: 6º Grupo: “A”

Tapachula de Córdova y Ordoñez, Chiapas a 17 de noviembre del 2023

 MARCO TEORICO
La inmunología es una disciplina científica que estudia el sistema inmunológico, sus
componentes y funciones, así como las respuestas del organismo frente a agentes patógenos.
Para investigar y comprender los procesos inmunológicos, se utilizan diversas técnicas, entre las
cuales se destacan la citometría de flujo, la inmunodifusión radial y el ensayo de
inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) simple.
1. Citometría de Flujo:
La citometría de flujo es una técnica avanzada que permite analizar y clasificar células
individuales basándose en sus propiedades físicas y químicas. Este método se utiliza
combinados en inmunología para estudiar poblaciones celulares, identificar subconjuntos
específicos y evaluar la expresión de proteínas de membrana. El proceso implica el paso de
células a través de un flujo continuo, donde se las ilumina con láseres y se miden las
propiedades de dispersión y fluorescencia de las células etiquetadas con anticuerpos
fluorescentes específicos para antígenos de interés. La citometría de flujo es esencial para
comprender la inmunofenotipificación celular y analizar eventos como la apoptosis.
2. Inmunodifusión Radial:
La inmunodifusión radial es una técnica clásica utilizada para cuantificar la concentración de
antígenos o anticuerpos en una muestra biológica. Se basa en la difusión de proteínas a través
de un medio gelificado, donde se forma un anillo visible de precipitación cuando los antígenos y
anticuerpos reaccionan entre sí. Esta técnica es particularmente útil en la identificación y
cuantificación de inmunoglobulinas. El tamaño del anillo de precipitación es proporcional a la
concentración del analito, permitiendo la estimación cuantitativa. La inmunodifusión radial ha
sido fundamental en la investigación y diagnóstico de enfermedades autoinmunes e
inmunodeficiencias.
3. ELISA Simple (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas):
El ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) es una técnica versátil y ampliamente
utilizada en inmunología para detectar y cuantificar la presencia de antígenos o anticuerpos en
una muestra. En el ELISA simple, se recubre una placa con antígeno o anticuerpo, luego se
añade la muestra y, si está presente el analito de interés, se forma un complejo-anticuerpo.
Después, se agrega un anticuerpo secundario marcado con una enzima, y la reacción se
visualiza mediante la adición de un sustrato cromogénico. La cantidad de color formada es
proporcional a la concentración del analito. El ELISA simple es esencial en la investigación
biomédica y se utiliza en diagnóstico clínico para enfermedades infecciosas, autoinmunidad y
alergias.
Técnicas inmunológicas basadas en reacciones de
precipitación. 1- Inmuno Difusión Radial (IDR)
Esta técnica permite cuantificar de manera sencilla y económica inmunoglobulinas de isotipo G,
M y A o antígenos solubles (C3, C4, transferrina, etc) presentes en muestras biológicas. La
técnica se basa en la difusión de la muestra conteniendo el antígeno a medir (inmunoglobulinas
o antígenos solubles) en una matriz semisólida de agar en la que se encuentra disuelto el Ac
específico. La muestra biológica se introduce en los orificios cilíndricos excavados en el agar y
a medida que el antígeno difunde en forma radial, se alcanza la relación Ag-Ac que permite la
 formación precipitados visibles. Una vez finalizada la difusión se mide el radio (R) de los
precipitados que es proporcional a la concentración de antígeno (C). La concentración de
proteína en la muestra biológica (Cx) se calcula realizando una curva de calibración utilizando
muestras patrones de concentración conocida.

Muestra Biológica de Muestra patrón de concentración conocida

concentracion desconocida (C)
(Cx) C1 C2 C3

Rx R1 R2
R3

Halo de 2
R
precipitado

Curva de calibración

C1 C2 Cx C3 Concentración
de la muestra

Citometría de flujo:

La citometría de flujo (CMF) es un procedimiento altamente eficiente para caracterizar poblaciones

celulares que se encuentren en suspensión. En un principio, se utilizaba fundamentalmente para
identificar el fenotipo celular, es decir la expresión diferencial de antígenos en la membrana
plasmática, pero hoy día son muchos los parámetros estructurales y funcionales que se pueden
medir por CMF (Figura 1). Entre las muchas ventajas que presenta en relación a la microscopía de
fluorescencia se encuentran la posibilidad de analizar un número muy elevado de células en pocos
segundos y la posibilidad de cuantificar la intensidad de fluorescencia. La principal desventaja
radica en el alto costo de la adquisición y mantenimiento del citómetro de flujo.
La citometría de flujo se ha utilizado en biomedicina con diferentes objetivos:
En hematología: contaje celular, fórmula leucocitaria, contaje reticulocitario, análisis de
médula ósea. En farmacología: estudios de cinética celular. En inmunología:
subpoblaciones de linfocitos, estimulación linfocitaria. En oncología:
diagnóstico/pronóstico, monitorizar tratamiento. En microbiología: diagnóstico bacteriano y
vírico, sensibilidad a antibióticos.

Citómetro de flujo:

Se define como citómetro de flujo al aparato que es capaz de medir componentes y propiedades
de células y organelas celulares (partículas biológicas) que fluyen en una suspensión celular. Los
cell sorters tienen las mismas prestaciones y posibilidades que los citómetros de flujo pero con la
capacidad adicional de separar partículas selectivamente de la suspensión líquida.
Debido a las especiales características de los citómetros de flujo, la muestra a analizar debe
encontrarse en forma de suspensión monodispersa. Hay muestras como la sangre periférica,
médula ósea, u otros fluidos biológicos, que precisan de un mínimo procesamiento; en cambio los
tumores sólidos o las muestras parafinadas necesitan de una disgregación más o menos intensa
(mecánica, enzimática, etc.).
Para su análisis, las células en suspensión son forzadas a pasar, de a una por vez, a través de un
filamento muy delgado. Un haz de rayo láser incide en cada célula lo que resulta en la dispersión
de la luz en distintas direcciones. Una serie de tubos fotomultiplicadores (FM) detectan la luz
dispersada brindando información acerca del tamaño, la granularidad o complejidad celular, como
así también de la emisión de fluorescencia en el caso de que la célula haya unido un anticuerpo
marcado con un fluorocromo. A continuación, se muestra un esquema de un citómetro de flujo:

Células
marcadas
con Acs
fluorescen
tes
Ac con
fluorocr
omo
rojo

FM para
fluorescencia
verde
Corriente
de flujo con
las células
pasando de
a una FM para fluorescencia
roja

FM para
granularidad

FM para
tamaño
Análisis y presentación de los resultados:

Los datos de tamaño celular, granularidad celular y fluorescencia (en caso de haberse usado
anticuerpos marcados con fluorocromos) son analizados mediante un software específico y se
presentan como gráficos, de los cuales se dan a continuación los ejemplos más comunes:

1) Gráfico “dot plot” de taaño versus granularidad

2) :

Leucocitos de sangre periférica

Granularidad (SSC)

Neutrófilos

Monocitos

Linfocitos

Se muestra un ejemplo de leucocitos de sangre periférica humana en el que se diferencian claramente

las regiones correspondientes a los neutrófilos (de mayor complejidad granular por la presencia de
lisosomas), monocitos (de complejidad intermedia, pero mayor tamaño) y linfocitos (pequeños y sin
gránulos en el citoplasma). En este caso no se utilizó ningún anticuerpo para marcar las células.

1) Histograma de fluorescencia:

Células no marcadas Células CD18

(control de isotipo) positivas

CD18-FITC

fluorescencia verde (FL1)

Se muestra un ejemplo de células de estirpe monocítica marcadas con un anticuerpo monoclonal
dirigido contra el antígeno CD18. El anticuerpo está marcado con isocianato de fluoresceína (FITC)
(fluorescencia verde) y es de isotipo IgG1 murino. Como control de pegado inespecífico, las
células se incuban, por otro lado, con IgG1 murina marcada con FITC pero que no está dirigida
contra ningún antígeno celular (control de isotipo).

2) Gráfico “dot plot” de fluorescencia verde (FL1) versus fluorescencia roja (FL2):

Linfocitos T CD4+ y CD8+ de

sangre periférica en un paciente
con leucemia de células B
CD8-PE

CD4-FITC

Se muestra un ejemplo de leucocitos de sangre periférica de un paciente con leucemia linfática

crónica de células B que fueron marcados simultáneamente con 2 anticuerpos: anti-CD4 marcado
con FITC y anti-CD8 marcado con ficoeritrina (PE) (fluorescencia roja, FL2). Se distinguen 3
poblaciones: en el cuadrante superior izquierdo se encuentran los linfocitos T CD8 positivos, en el
cuadrante inferior derecho, los T CD4 positi
ELISA (Enzime Linked ImmunoadSorbent Assay)
La técnica de ELISA utiliza Acs marcados con una enzima (generalmente la
peroxidasa) para poder visualizar la reacción Ag-Ac. La técnica se utiliza tanto
para la determinación de Ags como de Acs.

Determinación de Ag por ELISA

La modalidad más frecuente del método ELISA para la determinación de Ags es
el modelo ELISA "Sandwich" directo. En este modelo, el Ac específico para el
Ag de interés, se encuentra adsorbido en un soporte sólido (placa de petri),
sobre el que se añadirá la muestra biológica. En el caso de que en dicha
muestra se encuentre el Ag, quedará capturado en la placa y será puesto en
evidencia tras la adición de otro Ac específico conjugado con la enzima. Por
último, se añade el substrato sustrato incoloro que, por acción de la enzima,
dará un producto coloreado que producirá un color observable a simple vista y
cuantificable mediante un espectrofotómetro.

Determinación de Acs por ELISA

Para la determinación de Acs específicos para un determinado Ag se utiliza

normalmente la modalidad de ELISA indirecto en donde el Ag de interés se
encuentra adsorbido en la placa de ELISA. Se pueden utilizar como antígenos,
proteínas virales o bacterianas e incluso virus completos, pero cada día es más
frecuente adsorber exclusivamente las proteínas de interés inmunológico. Esta
es una de las técnicas de elección para buscar Acs contra proteínas del virus
HIV en sueros de pacientes. Los pasos de la técnica se encuentran
esquematizados en la figura.
FUNDAMENTOS DE LA PRACTICA
Citometría de flujo
La Citometría de Flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparamétrico
cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas
(generalmente células) alineadas y de una en una por delante de un haz láser
focalizado.

En el momento de realizar las mediciones en el citómetro de flujo, las células

pueden estar vivas o fijadas, pero, siempre en suspensión celular y en forma
de célula única. Al obligarlas a pasar alineadas una a una frente a un haz láser
mediante un flujo continuo, cada célula, a la vez que dispersa la luz, si esa célula
tiene alguna sonda fluorescente o fluorocromo, emitirá fluorescencia al ser
excitada por el láser. Los parámetros que se miden de forma simultánea por cada
célula son:

1. Dispersión frontal de la luz (forward scatter), valor proporcional al tamaño

celular.

2. Dispersión de la luz ortogonal (side scatter), proporcional a la cantidad de

estructuras granulares o complejidad de la célula.

3. Intensidades de fluorescencia a diferentes longitudes de onda.

Los citómetros de flujo están formados por complejos sistemas fluidos, ópticos,
detectores electrónicos, convertidores analógico-digitales y ordenadores.
En esta figura se describen los pasos de la citometría de flujo donde este se
integra por tres sistemas: el sistema de fluidos, que se encarga de transportar las
células hacia el haz de luz; el sistema óptico, compuesto por láseres y detectores
que registran la luz emitida por la célula, y un sistema electrónico que recibe las
señales luminosas y las codifica en gráficos
Por tratarse de una técnica de identificación y cuantificación específica de células,
la citometría de flujo facilita el diagnóstico o seguimiento de patologías como
leucemias, linfoma, inmunodeficiencia primaria, monitoreo del estado
hematológico de pacientes con infección de VIH, así como la detección de células
cancerosas o tumorales .Adicionalmente, esta herramienta permite analizar
funciones celulares como la proliferación, la fagocitosis y la apoptosis, por
mencionar algunas.

Inmunodifusión radial
El principio de la inmunodifusión radial se basa en el concepto de reacciones de
precipitación. Se basa en la curva de precipitación, que explica que cuando está
presente la proporción adecuada de antígeno a anticuerpo, se forman precipitados
entrecruzados visibles como resultado de la interacción entre antígenos y
anticuerpos.
La inmunodifusión radial (RID) es una técnica que puede determinar
cuantitativamente la concentración de un antígeno. A diferencia de muchas
técnicas de precipitación en gel y líquido que detectan cualitativamente el
antígeno, el RID es una técnica cuantitativa sensible que se usa a menudo
clínicamente para detectar niveles de proteínas sanguíneas en pacientes. El
anticuerpo se incorpora en agarosa fundida que se vierte en una placa de Petri y
se deja solidificar. Se cortan pequeños pocillos en la agarosa y se llenan con
concentraciones conocidas de antígeno que interacciona con el anticuerpo
presente en la agarosa. Se colocan muestras de concentraciones desconocidas
en pocillos similares. Los antígenos en solución difunden entonces hacia fuera
desde el pocillo en un patrón circular que rodea al pozo. El anticuerpo está
presente en exceso y la difusión del antígeno continuará hasta que se forme un
anillo estable de antígeno anticuerpo. Hay complejos antígeno-anticuerpo en toda
la zona que rodea el pocillo dentro de la línea de precipitación.
En la línea de precipitación es donde se puede encontrar el mayor número de
complejos porque el antígeno y el anticuerpo están presentes en proporciones
aproximadamente iguales. Esto se conoce como la zona de equivalencia o el
punto de equivalencia. Generalmente, es necesario de 24 a 48 horas para que
ocurra la difusión óptima y aparezca la precipitación.
Para cada antígeno, se formará un anillo de precipitación de punto final de cierto
diámetro. A partir de las concentraciones patrón conocidas, se puede trazar una
curva patrón trazando la concentración de antígeno frente a las medidas
cuadráticas de diámetro de los anillos. A partir de esta curva de calibración lineal
se puede determinar la concentración de las muestras de antígeno desconocidas.
En cuestión de resultados los interpretamos:
 La presencia de un anillo de precipitina alrededor de los pocillos de
antígeno indica una interacción específica antígeno-anticuerpo.
 La ausencia de anillo de precipitina sugiere ausencia de reacción.
 Cuanto mayor sea la cantidad de antígeno en el pocillo, más lejos se
formará el anillo del pocillo

Elisa simple
El principio de la prueba de ensayo inmuno absorbente ligado a enzimas (ELISA)
gira en torno a la interacción específica entre antígenos y anticuerpos. Cuando un
antígeno, como un patógeno o un molécula de interés, está presente en una
muestra, puede unirse a su anticuerpo correspondiente. Esta unión forma el
complejo antígeno-anticuerpo (complejo Ag-Ab).
En la prueba ELISA, los anticuerpos suelen estar unidos o unidos a enzimas. Este
enlace permite que los anticuerpos unidos a enzimas modifiquen sustratos
específicos, lo que resulta en un cambio de color dentro de la preparación de la
prueba. La actividad de la enzima se mide usando un colorímetro, que detecta la
magnitud de la infección o la concentración de la molécula diana en la muestra del
paciente.
Hay diferentes tipos de Elisa:
Elisa directo:

Elisa indirecto:

Sándwich Elisa:

Elisa de competencia:
Conlusiones:
En base a lo analizado se llega a concluir que la citometria de flujo Elisa simple,
etc nos permite el análisis, la interpretación y clasificación inmunofenotipica de los
síndromes linproliferativos crónicos, son herramientas útiles en las que se apoya el
diagnostico y el segumiento de los pacientes y seres vivos ya que gracias a estos
métodos ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se
precisa la cuantificación de productos mediante anticuerpos: tales como
diagnosticos clínicos, detección virales, bacterianas, asi como también
clasificación de anticuerpos en isotopos, búsqueda de anticuerpos monoclonales.
etc

Bibliografía
MN Editors. (2023, 2 julio). ELISA Test - Definition, principle, Procedure, types,

steps, uses. Microbiology Note – Online Biology Notes.

https://microbiologynote.com/es/procedimiento-de-prueba-de-elisa/

MN Editors. (2023b, julio 5). Radial immunodiffusion - Principle, procedure, result,

uses. Microbiology Note – Online Biology Notes.

https://microbiologynote.com/es/inmunodifusi%C3%B3n-radial/