Parcial practico Inmunología | Alejandra Ramírez

Practica 1: Sistema de Complemento

El sistema de complemento está formado por un conjunto de proteínas séricas que se activan en
casada y por proteínas reguladoras. La activación puede iniciarse a través de complejos antígeno-
anticuerpo (via clásica), por acción de polisacáridos de membrana bacterianos (via alterna) y por
moléculas de manosa unidas a la lectina fijadora de manosa de la membrana celular (via de las
lectinas). Luego de la activación de las vías ocurren una serie de reacciones que tienen en común la
activación de una C3 convertasa que escinde el complejo C5 para dar inicio a la vía común CAM.

El análisis del sistema de complemento se realiza en el marco de varias entidades clínicas, como:

- Lupus Eritematoso Sistémico.

- Artritis autoinmune
- Angioedema.
- Síndromes de vasculitis.
- Nefritis.
- Infecciones recurrentes

Las pruebas cuantitativas, usualmente analizan las concentraciones de componentes específicos del
complemento e incluyen ensayos inmunoquímicos. Entre ellas se encuentran: Turbidimetría,
Nefelometría, ELISA, inmunodifusión radial.

Las pruebas cualitativas o ensayos funcionales miden la actividad total del complemento (lisis) en
las distintas vías de activación. Una de ellas es la capacidad hemolítica 50 del complemento (CH50).

Turbidimetría: dispersión de luz extensa.

- Mide: Proteína C3.

- Precipitación de C3 en presencia de anticuerpos anti- C3 humana.
- La disminución de luz es proporcional a la concentración de C3, es decir mientas menos luz
más C3.

Nefelometría:

- Mide radiación dispersa

- Formación de complejos Ag- Ac al agregar suero anti- IgG a la muestra estudiada en
cuestión.
- Nefelómetro.

ELISA:

- Detecta depósitos de: C1q, C1s, C3, C4, Factor B, proteína de unión a C4b, Properdina; en la
superficie plástica de un micro pocillo después de la actividad sérica.
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Inmunodifusión Radial:

- Pozos con antígenos + placa de agarosa con anticuerpos.

- Los pozos se llenan con suero.
- Los antígenos se difunden en patrón circular hasta formar un precipitado de Ag- Ac en forma
de anillo estable.

Ensayo CH50: Técnica de Kent y Fife:

La capacidad hemolítica del 50 % de los eritrocitos de carnero (CH50), es un ensayo funcional de la

activación del sistema de complemento por la vía clásica. La actividad del complemento CH50 mide
la actividad que le queda a la cascada por activarse, si esta actividad es muy baja es que el
complemento ya está siendo activado por otros factores y se encuentra agotada su capacidad.

La unidad CH50 es el volumen requerido para lisar la mitad de las células eritrocitarias de carnero
en 0.30 mL de eritrocitos sensibilizados con antisuero en 30 minutos a 37°C.

Reactivos:

- Diluyente
- Buffer de solución salina Trietanolamina (TBS), pH 7,35 que contenga cloruro de magnesio
(MgCl2) y cloruro de calcio (CaCl2).
- Células sensibilizadas: suspensión de eritrocitos de carnero 1x 109 células/mL mezcladas con
un mismo volumen de solución de anticuerpo hemolítico (anticuerpo anti-eritrocito de
carnero).

Método: El mismo día de la prueba se lavan 3 veces los eritrocitos (sangre anticoagulada) con el
amortiguador. Luego se resuspenden los eritrocitos en 15 mL del amortiguador, para realizar el
ajuste espectrofotométrico de las concentración. Para esto se lisan 0,5 mL de la suspensión en 12,5
ml de agua destilada, y se lee la absorbancia a 540 nm.

La sensibilización de las células se realiza mezclando la suspensión anterior, con amortiguador y

hemolisina anti- eritrocito de carnero producido en conejos, durante 30 minutos a 37 ° C, para dar
una dilución final 1:300 de hemolisina.

Se montan las muestras diluidas 1:20 con los anticuerpos sensibilizados y amortiguador.

Ensayo CH50: Vía Alterna:

Los glóbulos rojos de conejo tienen la propiedad de activar las vías alternas del sistema de
complemento del suero humano, tratado previamente con solución buffer EDTA y concentraciones
apropiadas de Mg produciendo hemolisis.
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Practica 2: POBLACIÓN LINFOCITARIA

Las pruebas para evaluar las células granulocíticas son:

- Ensayos funcionales:
o Función fagocítica de macrófagos o neutrófilos.
- Ensayos Cuantitativos:
o Hemograma y recuento diferencial

Las pruebas para evaluar población linfocitaria son:

- Ensayos cuantitativos:
o Hemograma y recuento diferencial.
- Ensayo Funcional:
o Discriminación de poblaciones según la densidad con la técnica de Ficoll para
observar Rosetas.

Método de Separación Linfocitaria:

Según su tamaño:

- Sedimentación.
- Filtración de columna de vidrio
- Incubación en cultivo.

Según la capacidad de adherencia:

- Columna de nylon
- Sephadex.
- Adherencia al vidrio o plástico.

Según se densidad:

- Gradiente de Ficoll
- Hypaque.
- Ficoll y Hypaque

Técnica de Ficoll: técnica de centrifugación por gradiente de densidad para separar linfocitos y
observar Rosetas.

A la muestra diluida se le agregan 5 mL de reactivo Ficoll y se centrifuga a 1800 rpm durante 40

minutos. Se extrae la segunda capa conformada por células mononucleares y plaquetas y se procede
a lavar de la siguiente forma:
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- 1er lavado: la capa conformada por células mononucleares se lava con al menos 3 veces su
volumen con PBS (buffer fosfato salino). Se suspenden suavemente con una pipeta y se
centrifugan a 1200 rpm por 10 minutos. Se remueve el sobrenadante
- 2do lavado: Se resuspenden las células mononucleares en buffer. Se centrifuga a 600 rpm
por 10 minutos para la eliminación de plaquetas. Se remueve el sobrenadante.
- 3er lavado: se resuspenden las células en un medio de cultivo RPMI

Se realiza el contaje de las células en la cámara de Neubauer.

C=FD x Fu x N° de células contadas

C= células/mL

Técnica Roseta: identificación de linfocitos

- Las células cultivadas en el medio RPMI se mezclan con una suspensión de glóbulos rojos al
2 % y suero bovino fetal.

- Se centrifuga 5 minutos a 600 rpm

- El botón obtenido es el que contiene las rosetas. Se extrae, se coloca en una lámina con una
gota de AZUL DE CRESIL y se observa al microscopio óptico.
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Se realiza un recuento diferencial para saber cuantas celulas de las observadas en un campo
corresponden linfocitos B o T.

Tipos de Rosetas:

- Rosetas E:
o Identificación de linfocitos T
o Marcadores de superficie: CD2 o T11
o Marcadores de membrana: proteínas de membrana
o Unión espontanea de linfocitos T con eritrocitos de carnero in vitro, gracias al
marcador CD2 que media la unión con antígenos análogos a antígenos específicos
de receptores CD2
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- Rosetas EAC:
o Identificación de linfocitos B
o Receptores: C3b, C4a.
o Se fundamenta en la presencia de inmunoglobulinas IgM e IgG en la superficie del
linfocito B para un epítope de antígeno.

- Rosetas EA:
o Identificación de linfocitos B
o Receptores: IgG o IgM.
o Se fundamenta en la presencia de inmunoglobulinas IgM e IgG en la superficie del
linfocito B para un epítope de antígeno.
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Práctica 3: INMUNOFLUORESCENCIA, QUIMIOLUMINISCENCIA,

ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA, CITOMETRÍA DE FLUJO.

INMUNOFLUORESCENCIA: Prueba Cualitativa.

Es una prueba inmunológica utilizada para la determinación de anticuerpo o antígeno.

Es una prueba cualitativa que requiere de compuestos fluorescentes para marcar los anticuerpos
con moléculas que tienen la propiedad de fluorescencia. Si las moléculas de anticuerpo se marcan
con un colorante fluorescente, o fluorocromo, los complejos inmunitarios que contienen estos
anticuerpos marcados con fluorescencia (FA) pueden detectarse por la emisión de luz de color
cuando se excitan con una luz de longitud de onda apropiada.

Permite observar moléculas de anticuerpos unidas a antígenos en células o cortes de tejido.

Fluorocromos: Los fluorocromos son moléculas que tienen la propiedad de fluorescencia. Estas
moléculas pueden conjugarse con la región Fc de una molécula de anticuerpo sin afectar la
especificidad de éste. Cada uno de los fluorocromos absorbe luz en una longitud de onda y emite
luz a una longitud de onda más larga.

- Fluoresceína: absorbe luz azul (490 nm) y emite una fluorescencia verde-amarillo intensa
(517 nm) (es el marcador más utilizado)
- Rodamina: absorbe en el intervalo del verde y el amarillo (515 nm) y emite una fluorescencia
roja intensa (546 nm).
- Ficoeritrina: Es un pigmento de color muy intenso y muy fluorescente obtenido de algas.
Absorbe luz de manera eficiente (30 veces más que la fluoresceína) y es un emisor brillante
de fluorescencia roja, lo cual la hace de uso amplio como un marcador de
inmunofluorescencia.

Tipos:

- Inmunofluorescencia directa:
o Se conjuga un anticuerpo primario (específico para el antígeno a investigar) con
fluoresceína.
o Se investigan antígenos directamente de la muestra, linfocitos y sus
subpoblaciones.
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- Inmunofluorescencia indirecta:
o Anti- anticuerpo conjugado con fluorocromo.
o Detecta isotipo de anticuerpos IgM, IgG, componentes del complemento en tejidos,
hormonas.

QUIMIOLUMINISCENCIA:

Se produce una reacción química con liberación energética. Los electrones saltan de las capas más
altas a las más bajas. La emisión de luz es causada por los productos de una reacción especifica
química (se emplea reacción lumínica con luminireacción).

En quimioluminiscencia, la emisión de luz es causada por los productos de una reacción específica
química, que implica generalmente:

- Marcador o gente quimioluminiscente:

o Luminol
o Éster de acridina
- Oxidante
- Enzimas o catalizadores:
o Fosfatasa alcalina
o Peroxidasa
o Galactosidasa

1. CLIA: inmunoanalisis quimioluminiscente (ensayo tipo sándwich)

Es la cuantificación de una sustancia, utilizando una reacción antígeno- anticuerpo y un marcador

como un indicador de la reacción que es un agente quimioluminiscente, puede ser el éster de
acridina u otro.

En estos ensayos se utiliza un conjugado que será un antígeno marcado con agente
quimioluminiscente o un anticuerpo marcado con agente quimioluminiscente.
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Utilidad: determinación de toxoplasma IgG e IgM, rubeola IgG e Ig, chlamydia Ag, virus
sanguíneos HIV, HBsAg, antiHBs, determinación de hormonas, perfil de anemia, drogas
terapéuticas, perfil diabetes, perfil cardiovascular, entre otras.

2. CLEIA o CELIA: Inmunoensayo enzimático por quimioluminiscencia. Es una combinación de

ensayo enzimático y quimioluminiscencia en el que se utilizan enzimas y sustratos que
producen emisión quimioluminiscente. Pueden usarse enzimas diversas como: fosfatasa
alcalina, peroxidasa, galactosidasa.
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ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA:

- Se emplean reacciones químicas con luminiscencia y se aplica corriente eléctrica

- Un magneto separa el inmunocomplejo.
- Producción de fotones a partir de la molécula marcada
- Pruebas: PCA, Tiroides (TSH)
- Es una prueba cuantitativa.

CITOMETRIA DE FLUJO

- Es una prueba que clasifica las células según su morfología y tamaño.

- Prueba cualitativa y cuantitativa
- Se emplea un citómetro.
- Analiza la presencia de proteínas de membrana (marcadores de membrana) con
fluorescencia.
- Utilidad: monitoreo de enfermedades y tratamientos, monitoreo de CD4+ y CD8+, HIV.
- Parámetros que evalúa: AND, ARN, leucemia linfoide crónica, citosinas, proteínas.
- Marcadores: fluorocromos (rodamina, fluoresceína, naranja de ueridina, verde de calcio.
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Practica 4: EIA- ELISA

EIA: ENZIMOINMUNOANÁLISIS

Es una técnica inmunológica muy sensible para la detección y cuantificación de moléculas presentes
en LCR, suero, orina y otros líquidos biológicos.

Este método se basa en el principio de competencia que se presenta entre un antígeno no marcado
(Antígeno frío) y el mismo antígeno marcado con enzimas (antígeno caliente) por un anticuerpo
específico presentado en una concentración limitante.

Las enzimas utilizadas como marcadores son:

- Fosfatasa alcalina.
- Peroxidasa.

Los EIA se clasifican en dos grupos:

1. EIA heterogéneo: en los cuales el Ag se encuentra marcado con la enzima o el anticuerpo es

separado del complejo Ag-Ac-Enzima antes de medir la actividad enzimática en cada
fracción. Se caracteriza por presentar una fase sólida. Hay que realizar lavados:
o ELISA: ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima. Es un tipo de EIA heterogéneo.
2. EIA Homogéneo: la actividad enzimática del Ag marcado es medida en presencia del
complejo Ag-Ac-Enzima, la actividad enzimática de este complejo se encuentra inhibida
o EMIT: el Ag compite con el conjugado Ag-Enzima, por una cantidad limitada de Ac.
La unión al Ac altera la actividad de la enzima, este sistema no requiere de lavados
entre etapas. Fase liquida.

ELISA: ENSAYO DE INMUNOABSORCIÓN LIGADO A ENZIMAS

Es un EIA (enzimoinmunoensayo) heterogéneo, que utiliza como marcador una enzima. Los ELISA
incluyen una separación del complejo Ag-Ac-Enzima del Ag o Ac marcado enzimáticamente.

Tipos de ELISA

1. ELISA no competitivo:
 Directo:
 Ocurre una sola reacción Ag-Ac.
 Determina Ag.
 Ac especifico marcado.
 Indirecto:
 Ag unido a pocillo
 Ac en suero a ensayar se une a antígeno
del pocillo
 Ac específico anti-anticuerpo marcado
con enzima se une al anticuerpo que
hubiera reaccionado previamente.
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 Sándwich
 DAS: Sándwich de doble anticuerpo
o Pocillo recubierto con un Ac específico.
o Muestra problema en el que se
encuentra el antígeno.
o Ac específico anti-antígeno marcado
o Al añadir sustrato o revelador, ocurre
un cambio de color observable.
 HADAS: Sándwich heterólogo.
o Pocillo recubierto con Ac
específico de antígeno
o Muestra problema en el
que se encuentra el
antígeno
o Ac específico de antígeno
de epítopo diferente al
primero.
o Anticuerpo específico anti- anticuerpo conjugado (marcado
enzimáticamente).

“La intensidad del color formado en el pocillo en un ensayo ELISA NO COMPETITIVO es

directamente proporcional a la concentración de antígeno que existiera en la muestra.”

2. ELISA Competitivo:
- Competición de Antígeno, intervienen antígenos sin marcar (ag problema) y el antígeno
marcado, ambos compiten por el anticuerpo.
- Competición de Anticuerpos: intervienen anticuerpos de la muestra (sin marcar) y el
anticuerpo marcado, ambos compiten por el antígeno.

“La intensidad del color formado en un ensayo ELISA COMPETITIVO es inversamente

proporcional a la concentración de antígeno o anticuerpo que exista en la muestra.”

Enzimas o marcadores utilizados:

- Peroxidasa.
- Fosfatasa alcalina.
- B-galactosidasa.
- Glucosa oxidasa

Sustratos:

- MUG, AMPG. LS
- OPD, TTB, ABTS, DAB.
- PNPP, NAPFB, NARD, BCLP.
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Etapas generales de ELISA:

1. Sensibilización de pocillos: lo hace la casa comercial.

2. Incubar la muestra diluida en el pozo por 30’, 40’ o 60’
3. Lavado con buffer previamente diluido para eliminar el exceso de antígeno o anticuerpo no
unido al pocillo. La solución de lavado generalmente viene en concentraciones de 20X o 50X
(20 o 50 veces concentrado). Un pozo debe lavarse con aproximadamente 300 uL de 8 a 10
veces, una tira contiene 8 pozos, por lo que 2400 uL corresponderían a 1 lavado de una tira.
Si cada pozo debe lavarse 8 veces entonces la cantidad de solución de lavado para una tira
será de 18,4 mL.
4. Incubación con el anticuerpo secundario marcado con la enzima (conjugado).
5. Lavado (según el ensayo) para eliminar el exceso de enzima no unida al complejo Ag-Ac.
6. Adición del sustrato cromógeno.
7. Agregar solución “Stop”, un acido que frena la reacción.
8. Lectura con espectrofotómetro o visual.

Hay que tomar en cuenta la cantidad de veces que se debe lavar la tira durante todo el ensayo
para preparar la solución buffer de lavado.

Es necesario tener un blanco, controles positivos, control positivo alto y control positivo bajo.
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Practica 5: RIA, PCR y WESTERN BLOT

RIA: Radioinmunoensayo

Se emplean Ag marcados con isotopos radioactivos y se colocan en solución donde está el

anticuerpo a medir.

Se agregan Ac contra el Ag para medir la cantidad de Ag presente con base a la competencia

existente de Ag marcado y no marcado para unirse al Ac.

- Revelado: partículas alfa y beta, rayos gamma.

- Marcadores: Yodo 125, Carbono 14, Cromo 51, Tritio.

- RIA competitivo:
o Mas usado.
o El receptor específico es un Ag que se une al Ac (ligando) a ser medido.
- RIA no competitivo:
o El Ac es el radio marcado y no el ligando.
o Usado cuando el ligando es difícil de marcar.
o Ag ligados a virus

- Rayos Gamma: son rayos penetrantes.

- Partícula alfa: de poca penetración.
- Partícula beta: pueden ser frenados por materiales sólidos o líquidos.

- Aplicaciones: determinación de hormonas, anticuerpos antinucleares, IgE, anticuerpos

hepatitis y antígenos hepatitis.

- Medidas de bioseguridad que deben ser tomadas en el RIA:

o Los desechos de las pruebas de radioinmunoensayo se deben guardar por unos
meses en anaqueles especiales, con revestimiento de plomo, para lograr la
inactivación del poco material radiactivo presente. Su eliminación se hara
enterrándolos en sitios destinados para este fin.
o Se deben implementar guantes, mascarillas, bata.
o Trabajar bajo campana de seguridad.
o Tener gabinetes de seguridad.

PCR: Reacción en cadena de la polimerasa

Tecnica molecular que amplifica un pequeño fragmento de ADN. Es una técnica cuyos procesos se
dan a distintos cambios de temperatura en un termociclador:

1. Desnaturalización (separación de hebras): 95°C durante 10’

2. Hibridación (unión de la cadena molde al cebador): 50- 65°C
3. Elongación (extensión de la cadena): 72°C
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4. Conservación: 4-15 °C

El ciclo se repite entre 30 y 45 veces

- Elementos de un termociclador:
o Bloque de resistencia eléctrica.
o Placa de tapa calentada constantemente a 103°C

- Elementos que intervienen en la PCR:

o ADN polimerasa.
o dNTP
o Primer o cebador.

- Tipos de PCR:
o PCR Anidada: detecta fracciones muy pequeñas de ADN.
o PCR Transcriptasa inversa: utiliza una cadena de ARN para detectar ADN molde.

INMUNOBLOT (técnica de biología molecular)

Southern Blot:

- Determina ADN
- Enzimas de restricción: separación de ADN.
- Separación por electroforesis.
- ADN separado es transferido a membranas de nylon o nitrocelulosa.
- Hibridación: incubación de la membrana con un fragmento de ADN complementario al gen
de interés (sonda) marcada con isotopo (marcador radioactivo).
- Visualización con autoradigrafía de la banda donde se ha producido la unió.

Northern Blot:

- Determina ARN
- Revelador:
o Sondas de quimioluminiscencia
o Gel de agarosa.
- Marcadores: radioactivos o cromógenos. P32
- Quimioluminiscencia.

Westhern Blot:

- Determina proteínas
- Gel de policramida
- Revelador: Colorimétrico
o Azul de cromasse.
o Oro coloidal.
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- Enzimas:
o Peroxidasa.
o Fosfatasa alcalina.
- Diagnóstico de HIV 1 y 2, hepatitis B.