Control de Calidad Interno de Microbiología

1 Objetivo

Realizar control de calidad en el área de Microbiología para monitorear cultivos,

reactivos y procedimientos para así asegurar un resultado confiable.

1.2 Alcance

Tecnólogos Médico encargado del Área de Microbiología

1.3 Responsabilidades

Tecnólogo Médico: Responsable del control de calidad interno.??

1.4 Definiciones

- Agar Sangre: Medio de cultivo enriquecido que permite recuperar

microorganismos comunes y fastidiosos a partir de una gran variedad de muestras
clínicas. Permite estudiar el tipo de hemólisis que produce el microorganismo.

- Agar MacConkey: Medio de cultivo selectivo, adecuado para el aislamiento de

enterobacterias tolerantes a la bilis. Su formulación permite la diferenciación de
enterobacterias fermentadoras y no fermentadoras de la lactosa, además el
contenido de sales biliares y cristal violeta inhiben el desarrollo de bacterias Gram
positivas.

- Agar Cromo UTI: Medio no selectivo y diferencial para el aislamiento e

identificación presuntiva de patógenos comunes en el tracto urinario mediante
sustratos cromogénicos.

- Asa calibrada: Como su nombre lo indica, está calibrada para tomar una cantidad
específica de suspensión microbiana. Se usa cuando es necesario que el inóculo
cumpla con lo estandarizado en la técnica.

-Cepa ATCC: microorganismos de referencia y certificados para el control de

calidad en microbiología, conocidos como “American Type Culture Collection”,
poseen características como pruebas morfológicas y bioquímicas específicas.

-CLSI: Clinical and Laboratory Standard Institute. (Norma de aplicación mundial

establecida mediante el proceso de consenso del Instituto de Estándares Clínicos
y de Laboratorio).
1.5 Consideraciones generales:

Los medios de cultivo comerciales no requieren pruebas de control de calidad

adicional, debido a la certificación del fabricante. .,……

2. Equipos, materiales y reactivo

2.1 Equipos.

- Estufa de Cultivo a 35°C.

- Microscopio.

- Refrigerador.

2.2 Materiales.

- Mechero Bunsen

- Encendedor

- Asa calibrada

- Plumón

- Portaobjeto.

- Sensidiscos

- Torulas estériles

2.3 Reactivos.

- Reactivo de Tinción de Gram

- Reactivo de Kovacs

- Estándar McFarland 0,5

- Sensidiscos

- Medios de cultivos enriquecidos, selectivos, diferencial.

- Material de prueba, Cepas control ATCC

 Escherichia coli ATCC 25922

 Enterococcus faecalis ATCC 29212
 Staphylococcus aureus ATCC 25923
 Pseudomona aeruginosa ATCC 27853
 Klebsiella pneumoniae ATCC 11653

3. Procedimiento

(Suponiendo que tenemos cepa ATCC congelada en leche)

-Realizar una resiembra de las cepas ATCC necesarias con 24 horas de

antelación (ver Anexo 1 para preparación y mantenimiento de cepas ATCC)

3.1 Control de Medios de Cultivo

Los medios de cultivo comerciales no requieren pruebas de control de calidad

adicional, puesto que su calidad ha sido certificada por el fabricante, no obstante,
se debe hacer control de Calidad interno, para esto dejar placas de Agar sangre,
Mac Conkey y Mueller Hinton 24/48 horas de incubación en la estufa a 356°C.

3.2 Métodos basados en pruebas de bioquímicas:

Las pruebas bioquímicas han sido ampliamente utilizadas para diferenciar

bacterias. Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el microorganismo es
capaz de fermentar azúcares, presencia de enzimas, degradación de compuestos,
producción de compuestos coloreados, etc.

3.2.3 Procedimiento

- Con un asa recta previo sollamado tomar inóculo de cepa Escherichia coli ATCC
25922 y realizar de forma individual la siembra en tubo de Agar TSI, LIA, Citrato y
Urea, para esto se inocula hasta el fondo del tubo y se estría en el tendido.

- Repetir el mismo procedimiento anterior con la cepa de Klebsiella pneumoniae

ATCC 11653 en los tubos Agar TSI, LIA, Citrato y Urea.

- Con las mismas cepas (Escherichia coli ATCC 25922 y Klebsiella pneumoniae
ATCC 11653) sembrar para cada una un tubo Agar MIO, para esto introducir con
el asa recta hasta el fondo del tubo con un movimiento, teniendo el mismo trayecto
de entrada como de salida.
- Con un asa tomar inóculo de cepa de Enterococcus faecalis ATCC 29212, y
sembrar en tubo Agar Sal y Bilis Esculina para esto se inocula hasta el fondo del
tubo y se estría en el tendido.

- Llevar los tubos a la estufa en aerobiosis a 35°C durante 18-24 hr

- Registrar los resultados de forma manual en planilla.

3.3 Control de Tinción de Gram:

Permite evaluar la calidad de los reactivos, al operador y la calidad del

microscopio mediante el uso de cepas controles de afinidad tintorial, morfología y
disposición conocida.

3.3.1 Procedimiento:

- Rotular dos portaobjetos con lápiz graso por uno de sus extremos con los
nombres diferenciables (Por Ejemplo: Gram + y Gram -)

-Preparar los frotis bacterianos en un portaobjeto con una gota de Suero

Fisiológico tomando un inóculo de Staphylococcus aureus ATCC 25923 y en otro
portaobjetos un inóculo de la cepa Escherichia coli ATCC 25922 a partir de cultivo
sólidos.

- Fijar con calor (mechero).

- Realizar la tinción de Gram:

 Agregar cristal violeta (2 a 3 gotas) y dejar actuar 1 minuto,

 Lavar con agua corriente para eliminar el exceso de colorante.
 Agregar lugol en (2 a 3 gotas) y dejar actuar 1 minuto.
 Lavar con agua corriente.
 Decolorar con alcohol acetona durante 2 segundos.
 Lavar con agua corriente
 Agregar safranina y dejar actuar 30 segundos.
 Lavar con agua para eliminar el exceso del colorante de contraste.
 Dejar secar la preparación a temperatura ambiente.

-Observar al microscopio.

-Registrar los resultados

4. Antibiograma por Difusión en Agar técnica de Kirby-Bauer

El antibiograma por difusión en agar consiste en depositar, en la superficie de agar

de una placa previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel filtro
impregnado con los diferentes antibióticos a testear.

Tan pronto el disco de antibiótico se pone en contacto con la superficie húmeda

del agar, difunde radialmente a través del espesor del agar formándose una
gradiente de concentración. Transcurridas 18-24 horas de incubación los discos
aparecen rodeados por una zona de inhibición.

4.1 Procedimiento:

4.1.1 Preparación del inóculo:

Se toma con una tórula estéril 2-3 colonias de la cepa ATCC que se encuentren
aisladas, a partir de colonias de 18-24 hrs. en medio no selectivo y se agregan a
tubo con suero fisiológico. Se debe ajustar la turbidez a un equivalente de 0,5 en
la escala McFarland.

4.1.2 Siembra en Agar

Antes de que transcurran 15 minutos de haber ajustado el inóculo, Se sumerge

una tórula estéril en tubo con el inóculo de la cepa a estudiar, haciendo rotar la
tórula 2 o 3 veces y presionando firmemente la pared interior del tubo, para
remover el exceso de inóculo.

Se inocula toda la superficie de la placa de agar que corresponda, sin dejar

ninguna zona libre. Esto se consigue pasando la tórula en tres direcciones
(rotando la placa en 60º cada vez), pasando la tórula de izquierda a derecha en
líneas una tras otra hasta completar toda la placa, en cada dirección se realiza lo
mismo.

Dejar secar la superficie entre 3 a 5 minutos, pero nunca más de 15 minutos, la

tapa de la placa puede quedar entreabiertas. Esto se realiza para permitir que el
exceso de humedad de la superficie se absorba antes de aplicar el disco con el
antibiótico.

4.1.3 Aplicación de sensidiscos

Se aplican los discos con los antimicrobianos a determinar, con un máximo de 6
sensidiscos por placa de 10 cm.

Los sensidiscos no pueden estar más próximos entre sí que una distancia de 24
mm., medida de centro a centro de los discos o utilizar los multidiscos ya
preparados en fábrica.

Un disco no debe ser relocalizado una vez que haya tomado contacto con la
superficie del agar.

Colocar los sensidiscos como se indica para cada cepa ATCC:

 Escherichia coli ATCC 25922 (Mueller Hinton): Gentamicina, Cefalotina,

Ciprofloxacino, Amikacina, Ampicilina, Nitrofurantoina.

 Pseudomona aeruginosa ATCC 27853 (Mueller Hinton): Gentamicina,

Imipenem, Meropenem, Ciprofloxacino, Cefepime, Ceftazidima.

 Staphylococcus aureus ATCC 25923 (2 placas de Mueller Hinton):

Rifampicina, Clindamicina, Cefoxitina, Eritromicina, Sulfatrimetropin,
Ciprofloxino, Ampicilina.

 Enterococcus faecalis ATCC 29212 (Mueller Hinton): Sulfatrimetropin.

-Incubar la placa en forma invertida en estufa de cultivo a 35°C por 18-24 Hrs.

Me parece mucho que podemos probar cualquiera que cuente con halo de
inhibición en el clsi

4.1.4 Resultados

-Medir los halos de inhibición con regla, expresado en mm y corroborar con los
datos estandarizados para cada antimicrobiano según las categorías establecidas
por el CLSI, vigentes para cada año.

-Registrar los resultados, en forma manual en planilla

-Realizar este control de Calidad cada 15 días y cada vez que se cambie el lote de
los cambie el sensidiscos y medios de cultivos.
Anexo 1: Preparación y mantenimiento de cepas ATCC

Para conservar las cepas de referencia se recomienda congelarlas usando crio

preservantes como: leche descremada al 20% o caldo glicerol 15 a 20% de la
siguiente manera:

1. Sembrar la cepa en el agar adecuado e incubar por 18-24 horas a 35ºC.

2. Cosechar con tórula y hacer una suspensión espesa en leche o caldo glicerol en
un tubo de material resistente (CRIOTUBOS/CRIOVIALES) a bajas temperaturas
con tapa rosca con un volumen de preservante de acuerdo con el tamaño del tubo.

3. Identificar los tubos indicando la cepa conservada y fecha de preparación.

4. Agitar en vórtex y congelar a –70ºC (duración indefinida) o –20ºC (dura

alrededor de 1 año). Mientras más baja sea la temperatura de congelación, mayor
duración de la cepa de forma viable

5. Rotular adecuadamente y dejar registro de la ubicación.

Para recuperar la cepa conservada, se raspa la superficie de la suspensión en

estado congelado con un asa y se siembra en el medio adecuado. Incubar por 24-
48 horas a 35ºC.

Evitar la exposición prolongada a temperatura ambiente para evitar el

descongelamiento de la suspensión conservada pues la cepa perderá viabilidad.
Si se descongela este crio tubo, se debe eliminar. Se recomienda no hacer más de
5 traspasos desde el desarrollo obtenido de la cepa de inicio, para evitar posible
contaminación o cambios en las características biológicas. Cada traspaso tiene
una viabilidad de 1 mes.

Leche descremada al 20%

-Leche descremada en polvo → 20 g

-Agua destilada → 100 ml

• Distribuir 1ml en crio tubos.

• Esterilizar a 105-110ºC por 20 minutos.

• Conservar refrigerado con fecha de elaboración

Anexo 2: Caracterización de Cepas ATCC para CCI

Staphylococcus aureus ATCC®25923

 Beta-lactamasa negativo.
 Se utiliza en el CCI de agentes antimicrobianos utilizados contra bacterias
Gram positivas no fastidiosas.

Enterococcus faecalis ATCC® 29212

 Sensible a ampicilina, vancomicina y altos niveles de aminoglucósidos.

 Concentración de Timina y Timidinas de Agar Mueller Hinton
 Utilizado como control de aminoglicósidos de alta carga (gentamicina 120
µg y estreptomicina 300 µg) en Enterococcus spp p.

Escherichia coli ATCC® 25922

 Beta-lactamasa negativa.
 Se indica en el CCI de agentes antimicrobianos utilizados en bacterias
Gram negativas no fastidiosas.
 Control negativo de test de screening y confirmatorio de BLEE.

Pseudomonas aeruginosa ATCC® 27853

 Presenta beta lactamasa AmpC inducible.

 Se utiliza en el CCI de agentes antimicrobianos probados contra bacterias
Gram negativas no fastidiosas.
 En Enterobacterias para control de antimicrobianos carbapenémicos
 En el control de antimicrobianos usados en Pseudomonas aeruginosa y
Acinetobacter spp.
 Permite comprobar que el contenido de cationes calcio y magnesio y el pH
del agar Mueller-Hinton sea satisfactorio, particularmente para probar
aminoglucósidos como Gentamicina.