EFICACIA ANTIMICROBIANA

1. OBJETIVO

Evaluar la eficacia de los conservantes antimicrobianos incorporados en los productos

farmacéuticos no estériles. Esta debe ser demostrada para formas farmacéuticas de base
acuosa, multidosis tópicas y orales, siguiendo los lineamientos del capítulo 51 de la
farmacopea vigente.

2. ALCANCE

Este procedimiento aplica para los productos de... con formas farmacéuticas de base acuosa,
multidosis tópicas y orales.

3. DEFINICIONES

3.1. Conservantes antimicrobianos: son sustancias agregadas a productos farmacéuticos

acuosos. Las formas farmacéuticas no estériles pueden tener conservantes agregados para
protegerlas del desarrollo de microorganismos introducidos inadvertidamente durante o
después del proceso de fabricación. Los organismos de desafío se basan generalmente en
los posibles contaminantes del producto farmacéutico, teniendo en cuenta los atributos
físicos, la formulación y el uso previsto del mismo.

3.2. Eficacia antimicrobiana: la eficacia antimicrobiana puede ser inherente al producto o

producida por la adición de un conservante antimicrobiano. Esta debe ser demostrada para
los envases multidosis o para productos que contengan conservantes antimicrobianos. Para
formas farmacéuticas de base acuosa, multidosis tópicas y orales, y para otras formas
farmacéuticas, como por ejemplo oftálmicas, óticas, nasales, de irrigación y líquidos de
diálisis.

3.3. Reducción logarítmica: se define como la diferencia entre el valor de la concentración

inicial de UFC/ mL en suspensión, en unidades Log10 y el valor UFC/mL, en unidades
Log10, de los sobrevivientes al tiempo correspondiente.

3.4 Control positivo: el control positivo de esta prueba se tiene con el fin de conocer el
número de UFC inoculadas al inicio y posteriormente para verificar que lo que inhibe el
producto si es por los conservantes, mas no por deterioro de la cepa con el tiempo.

4. RESPONSABILIDAD

Es responsabilidad de los analistas de estabilidad reportar al área microbiología cuando

requieren los análisis. Es responsabilidad de los analistas de Microbiología realizar la prueba
de la eficacia antimicrobiana y de emitir los resultados. El Director de Control de Calidad es
responsable de hacer cumplir este procedimiento.
 ELABORADO POR: REVISADO POR: APROBADO POR:

Firma: Firma: Firma:

Cargo: Cargo: Cargo:

Fecha: Fecha: Fecha:

5. POLÍTICAS

5.1. La prueba de la eficacia antimicrobiana se realiza a productos que contengan una

actividad de agua de más de 0,6.

5.2. Debe establecerse la capacidad del procedimiento para detectar microorganismos de

desafío en presencia de un producto a examinar adecuadamente neutralizado.

5.3. El procedimiento debe volver a realizarse si se produce algún cambio en los materiales o
métodos, el producto o los materiales que están en contacto directo con el producto y que
pueda alterar los resultados de la prueba.

5.4. Debe establecerse la capacidad promotora del crecimiento de los medios usados en este
procedimiento.

5.5. Las cepas a utilizar no deben de tener más de cinco pases a partir de la cepa original.

5.6. Usar los cultivos de los siguientes microorganismos:1 Candida albicans (ATCC Nº 10231),
Aspergillus brasiliensis (ATCC Nº 16404), Escherichia coli (ATCC Nº 8739), Pseudomonas
aeruginosa (ATCC Nº 9027) y Staphylococcus aureus (ATCC Nº 6538). Los microorganismos viables
empleados en el procedimiento deben formar parte de un cultivo de crecimiento reciente (p.ej.en fase
logarítmica de crecimiento) a excepción de las esporas A. brasiliensis.

5.7. La eficacia antimicrobiana se debe realizar cuando el proceso de estabilidad lo requiera,

generalmente al inicio y al final de la estabilidad.

5.8. El área de Estabilidad debe de informar al área de Microbiología a cuáles productos se le debe
realizar el análisis de eficacia antimicrobiana.

5.9. Para realizar dicha prueba se debe haber realizado la validación de la aptitud del método o se puede
de realizar a la par.

6. DESARROLLO

6.1. Materiales y equipos

6.1.1. Cajas de Petri estériles
6.1.2. Tubos de ensayo
6.1.3. Gradilla para tubos
6.1.4. Incubadoras
6.1.5. Autoclave
6.1.6. Cabina biosegura
6.1.7. Contador de colonias (Scan)
6.1.8. Refrigerador
6.1.9. Densicheck
6.1.10. Vortex
6.1.11. Equipo de filtración
6.1.12. Agar Sabouraud
6.1.13. Agar Tripticasa de Soja
6.1.14. Solución TTC
6.1.15. Solución salina
6.1.16. Cepas: Candida albicans (ATCC Nº 10231), Aspergillus brasiliensis (ATCC Nº 16404),
Escherichia coli (ATCC Nº 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC Nº 9027) y Staphylococcus
aureus (ATCC Nº 6538).

6.2. Procedimiento

6.2.1. Preparación de las cepas de prueba

6.2.1.1. Los microorganismos viables empleados en el procedimiento deben formar parte de un cultivo
de crecimiento reciente (en fase logarítmica de crecimiento) a excepción de las esporas A. brasiliensis y
se deben cultivar por separado cada cepa bacteriana y fúngica de prueba. A continuación, se describen
las condiciones de cultivo para cada inóculo (ver la Tabla 1)

Tabla 1. Condiciones de Cultivo para la Preparación de Inóculos

Organismo Medio Apropiado Temperatura Tiempo Tiempo de
de de Incubación Incubación de
Incubación del Inóculo Recuperación
Microbiana

Escherichia coli Agar Digerido de 32,5 ± 2,5° 18–24 horas 3–5 días
(ATCC Nº 8739) Caseína y Soja

Pseudomonas Agar Digerido de 32,5 ± 2,5° 18–24 horas 3–5 días

aeruginosa Caseína y Soja
(ATCC Nº 9027)

Staphylococcus aureus Agar Digerido de 32,5 ± 2,5° 18–24 horas 3–5 días
(ATCC Nº 6538) Caseína y Soja

Candida albicans Agar Sabouraud 22,5 ± 2,5° 44–52 horas 3–5 días
(ATCC Nº 10231)

Aspergillus brasiliens Agar Sabouraud 22,5 ± 2,5° 6–10 días 6–10 días
(ATCC Nº 16404)

6.2.1.2. Para cosechar los cultivos bacterianos y de C. albicans, emplear solución salina SR
estéril, lavar la superficie de crecimiento y recogerlo en un recipiente adecuado. Para
cosechar las esporas de A. brasiliensis, usar solución salina SR estéril que contenga 0,05%
de polisorbato 80. La suspensión de esporas debe tratarse asépticamente (p.ej., filtración a
través de lana de vidrio estéril) para eliminar hifas.
6.2.1.3. Las suspensiones microbianas que se usan para inoculaciones deben ajustarse
teniendo en cuenta lograr una turbidez de 0.5 en la escala MacFarland para obtener un
recuento microbiano de aproximadamente 1x10 8 UFC/mL. mL. Usar las suspensiones
bacterianas y de levaduras dentro de las 2 horas o dentro de las 24 horas, si se almacenan
entre 2° y 8°. Se puede preparar una suspensión de esporas estable y mantenerla a 2°–8°
hasta 7 días.
6.2.2. Inoculación al producto
6.2.2.1. Tomar cinco envases originales, si hay suficiente volumen de producto disponible en
cada envase y si el envase del producto puede ser penetrado asépticamente, o en cinco
recipientes bacteriológicos estériles con tapa, de tamaño adecuado a los que se ha
transferido un volumen suficiente de producto.

6.2.2.2. Identificar los recipientes con el nombre de cada uno de los microorganismos, fecha
de inoculación, fecha de los tiempos de análisis, según la categoría.

6.2.2.3. Para la ejecución de esta prueba la concentración de la suspensión de

microorganismos diluidos en el estímulo final resultará en un valor entre 1 × 10 5 y 1 × 106
UFC/mL del producto a probar, para la Categoría 1,2,3. En los productos de la Categoría 4 la
concentración final de la preparación de prueba después de la inoculación está comprendida
entre 1 × 103 y 1 × 104 UFC/mL del producto.

6.2.2.3. Adicionar el volumen de suspensión del inóculo empleado está entre 0,5% y 1,0%
del volumen del producto para minimizar los efectos potenciales en el producto. Por ejemplo,
si el volumen total de la preparación a probar es 120 mL, el volumen del estímulo debe ser
entre 0.6 mL y 1.2 mL (un microorganismo por cada envase). Para el desarrollo de esta
prueba se deben tener en cuenta los microorganismos descritos en la tabla 1.

Tabla 2. Categorías de Productos Farmacopeicos

Categoría Descripción del Producto

1 Inyectables, otros parenterales incluyendo emulsiones, productos óticos, productos nasales estériles y
productos oftálmicos preparados con bases o vehículos acuosos

2 Productos empleados de manera tópica preparados con bases o vehículos acuosos, productos nasales no
estériles y emulsiones, incluyendo aquéllos que se aplican a membranas mucosas

3 Productos orales a excepción de antiácidos, preparados con bases o vehículos acuosos

4 Antiácidos preparados con una base acuosa

6.2.2.4. Si el producto al cual se le realiza la verificación de la prueba de eficacia

antimicrobiana presenta propiedades antimicrobianas según la validación de la aptitud de
recuento microbiana, esta debe ser neutralizada.

6.2.2.5. Adicionalmente al montaje de la muestra realizar un control positivo. Tomando 5

frascos con el mismo volumen del producto, pero solo con solución salina estéril e inocular la
misma cantidad de microorganismo. (un microorganismo por cada envase)

6.2.2.6. Tomar 10g o mL del producto inoculado y transferirlo a un frasco que contenga 90 ml
de caldo + el neutralizante validado en la aptitud del método de recuento microbiano para
cada producto, este será la dilucion 10-1 (ejemplo: caldo caso al 1% de tween 80) y realizar
dilución hasta 10-6 con solución salina. El mismo proceso se realiza con el control positivo en
el tiempo 0 con el fin de verificar la carga microbiana, pero haciendo dilución solo con
solución salina

6.2.2.7. Incubar los 5 frascos de producto que contienen los microorganismos a una
temperatura de 22.5° C +/-2.5° C, durante el tiempo que diga cada categoría.
 6.2.2.8. Realizar siembra en profundidad de todas las diluciones, por duplicado y adicionar
entre 18 mL – 20 mL de Agar Casoy para las bacterias y de Agar Sabouraud para los hongos
y levaduras. Homogenizar de la siguiente manera: Mover la caja de Petri de arriba hacia
abajo 5 veces, rotar la caja 5 veces en el sentido de las agujas del reloj, mover la caja 5
veces en sentido horizontal y rotar la caja 5 veces en sentido contrario de las agujas del reloj.
Posteriormente dejar solidificar e incubar de 30° C - 35° C las bacterias y 20° C -25° C los
hongos y levaduras.

6.2.2.9. Pasado el tiempo de incubación según tabla 1, retirar las cajas de las incubadoras y
seleccionar las cajas correspondientes a una dilución determinada y que muestren el mayor
número de colonias, menor de 250 para bacterias y 50 para hongos, sacar la media
aritmética de los dos recuentos y multiplicar por el inverso de la dilución. Revisar las cajas de
todas las diluciones para verificar que el número de UFC presentes disminuyen a medida que
aumentan las diluciones.

6.2.2.10. Según la categoría del producto y el tiempo estipulado a verificar (ver tabla 3),
retirar los recipientes de la incubadora y realizar el mismo proceso según numeral 6.2.2.6. y
6.2.2.8.

6.2.2.11. Usando las concentraciones calculadas de UFC/ mL presentes al inicio de la

prueba, calcular el cambio en valor Log10 de la concentración de UFC/mL para cada
microorganismo en los intervalos de prueba aplicables, y expresar los cambios en la
concentración en términos de reducciones logarítmicas.

6.2.2.12. Reportar los resultados obtenidos en cada uno de los tiempos y comparar los
recuentos en cada tiempo con la especificación según la categoría del producto analizado.
Los datos obtenidos quedan registrados en la hoja de trabajo “Resultados de la prueba de
eficacia antimicrobiana”. Y en los anexos descritos en este procedimiento.

6.2.2.12. Para el control negativo, tomar una alícuota del diluyente con neutralizante y
sembrar por duplicado (en dos cajas de Petri), adicionar entre 18 mL - 20 mL de Agar Casoy
e incubar de 30 º C -35º C durante 3 a 5 días y en otras dos cajas entre 18 mL -20 mL de
Agar sabouraud en el caso de levaduras y hongos e incubar a 20 º C - 25º C durante 3 a 7
días.

6.2.2.13. Realizar siembra de análisis a producto terminado (análisis de rutina) según POE,
PCC-024 y reportar los resultados en los anexos descritos en este procedimiento.

6.2.2.14. Los requisitos de eficacia antimicrobiana se alcanzan si se cumplen los criterios

especificados en la siguiente tabla:
Tabla 3. Criterios aceptación para los Microorganismos Evaluados
En productos de la Categoría 1
Bacterias A los 7 días, una reducción logarítmica de no menos de 1,0 desde el
recuento inicial calculado; a los 14 días, una reducción logarítmica de no
menos de 3,0 del recuento inicial; y a los 28 días ningún incremento con
respecto al recuento de los 14 días.
Levaduras y Hongos Filamentosos Ningún incremento a los 7, 14 y 28 días con respecto al recuento inicial

Bacterias
Levaduras y Hongos Filamentosos
En productos de la Categoría 2
A los 14 días, una reducción logarítmica de no menos de 2,0 desde el
recuento inicial; y
a los 28 días ningún incremento con respecto al recuento de los 14 días
Ningún incremento a los 14 y 28 días con respecto al recuento inicial
En productos de la Categoría 3
Bacterias A los 14 días, una reducción logarítmica de no menos de 1,0 desde el
recuento inicial; y
a los 28 días ningún incremento con respecto al recuento de los 14 días
Levaduras y Hongos Filamentosos Ningún incremento a los 14 y 28 días con respecto al recuento inicial
En productos de la Categoría 4
Bacterias, Levaduras y Hongos Ningún incremento a los 14 y 28 días con respecto al recuento inicial
Filamentosos

NOTA: Laexpresión "ningún incremento" en los recuentos se define como no más de 0,5 unidades Log10, por
encima del valor con el que se compara.

ANEXO 1

ESQUEMA DE SIEMBRA CON S.aureus INICIAL T0

1ML 1ML 1ML 1ML 1ML 9ml de

1ML solución salina
MEDICION EN
EL
DENSICHEK 6
1,2mL 10-
0,5 1 5
2 3 4 6
120ML SLN 10- 10- 10- 10- 10- 10-
SALINA +
S.aureus

INOCULO
1ML
108 1ML 1ML 1ML 1ML 1ML
S.aureus

1,2mL 2 3 4 5 6
10- 10- 10- 10- 10-
106 10-1
90 ml Caldo +
neutralizante+
120ml PT +
10g PT con
S.aureus S.aureus
 Sembrar 1 ml por duplicado

Nota: esta siembra se debe realizar en todos los tiempos con todos los microorganismos de
prueba.

REPORTE DE ANALISIS EFICACIA ANTIMICROBIANA

ANEXO 1
Informe de Análisis Microbiológico de Producto Terminado
(Farmacéutico y Cosmético)
CLIENTE: ____________________________________ PRODUCTO: _____________________________________
DIRECCIÓN: __________________________________ NÚMERO DE LOTE: ________________________________
FECHA INICIO DE ANALISIS: ____________________ N°. CONTROL: MCI_________________________________
FECHA FINAL DE ANALISIS: ____________________ TIEMPO DE ESTABILIDAD: __________________________
FECHA DE FABRICACIÓN: ______________________ FECHA DE VENCIMIENTO: _________________________
DESCRIPCION DE LA MUESTRA: ______________________________________________________________________

RECUENTO INICIAL DEL PRODUCTO.

IDENTIFICACION DE LA MUESTRA RECUENTO INICIAL DEL PRODUCTO

Agar Tripticasa de Soja Agar Sabouraud con cloranfenicol
(RTMA) UFC/g (RTCHL) UFC/g

RESULTADOS
Resultado Recuento Reducción logarítmica
Fecha Tiempo Microorganismo de UFC/ml desde el recuento inicial
Escherichia coli ATCC Nº 8739
T0 Pseudomonas aeruginosa ATCC Nº 9027
Inmediatament Staphylococcus aureus ATCC Nº 6538
e después de la
Candida albicans ATCC Nº 10231
inoculación
Aspergillus brasiliens ATCC Nº 16404
Escherichia coli ATCC Nº 8739
T1 Pseudomonas aeruginosa ATCC Nº 9027
___ Días Staphylococcus aureus ATCC Nº 6538
después de la Candida albicans ATCC Nº 10231
 inoculación Aspergillus brasiliens ATCC Nº 16404
Escherichia coli ATCC Nº 8739
T2 Pseudomonas aeruginosa ATCC Nº 9027
___ Días Staphylococcus aureus ATCC Nº 6538
después de la Candida albicans ATCC Nº 10231
inoculación
Aspergillus brasiliens ATCC Nº 16404
Escherichia coli ATCC Nº 8739
T3 Pseudomonas aeruginosa ATCC Nº 9027
___ Días Staphylococcus aureus ATCC Nº 6538
después de la Candida albicans ATCC Nº 10231
inoculación
Aspergillus brasiliens ATCC Nº 16404

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ESPECIFICACIONES DE ACEPTACIÓN PARA LA EFICACIA ANTIMICROBIANA

Categoría 1
 Bacterias: A los 7 días, una reducción logarítmica de no menos de 1,0 desde el recuento
inicial calculado; a los 14 días, una reducción logarítmica de no menos de 3,0 del recuento
inicial; y a los 28 días ningún incremento con respecto al recuento de los 14 días.

 Levaduras y Hongos Filamentosos: Ningún incremento a los 7, 14 y 28 días con respecto al

recuento inicial

Categoría 2
 Bacterias: A los 14 días, una reducción logarítmica de no menos de 2,0 desde el recuento
inicial; y a los 28 días ningún incremento con respecto al recuento de los 14 días

 Levaduras y Hongos Filamentosos: Ningún incremento a los 14 y 28 días con respecto al

recuento inicial

Categoría 3
 Bacterias: A los 14 días, una reducción logarítmica de no menos de 1,0 desde el recuento
inicial; y a los 28 días ningún incremento con respecto al recuento de los 14 días

 Levaduras y Hongos Filamentosos: Ningún incremento a los 14 y 28 días con respecto al

recuento inicial

Categoría 4
 Bacterias, Levaduras y Hongos Filamentosos: Ningún incremento a los 14 y 28 días con
respecto al recuento inicial

NOTA: La expresión "ningún incremento" en los recuentos se define como no más de 0,5
unidades Log10, por encima del valor con el que se compara.

CONCLUSION:
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
 ___________________________ _________________________________
ANALISTA DE MICROBIOLOGIA DIRECTOR DE CONTROL DE CALIDAD
Fecha: _____________ Fecha: _____________

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7. HOJA DE CONTROL DE CAMBIOS

Control de Modificaciones

Modificación Descripción Fecha

No