TITULO: CEPARIO DEPTO: CONTROL DE CALIDAD FECHA: 15/05/2017

PON N: CC-010-6 Próxima revisión: 05/2019

Distribución: Control de calidad

1.- OBJETIVO
Establecer un procedimiento que indique como realizar la conservación y verificación de viabilidad, pureza y
posterior identificación de las cepas de referencia utilizadas en los ensayos de laboratorio como controles de calidad.

2.- ALCANCE
Este procedimiento es aplicable a todas las cepas microbiológicas de referencia obtenidas a partir de colecciones de
cultivos internacionalmente reconocidos (ATCC o equivalentes).

3.- RESPONSABILIDAD
Es responsabilidad de quien emite, actualizar y mantener vigente este procedimiento:

- Control de Calidad

Es responsabilidad de hacer cumplir este procedimiento:

- Aseguramiento de la calidad.

EUROLAB Especialidades Medicinales de EUROFAR S.R.L.

Administración: Avda. Juan de Garay 3881 – (C1256ABH) - Ciudad Autónoma de Buenos Aires
Tel/Fax: (011) 4926-1649/1672 e-mail: info@laboratorioseurolab.com
Planta Farmacéutica: Ruta 26 Km 1 – (3280)- Colón - Entre Ríos - Argentina.
Tel: (03447)-1545 2438 – (03442) 1555 2817 www.laboratorioseurolab.com

EMITIÓ: REVISÓ: APROBÓ:

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4.- PROCEDIMIENTO

4.1. Recepción:
El laboratorio de microbiología de EUROFAR utiliza como cepas de referencia los cultivos liofilizados provistos
por la ATCC (American Type Culture Collection). Cada cepa de referencia que ingresa al laboratorio, se debe
identificar por medio de un código de ingreso compuesto por la letra “C” seguido por un número de dos dígitos
consecutivos (a partir del 01). Dicho código identifica inequívocamente a dicha cepa y es intransferible.
La cepa ingresada se debe registrar en la planilla “Listado de cepas de referencia” que figura como Anexo I del
presente procedimiento. En dicha planilla se debe colocar: el código, la fecha de ingreso, el nombre del
microorganismo, el número de ATCC, el número de lote y las fechas de vencimiento, reconstitución y baja.
Si la cepa no es reconstituida inmediatamente se debe conservar a temperaturas de refrigeración (2 – 8 °C), pudiendo
permanecer en esas condiciones hasta la fecha de vencimiento indicada por ATCC.
El laboratorio debe contar por lo menos con las siguientes cepas:

- Escherichia coli ATCC 8739

- Staphylococcus aureus ATCC 6538
- Bacillus spizizzenii ATCC 6633
- Aspergillus brasiliensis ATCC 16404
- Cándida albicans ATCC 10231
- Clostridium Sporogenes ATCC N° 19404
- Salmonella thypimurium ATCC 14028
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

El laboratorio también puede contar con otras cepas de referencia, por ejemplo necesarias para valoraciones
microbiológicas de antibióticos o para validaciones.

El laboratorio cuenta con cepas microbiológicas de referencia ATCC de segundo y cuarto pasaje, las de segundo
pasaje, excepto Clostridium Sporogenes, se deben conservar en cryoviales, las de cuarto pasaje se deben conservar
en tubos que contengan medio de cultivo TSB con 10 % de glicerol.

Nota: Las cepas de Clostridium Sporogenes sean de cualquier pasaje deben conservarse en tubos con medio de
cultivo TSB con 10 % de glicerol ya que esto permite mantener mejor las condiciones de anaerobiosis.

4.2. Reconstitución:

Cepas de segundo pasaje: éste pasaje viene provisto de cinco packs de cepas liofilizadas con sus respectivos hisopos.
Reconstituir cada packs según las indicaciones del fabricante, una vez reconstituido el liofilizado saturar
inmediatamente los hisopos y transferirlos a cinco placas (una para cada hisopo) que contengan el medio de cultivo
indicado en la Tabla 1.
Inocular las placas de cultivo girando con suavidad el hisopo 10 veces sobre un tercio de la misma, mediante un ansa
esterilizada estirar para mejorar el aislamiento de la colonia, luego descartar el hisopo de forma apropiada ya que
representa un riesgo biológico. Incubar las placas según indica la tabla 1.

Una vez desarrolladas las placas, retirar con un ansa estéril un inoculo concentrado y disolverlo en el medio líquido
que contiene el tubo del cryovial, inocular 10 cryoviales.

Agitar hasta disolver completamente el inoculo invirtiendo el tubo varias veces, esto permitirá una suspensión de
inoculo homogénea y que los microorganismos se adhieran correctamente a las perlas del cryovial.

Con una pipeta estéril retirar el líquido sobrenadante del cryovial.

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Los cryoviales se deben rotular con el nombre del microorganismo, el código que lo identifica, la fecha de
reconstitución y un número que indique el número de cryovial (envase x de y).

Todos los cryoviales deben ser mantenidos en freezer a temperaturas ≤ –15 °C y pueden ser conservados por un
período de tiempo igual o mayor al indicado para la cepa liofilizada, siempre que se demuestre su viabilidad y
pureza. Las cepas así conservadas constituyen las cepas de reserva del laboratorio.

Cepas de cuarto pasaje: Las cepas de referencia liofilizadas se deben reconstituir de la manera indicada por el
proveedor con la ampolla de medio de reconstitución provista en el envase junto con la cepa.
Se debe homogeneizar e inmediatamente traspasar 20 µl de la suspensión de reconstitución de la cepa a tubos
conteniendo 3 ml de caldo de cultivo TSB que contiene un 10 % de Glicerol como crioconservante (previamente
esterilizados en autoclave a 121 °C durante 15 minutos) (hacer por lo menos 30 tubos por cada cepa de referencia).
Los tubos se deben rotular con el nombre del microorganismo, el código que lo identifica, la fecha de reconstitución
y un número que indique el número de tubo correspondiente (envase x de y).
Estos tubos deben ser mantenidos en freezer a temperaturas ≤ –15 °C y pueden ser conservados por un período de
tiempo igual o mayor al indicado para la cepa liofilizada, siempre que se demuestre su viabilidad y pureza. Las
cepas así conservadas constituyen las cepas de reserva del laboratorio.

4.3. Repique y control de cepas de reserva para generar cepas de trabajo:

Cada vez que se realiza una transferencia a partir de las cepas de reserva para generar cepas de trabajo se debe
completar en programa informático el ANEXO III, el cual se imprime y asienta en el cuaderno de microbiología.

Para realizar dicho repique se debe retirar del freezer la cepa de reserva.

4.3.1 En el caso de cepas de reservas conservadas en cryoviales proceder de la siguiente manera: retirar un cryovial
del freezer, destaparlo y con un ansa estéril extraer una esfera, luego tapar el cryovial y colocarlo nuevamente en el
freezer.

4.3.1.1 Colocar la esfera en un tubo conteniendo 30 ml de medio de cultivo TSB e incubar por 24 a 48 hs a 32,5 +/-
2,5 ºC para bacterias, o 5 -7 días a 22,5ºC +/- 2,5 ºC para levaduras y mohos.
Observar si el medio presenta turbidez por crecimiento bacteriano, adicionar 3 ml de glicerol previamente
esterilizado en autoclave a 121 ºC durante 15 minutos, homogeneizar y fraccionar por 3 ml en 10 tubos previamente
esterilizados. Rotular con nombre y código del microorganismo, fecha de preparación y el texto “Cepa de trabajo”.
Conservar en freezer a temperaturas ≤ -15 ºC. Estas cepas así conservadas constituyen las cepas de trabajo del
laboratorio y se pueden utilizar en los ensayos del laboratorio de microbiología, siempre que cumplan con los
controles de viabilidad, pureza e identificación.
En caso de que no cumplan los controles, se reemplazarán por un nueva serie de tubos repicados a partir de la cepa
de reserva (*).

4.3.1.2 Repicar una ansada en un tubo conteniendo medio de cultivo sólido no selectivo, indicado para cada cepa por
la ATCC, solidificado en pico de flauta. Incubar en las condiciones de tiempo y temperatura indicado por la ATCC.
Una vez transcurrido dicho tiempo observar los tubos para verificar la Viabilidad y Pureza de la cepa, es decir, que
todas las colonias del microorganismo presenten características morfológicas similares (Ver tabla 1). Si cumplen
dichos controles (junto con la identificación de cada microorganismo, ver punto 4.4.3) se pueden utilizar como
referencia para los análisis microbiológicos, caso contrario, se debe realizar un nuevo repique a partir de las cepas de
reserva e investigar las causas que originaron tal desvío.

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4.3.2 En el caso de cepas de reservas conservadas en tubos conteniendo TSB con 10 % de glicerol proceder de la
siguiente manera: retirar del freezer la cepa de reserva (un tubo por vez) y dejar que alcance la temperatura
ambiente.

Nota: cada vez que se retire un tubo del freezer, el mismo no puede ser recongelado.
4.3.2.1 Repicar una ansada en un tubo conteniendo medio de cultivo sólido no selectivo, indicado para cada cepa por
la ATCC, solidificado en pico de flauta. Incubar en las condiciones de tiempo y temperatura indicado por la ATCC.
Una vez transcurrido dicho tiempo observar los tubos para verificar la Viabilidad y Pureza de la cepa, es decir, que
todas las colonias del microorganismo presenten características morfológicas similares (Ver tabla 1). Si cumplen
dichos controles (junto con la identificación de cada microorganismo, ver punto 4.3.3) se pueden utilizar como
referencia para los análisis microbiológicos, caso contrario, se debe realizar un nuevo repique a partir de las cepas de
reserva e investigar las causas que originaron tal desvío.

Tabla 1

Medio de Cultivo y Temperatura Tiempo de

Microorganismo
Características morfológicas de incubación incubación
Staphylococcus aureus ATCC 6538 TSA/Colonias pequeñas de color amarillo 32,5 +/- 2,5 °C 24 horas
TSA/Colonias grandes, cremosas,
Escherichia coli ATCC 8739 32,5 +/- 2,5 °C 24 horas
de color beige opaco
TSA/Colonias grandes, cremosas,
Salmonella typhimurium ATCC 14028 32,5 +/- 2,5 °C 24 - 48 horas
de color beige opaco
TSA/Colonias pequeñas, de color blanco
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 32,5 +/- 2,5 °C 24 - 48 horas
o beige opaco
TSA/Colonias pequeñas, de color blanco
Bacillus spizizzenii ATCC 6633 32,5 +/- 2,5 °C 24 - 48 horas
o beige opaco
SAB/Colonias medianas, circulares, de
Cándida albicans ATCC 10231 22,5 +/- 2,5 °C 5 – 7 días
aspecto mucoso y color blanco mate.
SAB/Micelio blanco que luego se torna de
Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 22,5 +/- 2,5 °C 5 – 7 días
color negro, de crecimiento invasivo.
SPS (anaerobiosis)/Colonias grandes de
Clorstridium sporógenes ATCC 19404 32,5 +/- 2,5 °C 24 - 48 horas
color negro.
TSA/Colonias pequeñas, de color blanco
Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953 55,0 +/- 5,0 ºC 24 – 48 horas
o beige opaco

4.3.2.2 Inocular 1 ml en 30 ml de medio de cultivo TSB e incubar por 24 a 48 hs a 32,5 +/- 2,5 ºC para bacterias, (en
anaerobiosis para C. Sporogenes) o 5 -7 días a 22,5ºC +/- 2,5 ºC para levaduras y mohos.
Observar si el medio presenta turbidez por crecimiento bacteriano, adicionar 3 ml de glicerol previamente
esterilizado en autoclave a 121 ºC durante 15 minutos, homogeneizar y fraccionar por 3 ml en 10 tubos previamente
esterilizados. Rotular con nombre y código del microorganismo, fecha de preparación y el texto “Cepa de trabajo”.
Conservar en freezer a temperaturas ≤ -15 ºC. Estas cepas así conservadas constituyen las cepas de trabajo del
laboratorio y se pueden utilizar en los ensayos del laboratorio de microbiología, siempre que cumplan con los
controles de viabilidad, pureza e identificación.
En caso de que no cumplan los controles, se reemplazarán por un nueva serie de tubos repicados a partir de la cepa
de reserva (*).
(*) IMPORTANTE: tener en cuenta el número de pasajes que declara la cepa de referencia ATCC adquirida. En
ningún caso se podrá realizar un número mayor a 5 pasajes o transferencias para una cepa determinada. Por ejemplo,
si la cepa ATCC adquirida declara 4 pasajes, solamente se podrá realizar un solo pasaje a partir de la cepa de reserva
para generar cepas de trabajo.

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4.3.3 Identificación de microorganismos:

– Inocular/repicar en los medios selectivos/diferenciales indicados para cada cepa con el fin de realizar los ensayos
de identificación, los cuales incluyen:
- Observación de características morfológicas típicas en medios selectivos/diferenciales.
- Tinción de Gram/Tinción de esporas con Verde de Malaquita / Azul de lactofenol
- Características bioquímicas.

4.3.3.1 - Staphylococcus aureus:

- Medio de cultivo M-SA: repicar una ansada estriando por agotamiento en una placa de Petri conteniendo 15 – 20
ml del medio previamente solidificado. Incubar la placa invertida a 32,5 +/- 2,5 °C durante 24 - 48 horas.
Observar la placa. Se debe apreciar crecimiento de colonias amarillas, rodeadas de una zona amarilla.

- Medio de cultivo CC-C para Prueba de Coagulasa: tomar una ansada de las colonias obtenidas en agar manitol
salado e inocular un tubo conteniendo 3 ml de medio de cultivo CCC. Incubar en baño de agua a 37,0 +/- 2,0 °C
durante 24 horas.
Transcurrido ese tiempo tomar 0,1 ml de dicho cultivo y transferir a tubos de vidrio estériles a los cuales se les
adicionó (posterior a la esterilización) 0,3 ml de plasma de conejo reconstituido. Mezclar suavemente e incubar en
baño de agua a 37,0 +/- 2,0 °C. Observar los tubos, a intervalos de una hora (sin agitar) para apreciar si hay
formación de grumos de coagulación. En caso de que no se aprecien grumos durante las primeras 6 horas, continuar
incubando hasta 24 horas para la conclusión final.
Se debe observar formación inmediata de grumos (pequeños a grandes) incluso coagulación completa del tubo.
Realizar en paralelo:
- Un Control Negativo: mezclar suavemente en un tubo de vidrio estéril 0,3 ml de Plasma de conejo reconstituido
con 0,1 ml de medio CC-C, pero éste último sin inocular (inocular en igual manera que con la cepa de
Staphylococcus aureus). No se debe apreciar la formación de grumos.
- Coloración de gram: tomar una ansada (en este caso se toma una ansada del cultivo realizado en pico de flauta, en
el punto 4.3.1.2 ó 4.3.2.1) y emulsionarla en una gota de agua purificada colocada en un portaobjetos limpio y
desengrasado. Secar la preparación colocando el portaobjetos en posición horizontal dentro de una estufa de cultivo
a 32,5 +/- 2,5 °C durante el tiempo necesario para que se evapore todo el líquido. Luego fijar pasando el lado
contrario al que contiene la preparación 3 veces sobre la llama del mechero.
Realizar la siguiente secuencia de coloración:
- Cubrir con Violeta para Gram la zona del portaobjetos que contiene la preparación. Dejar 20 segundos.
- Lavar con chorro fino de agua purificada durante 10 segundos.
- Cubrir con Lugol para mordentar. Dejar 30 segundos.
- Decolorar durante 10 segundos con un chorro fino de Decolorante.
- Lavar con chorro fino de agua purificada durante 10 segundos.
- Cubrir con Safranina. Dejar 20 segundos.
- Lavar con chorro fino de agua purificada durante 10 segundos.
- Secar el portaobjeto al aire o con ayuda de la llama del mechero.

Observar el preparado en el microscopio utilizando ocular de 10x y objetivo de 100x con aceite de inmersión
(colocar sobre el preparado un cubreobjeto).

Se debe observar Cocos gram (+) (color violeta) en grupos.

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4.3.3.2 - Escherichia coli

- Medio de cultivo MC-A: repicar una ansada estriando por agotamiento en una placa de Petri conteniendo 15 – 20
ml del medio de cultivo previamente solidificado. Incubar la placa invertida a 32,5 +/- 2,5 °C durante 48 - 72 horas.
Observar la placa. Se debe apreciar crecimiento de colonias grandes, de color rojo ladrillo (generalmente con halo
turbio de precipitación de bilis).

- Medio de cultivo LEV: repicar una ansada estriando por agotamiento en una placa de Petri conteniendo 15 – 20 ml
del medio de cultivo previamente solidificado. Incubar la placa invertida a 32,5 +/- 2,5 °C durante 24 horas.
Transcurrido ese tiempo examinar visualmente la placa. Se debe observar crecimiento de colonias de color verdoso,
con brillo metálico a la luz reflejada y centro negro-azulado a la luz transmitida.

- Pruebas IMVIC: tomar una ansada e inocular individualmente los siguientes medios:
1) 3 ml de medio de cultivo TSB: para realizar prueba de producción de Indol.
2) 3 ml de medio de cultivo MR-VPB: para realizar prueba de Rojo de Metilo.
3) 3 ml de medio de cultivo MR-VPB: para realizar prueba de producción de acetoína según Voges Proskauer.
4) 3 ml de medio CSA: solidificado en pico de flauta: por punción y estría para realizar prueba de Citrato.
Incubar a 32,5 +/- 2,5 ° C durante 48 – 72 horas y revelar/observar los tubos de la siguiente manera:
1) Indol: agregar 1 ml de Reactivo de Kovacs y observar luego de 10-15 minutos. Se considera prueba positiva la
aparición de una coloración rosada en la fase orgánica (extractiva). Prueba negativa: color sin cambios.
2) Rojo de Metilo: agregar 5 gotas de Solución de Rojo de Metilo, mezclar suavemente y observar luego de algunos
minutos. Se considera prueba positiva el viraje del indicador de anaranjado a rojo. Prueba negativa: color sin
cambios (coloración amarillo-anaranjada).
3) Voges Proskauer: agregar 1 ml de Reactivo de Barritt y 6 gotas de Hidróxido de potasio 40 %, mezclar
suavemente y observar luego de algunos minutos. Se considera prueba positiva la aparición de coloración roja.
Prueba negativa: color sin cambios.
4) Citrato: observar el tubo. Se considera prueba positiva el viraje del medio al color azul. Prueba negativa: color sin
cambios (medio de cultivo de color verde).
El resultado de las pruebas IMVIC debe ser el siguiente:
- Indol: positivo - Rojo de Metilo: positivo
- Voges Proskauer: negativo - Citrato: negativo

- Coloración de gram: proceder de igual manera que en Coloración de Gram para Staphylococcus aureus.
Se debe observar bacilos (o coco-bacilos) Gram (-) (color rosado).

4.3.3.3 - Salmonella

- Medio de cultivo XLD: repicar una ansada estriando por agotamiento en una placa de Petri conteniendo 15 – 20 ml
de medio de cultivo previamente solidificado. Incubar la placa invertida a 32,5 +/- 2,5 °C durante 48 horas. Observar
la placa. Se debe apreciar crecimiento de colonias bien desarrolladas, de color rojo, con centros negros.

- Medio de cultivo TSI: tomar una ansada y repicar por punción y estría en un tubo conteniendo 3 ml de medio de
cultivo solidificado en pico de flauta. Incubar a 32,5 +/- 2,5 °C durante 24 – 48 horas. Transcurrido ese tiempo
examinar visualmente los tubos en la punción del fondo y en la estría de la superficie.
El viraje del medio a color rojo indica alcalinidad (K), el viraje a color amarillo indica acidez (A). El medio sin
cambios permanece de color original amarillo-anaranjado (N). La producción de gas se manifiesta por presencia de
burbujas o corrimiento del agar (G+) y la producción de sulfuro de hidrógeno se evidencia por ennegrecimiento
(SH2+). Informar primero el resultado observado en la estría de la superficie, luego el de la punción del fondo,
posteriormente la producción de gas y por último la producción de sulfuro de hidrógeno.
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Ejemplo: K/A, G(+), SH2 (-) significa que hay alcalinidad en la estría de la superficie, acidez en la punción del
fondo, con producción de gas y sin producción de sulfuro de hidrógeno.
El resultado obtenido en medio TSI debe ser: K/A, G(-), SH2 (+)

- Coloración de gram: proceder de igual manera que en Coloración de Gram para Staphylococcus aureus.
Se debe observar bacilos Gram (-) (color rosado).

4.3.3.4 - Pseudomonas aeruginosa

- Medio de cultivo CA: repicar estriando por agotamiento en una placa de Petri conteniendo 15 – 20 ml de medio de
cultivo previamente solidificado. Incubar la placa invertida a 32,5 +/- 2,5 °C durante 48 - 72 horas.
Observar la placa. Se debe apreciar crecimiento de colonias generalmente de color verdoso, con fluorescencia
verdosa a la luz UV.

- Prueba de Oxidasa: utilizar un anza de platino (importante para evitar falsos positivos) para tomar una ansada (en
este caso se toma una ansada del cultivo realizado en medio de cultivo CA) y aplicar sobre la zona reactiva de la tira
para prueba de oxidasa. Frotar con ayuda del anza de inoculación y dejar actuar durante 60 segundos.
Se debe apreciar la aparición de un color azul o violeta-azulado.
Realizar en paralelo:
- Un Control Negativo: para ello impregnar una tira con un cultivo fresco de un microorganismo Oxidasa negativo
(por ejemplo Escherichia coli ATCC 8739). No se debe observar cambio de color.

- Prueba de Citrato: tomar una ansada y repicar por punción y estría en un tubo conteniendo medio de cultivo CS-A
solidificado en pico de flauta. Incubar a 32,5 +/- 2,5 °C durante 24 – 48 horas. Se considera prueba positiva: el viraje
del medio al color azul. Prueba negativa: color sin cambios (medio de cultivo color verde).
Nota: Se debe apreciar el viraje del medio al color azul.

d) Prueba de cultivo TSI: tomar una ansada y repicar por punción y estría en un tubo conteniendo medio de cultivo
TSI solidificado en pico de flauta. Incubar a 32,5 +/- 2,5 °C durante 24 - 48 horas. Transcurrido ese tiempo examinar
visualmente los tubos tanto en la punción del fondo como en la estría de la superficie. El viraje del medio a color
rojo indica alcalinidad (K), el viraje a color amarillo indica acidez (A). El medio sin cambios permanece de color
original amarillo-anaranjado (N). La producción de gas se manifiesta por presencia de burbujas o corrimiento del
agar (G+) y la producción de sulfuro de hidrógeno se evidencia por ennegrecimiento (SH 2+). Informar primero el
resultado observado en la estría de la superficie, luego el de la punción del fondo, posteriormente la producción de
gas y por último la producción de sulfuro de hidrógeno. Ejemplo: K/A, G(+), SH 2 (-) significa que hay alcalinidad
en la estría de la superficie, acidez en la punción del fondo, con producción de gas y sin producción de sulfuro de
hidrógeno.
El resultado obtenido en medio TSI debe ser: K/K, G(-), SH2 (-)

- Coloración de gram: proceder de igual manera que en Coloración de Gram para Staphylococcus aureus.
Se debe observar bacilos Gram (-) (color rosado).

4.3.3.5 - Bacillus spizizzenii

- Coloración de gram: realizar la coloración procediendo de igual manera que en Coloración de Gram para
Staphylococcus aureus.
Se debe observar bacilos (diplobacilos) largos, rectos Gram (+) (color violeta).

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- Tinción de esporas con Verde de Malaquita: inocular una anzada de la cepa de reserva en un tubo conteniendo 3 ml
de medio de cultivo TSB adicionado con 0,02 % de Sulfato de manganeso p.a. Incubar a 32,5 +/- 2,5 ºC durante 5
días. Homogeneizar y tomar una anzada del cultivo y colocarla en un portaobjetos limpio y desengrasado. Secar la
preparación colocando el portaobjetos en posición horizontal dentro de una estufa de cultivo a 32,5 +/- 2,5 °C
durante el tiempo necesario para que se evapore todo el líquido. Luego fijar pasando el lado contrario al que
contiene la preparación 3 veces sobre la llama del mechero.
Cubrir la zona donde se encuentra el frotis con una solución acuosa de Verde de Malaquita al 5 % (*). Tomar el
portaobjetos con una pinza metálica y colocar sobre la llama del mechero durante 5 minutos (moviendo
continuamente y tratando de que no hierva el preparado, ni se evapore todo el líquido). Dejar enfriar y lavar con un
chorro fino de agua purificada hasta que no desprenda más colorante.
Colocar unas gotas de solución acuosa de Safranina al 0,5 % (**). Dejar actuar durante 1 minuto y lavar el exceso de
colorante con un chorro fino de agua purificada.
Dejar secar la preparación y observar en el microscopio utilizando ocular de 10x y objetivo de 100x con aceite de
inmersión, colocando previamente un cubreobjeto.
Se deben observar bacilos (diplobacilos) largos, rectos, teñidos de color rosado, algunos con presencia de endospora
teñida de color verde, de forma elipsoidal en posición central o subterminal, sin deformación de la célula.

(*) Preparación de Verde de Malaquita 5 %:

En un vaso de precipitado de 50 ml pesar 500,0 +/- 10,0 mg de Verde de malaquita p.a. y agregar 10 ml de agua
purificada. Agitar hasta disolución y filtrar a través de un papel de filtro de filtración media-rápida (banda blanca de
S&S o similar), recogiendo todo el filtrado en un erlenmeyer. Conservar en frasco color ámbar y a temperatura
ambiente, vida útil de 12 meses.

(**) Preparación de Safranina 0,5 %:

En un vaso de precipitado de 250 ml pesar 500,0 +/- 10,0 mg de Safranina p.a. y agregar 100 ml de agua purificada.
Agitar hasta disolución. Conservar en frasco gotero a temperatura ambiente, vida útil de 12 meses.

4.3.3.6 - Cándida albicans

- Coloración de gram: realizar la coloración procediendo de igual manera que en Coloración de Gram para
Staphylococcus aureus.
Se deben observar células esféricas Gram positivas (color violeta), algunas con presencia de gemación.

- Formación de tubos de germinación: colocar 0,5 ml de medio de cultivo TSB en un tubo de ensayo estéril. Tomar
una ansada de la cepa de reserva y emulsionarla en el medio de cultivo. Incubar durante 2 horas en baño de agua a
37 +/- 2 ºC. Transcurrido ese tiempo tomar una ansada del cultivo y colocarla en el centro de un portaobjetos limpio
y desengrasado. Cubrir con cubreobjetos y observar en el microscopio utilizando ocular de 10x y objetivo de 100x
con aceite de inmersión.
Se deben observar células esféricas, algunas con presencia de tubos de germinación los cuales se aprecian como una
proyección filamentosa larga y delgada, que no presenta estrangulamiento en el punto de origen.

- Formación de clamidoconidias y pseudomicelios: colocar en una placa de petri una varilla de vidrio doblada en V
previamente esterilizada y depositar sobre ella un portaobjetos limpio y previamente flameado en mechero. Colocar
sobre el mismo 4 ml de Agar Harina de maíz (*) y dejar solidificar. Utilizando un anza aguja tomar una ansada (en
este caso se toma una ansada del cultivo realizado en pico de flauta, en el 4.3.1.2 ó 4.3.2.1) y trazar una línea en la
zona central del portaobjeto, cortando el agar. Colocar dentro de la placa de petri, teniendo en cuenta de no tocar el
portaobjeto, un algodón embebido con agua purificada, para mantener la humedad del medio de cultivo.

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Incubar a 22,5 +/- 2,5 ºC durante 72 horas. Cubrir con un cubreobjeto la línea de desarrollo cercana a los extremos y
observar al microscopio utilizando ocular de 10x y objetivo de 100x con aceite de inmersión. Para poder observar
más claramente se puede agregar una gota de Azul de lactofenol (ver preparación en punto 4.3.3.6).
Se debe observar presencia de clamidoconidias como estructuras terminales o intercalares redondas, refringentes y
de pared engrosada. El pseudomicelio se debe observar como hifas hialinas, tabicadas y ramificadas, uniendo las
clamidoconidias.

(*) Preparación de Agar Harina de maíz:

En un erlenmeyer de 500 ml pesar 40,0 +/- 0,1 g de Harina de maíz y agregar 250 ml de agua purificada. Colocar en
baño de agua a 60 +/- 5 ºC durante 30 minutos con agitación frecuente. Filtrar en un embudo, a través de una capa
de algodón, recogiendo todo el filtrado en un erlenmeyer.
Por otro lado, en un erlenmeyer de 1000 ml, pesar 20,0 +/- 0,1 g de Agar-Agar y agregar 650 ml de agua purificada.
Dejar reposar 5 minutos y luego llevar a baño de agua a ebullición hasta que quede transparente.
Mezclar ambas preparaciones, agregar 10 ml de Tween 80 y llevar a 1000 ml con agua purificada. Homogenizar,
fraccionar en tubos x 4 ml y esterilizar en autoclave a 121 º C durante 15 minutos.

4.3.3.7 - Aspergillus brasiliensis

- Tinción con Azul de lactofenol: tomar una ansada (en este caso se toma una ansada del cultivo realizado en pico de
flauta, en el 4.3.1.2 ó 4.3.2.1) y emulsionarla en una gota de agua purificada colocada en un portaobjetos limpio y
desengrasado. Agregar una gota de Azul de lactofenol (*) y cubrir con un cubreobjetos Observar el preparado en el
microscopio utilizando ocular de 10x y objetivo de 40x u objetivo de 100x (este último con aceite de inmersión).

Se deben observar hifas tabicadas, hialinas y ramificadas; con presencia de conidióforos formados por un estipe de
gran tamaño, no tabicado y de paredes gruesas y por una vesícula globosa. De cada fialide se forman cadenas de
conidios abundantes, pequeños y de color negro. A veces las vesículas de los conidióforos no se pueden observar por
la gran abundancia de conidios.

(*) Preparación de Azul de lactofenol:

En un erlenmeyer de 250 ml pesar 20,0 +/- 0,1 g Fenol cristalizado p.a., agregar 20 ml de Ácido láctico p.a., 40 ml
de Glicerina p.a. y 20 ml de agua purificada. Calentar suavemente hasta disolución total del Fenol. Dejar enfriar,
agregar 100 +/- 10 mg de Azul de metileno p.a. y homogeneizar. Conservar en frasco gotero a temperatura ambiente,
vida útil de 12 meses.

4.3.3.8 - Geobacillus stearothermophilus

- Coloración de gram: realizar la coloración procediendo de igual manera que en Coloración de Gram para
Staphylococcus aureus.
Se debe observar bacilos largos, rectos Gram (+) (color violeta).

- Tinción de esporas con Verde de Malaquita: tomar una ansada (en este caso se toma una ansada del cultivo
realizado en pico de flauta, en el 4.3.1.2 ó 4.3.2.1) y emulsionarla en una gota de agua purificada colocada en un
portaobjetos limpio y desengrasado. Secar la preparación colocando el portaobjetos en posición horizontal dentro de
una estufa de cultivo a 32,5 +/- 2,5 °C durante el tiempo necesario para que se evapore todo el líquido. Luego fijar
pasando el lado contrario al que contiene la preparación 3 veces sobre la llama del mechero.
Realizar la tinción procediendo de igual manera que en Tinción de Esporas con Verde de Malaquita en Bacillus
spizizzenii.
Se deben observar bacilos largos, rectos, teñidos de color rosado, algunos con presencia de endospora teñida de
color verde, de forma elipsoidal en posición terminal, sin deformación de la célula.

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TITULO: CEPARIO DEPTO: CONTROL DE CALIDAD FECHA: 15/05/2017
PON N: CC-010-6 Próxima revisión: 05/2019

4.3.3.9 – Clostridium sporógenes

- Coloración de gram: realizar la coloración procediendo de igual manera que en Coloración de Gram para
Staphylococcus aureus.

Se deben observar bacilos (diplobacilos) cortos, rectos Gram (+) (color violeta).

- Tinción de esporas con Verde de Malaquita: tomar una ansada (en este caso se toma una ansada del cultivo
realizado en pico de flauta, en el punto 4.3.2.1) y emulsionarla en una gota de agua purificada colocada en un
portaobjetos limpio y desengrasado. Secar la preparación colocando el portaobjetos en posición horizontal dentro de
una estufa de cultivo a 32,5 +/- 2,5 °C durante el tiempo necesario para que se evapore todo el líquido. Luego fijar
pasando el lado contrario al que contiene la preparación 3 veces sobre la llama del mechero.
Realizar la tinción procediendo de igual manera que en Tinción de Esporas con Verde de Malaquita en Bacillus
spizizzenii.

Se deben observar bacilos (diplobacilos) cortos, rectos teñidos de color rosado, algunos con presencia de endoespora
teñida de color verde, de forma oval en posición central o subterminal, con leve distención de la célula.

5.- ANEXOS

- Anexo I: Listado de cepas de referencia.

- Anexo II: Control de Viabilidad, Pureza e Identificación de cepas.
- Anexo III: Planilla para registro de repique de cepas de trabajo.
- Anexo IV: Diagramas de flujo de Pruebas de Identificación.

Cada vez que ingresan al laboratorio cepas de referencia se actualiza la planilla que figura como Anexo I. La misma
se coloca en un lugar visible en el laboratorio de microbiología.
Cada vez que se realiza un repique para obtener cepas de trabajo se completa a través de un programa informático la
planilla que figura como Anexo III, la misma se asienta luego en el cuaderno de microbiología.
Al realizar el control de las cepas se completa la planilla que figura como Anexo II (“Control de Viabilidad, Pureza e
Identificación de cepas”). Una vez finalizado el control, la misma se archiva en la carpeta correspondiente (control
de cepario).

6.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Disposición ANMAT N° 2819/04 (FE – 001).

Farmacopea Argentina 7 edición (FE – 004).
USP 35 (FE – 005)
Disposición ANMAT N° 7667/10 (FE – 025).

7.- HISTORIAL DE ACTUALIZACIÓN DEL DOCUMENTO

Revisión del Revisión del PON

PON sobre la generada a partir
Cambios realizados
que se realiza el del cambio
cambio
Agregado de dos ítems:
Referencias bibliográficas e historial de actualización.
5 Agregado de la cepa de Clostridium Sporógenes. 6
Agregado de conservación para cepas de segundo pasaje en
cryoviales
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