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INSTRUCCIONES DE USO

MEDIOS EN PLACA LISTOS


PARA USAR
PA-254035.05

Rev.: Sep 2011

BD Mueller Hinton Chocolate Agar


USO PREVISTO
BD Mueller Hinton Chocolate Agar (agar chocolate Mueller Hilton) se utiliza para el
aislamiento y cultivo de bacterias exigentes a partir de muestras clnicas. Tambin se puede
utilizar para las pruebas de sensibilidad de Neisseria gonorrhoeae.

PRINCIPIOS Y EXPLICACION DEL PROCEDIMIENTO


Mtodo microbiolgico.
Dado que los laboratorios de microbiologa clnica utilizaban a principios de los aos 60 una
amplia variedad de procedimientos para determinar la sensibilidad de bacterias a antibiticos y
otros agentes quimioteraputicos, Bauer, Kirby y otros desarrollaron un procedimiento
estandarizado en el que se seleccion como medio de prueba el agar Mueller Hinton, un
medio originalmente diseado para el aislamiento de gonococos1-4. Un estudio colectivo
internacional posterior confirm el valor del agar Mueller Hinton Agar para este propsito por la
reproducibilidad relativamente buena del medio, la sencillez de su frmula y la riqueza de los
datos experimentales que haban sido acumulados utilizando este medio5.
Segn CLSI, el medio recomendado para la prueba de sensibilidad de difusin en disco de
Streptococcus pneumoniae es el agar Mueller Hinton con 5% de sangre de carnero. El medio
recomendado para Haemophilus influenzae es el agar de medio de prueba Haemophilus
(HTM). Los criterios de interpretacin se proporcionan en CLSI Document M100 (M2), que se
incluye con CLSI Document M2, Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility
Tests, 7th ed.; Approved Standard6. El medio recomendado para Neisseria gonorrhoeae es
agar GC con un suplemento de crecimiento definido. Segn otros datos, el agar Mueller Hinton
con hemina e Iso-VitaleX puede utilizarse para las pruebas de sensibilidad sistemtica de N.
gonorrhoeae ante penicilina y estroptomicina.7
El agar Mueller Hinton Agar, cuando se suplementa con sangre calentada o hemoglobina y
factores de crecimiento (por ejemplo, BD IsoVitaleX) se ha recomendado como medio no
selectivo para el aislamiento de Neisseria y Haemophilus8.
En BD Mueller Hinton Chocolate Agar, el extracto de carne bovina y peptona de casena
proporcionan los nutrientes. El almidn absorbe los compuestos txicos tales como los cidos
grasos procedentes de las torundas de algodn. La hemoglobina proporciona el factor X. BD
IsoVitaleX suministra vitaminas y factores de crecimiento, incluido el factor V (NAD) que es
necesario para el crecimiento de Haemophilus influenzae.

REACTIVOS
BD Mueller Hinton Chocolate Agar
Frmula* por litro de agua purificada
Extracto de carne bovina
2,0 g
Hidrolizado cido de casena
17,5
Almidn
1,5
Hemoglobina
10,0
10,0 mL
IsoVitaleX
Agar
17,0 g
pH 7,3 0,2
* Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento.

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BD IsoVitalex Enrichment contiene los siguientes factores de crecimiento (frmula* por litro de
agua purificada):
Vitamina B 12
L-glutamina
Adenina
Clorhidrato de guanina
cido p-aminobenzoico
Nicotinamida adenina dinucletido (NAD)
Pirofosfato de tiamina
Nitrato frrico
Clorhidrato de tiamina
Hidrocloruro de cistena
L-cistina
Glucosa

0,01 g
10,0
1,0
0,03
0,013
0,25
0,1
0,02
0,003
25,9
1,1
100,0

* Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento.

PRECAUCIONES
. Solamente para uso profesional.

No utilizar las placas si muestran evidencia de contaminacin microbiana, decoloracin,


deshidratacin, agrietamiento o cualquier otro signo de deterioro. La reduccin excesiva de este
medio debido a la deshidratacin puede causar resultados de sensibilidad falsos.
Consultar los procedimientos de manipulacin asptica, riesgos bilogicos y desecho del
producto usado en el documento INSTRUCCIONES GENERALES DE USO.

ALMACENAMIENTO Y VIDA UTIL


Al recibir las placas, almacenarlas en un lugar oscuro a una temperatura entre 2 y 8 C,
envueltas en su envase original, hasta justo antes de usarlas. Evitar la congelacin y el
calentamiento excesivo. Las placas pueden inocularse hasta su fecha de caducidad (ver la
etiqueta en el paquete) e incubarse durante los perodos de incubacin recomendados.
Las placas de grupos de 10 placas ya abiertos pueden usarse durante una semana siempre que
se almacenen en un lugar limpio a una temperatura entre 2 y 8 C.

CONTROL DE CALIDAD DEL USUARIO


Inocular muestras representativas con las cepas siguientes (para obtener los detalles, vase el
documento INSTRUCCIONES GENERALES DE USO). Incubar las placas a una temperatura
de 35 2 C en una atmsfera aerobia con dixido de carbono. Efectuar lectura de las placas
despus de 18 24 h y 42 48 h de incubacin.
Cepas
Resultados del crecimiento
Haemophilus influenzae ATCC 10211
Crecimiento de bueno a excelente
Neisseria gonorrhoeae ATCC 43069
Crecimiento de aceptable a excelente
Neisseria meningitidis ATCC 13090
Crecimiento de bueno a excelente
Streptococcus pneumoniae ATCC 6305
Crecimiento de bueno a excelente
Sin inocular
Marrn chocolate, opaco,
posiblemente poco homogneo
Para inoculacin e incubacin de pruebas de sensibilidad, vase Procedimiento de anlisis.
Cepa de prueba
Disco de prueba de
Tamao de
zona* (mm)
sensibilidad
Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226
Penicilina P-10
33 40
Estreptomicina SPT-100
25 31
* Tamaos de zona basados en resultados de al menos 3 lotes diferentes de BD Mueller Hinton
Chocolate Agar

PROCEDIMIENTO
Materiales suministrados
BD Mueller Hinton Chocolate Agar (placas Stacker de 90 mm). Controladas
microbiolgicamente.
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Materiales no suministrados
Medios de cultivo auxiliar, reactivos y equipo de laboratorio que se requiera.
Tipos de muestras
BD Mueller Hinton Chocolate Agar se puede utilizar para todo tipo de muestras clnicas
potencialmente infectadas con organismos exigentes, en especial (pero no exclusivamente) las
muestras de zonas corporales esencialmente estriles (por ejemplo, lquido cefalorraqudeo,
abscesos) y como medio de subcultivo de hemocultivos. Se utiliza principalmente para el
aislamiento no selectivo de Neisseria, Haemophilus y otras bacterias que pueden no crecer en
los medios de agar sangre utilizados normalmente, tal como el agar Columbia con sangre de
carnero al 5%. (Vase tambin CARACTERISTICAS DE RENDIMIENTO Y LIMITACIONES
DEL PROCEDIMIENTO).
El uso de este medio para pruebas de sensibilidad sistemticas de Neissseria gonorrhoeae con
penicilina G y estreptomicina requiere el uso de cultivos puros. No inocular la muestra para
realizar pruebas de sensibilidad directas!
Recogida y transporte de las muestras
Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis, Haemophilus y otros organismos exigentes son
sensibles a las condiciones ambientales adversas. Por consiguiente, se deben utilizar medios
de transporte adecuados para todas las muestras. Las muestras deben ser enviadas al
laboratorio tan pronto como sea posible y no deben transcurrir ms de 24 horas, incluso si se
utilizan medios de transporte. La temperatura de transporte ptima es de 20 25 C. No
refrigerar!9,10
Procedimiento de anlisis
Para el aislamiento de organismos exigentes, extender las muestras tan pronto como se reciban
en el laboratorio. La placa de extensin se utiliza principalmente para aislar cultivos puros de las
muestras que contienen flora mixta.
Si, por el contrario, el material se cultiva directamente empleando una torunda, hacerla girar en
una seccin pequea cercana al borde, extendiendo luego para hacer el aislamiento a partir de
esta rea inoculada.
Si la muestra se ha obtenido de una zona corporal con flora normal, tambin debe inocularse en
los medios selectivos adecuados, segn el agente patgeno que se desee aislar. Para
Neisseria gonorrhoeae, se debe incluir una placa BD Martin-Lewis Agar, modified o BD GCLect Agar y, para Haemophilus, una placa BD Chocolate Agar with IsoVitaleX and
Bacitracin.
Incubar las placas a una temperatura de 35 2 C en una atmsfera aerobia con dixido de
carbono. Efectuar lectura de las placas despus de 18 24 h y 42 48 h de incubacin.
Para pruebas de sensibilidad sistemticas de N. gonorrhoeae, el aislado, que debe ser un
cultivo puro, se suspende en BD Trypticase Soy Broth para lograr el equivalente del patrn de
turbidez 0,5 de McFarland. En un plazo de 15 min despus de ajustar la turbidez del inculo,
sumergir una torunda estril en el inculo diluido correctamente y hacerla rodar con firmeza
varias veces contra la pared interna superior del tubo para exprimir el exceso de lquido.
Inocular toda la superficie del agar de la placa tres veces, girando la placa 60 grados cada vez
para obtener una inoculacin uniforme.
Aplicar los discos mediante un dispensador de discos antimicrobianos, empleando precauciones
aspticas. Depositar los discos de modo que los centros queden a no menos de 24 mm de
distancia. Es preferible depositar los discos de penicilina de manera que no queden a menos de
10 mm del borde de la placa de Petri. Una vez colocados los discos sobre el agar, presionarlos
con una aguja o pinza estril hasta obtener un contacto completo con el medio. Este paso no es
necesario si los discos se colocan con el dispensador de autoapisonamiento de 6 u 8 posiciones
BD Sensi-Disc.
15 minutos o menos despus de aplicar los discos, invertir las placas e incubarlas en una
atmsfera aerobia enriquecida con dixido de carbono al 5% a 35 37 C durante
20 24 horas.

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Resultados
Morfologa tpica de colonias en BD Mueller Hinton Chocolate Agar:
Haemophilus influenzae
Neisseria gonorrhoeae
Neisseria meningitidis
Streptococcus pneumoniae

Pequeas, hmedas, nacaradas con un olor de "ratn"


caracterstico
Pequeas, de color blanco grisceo a incoloro, mucoides
Medianas a grandes, gris azulado, mucoides
Colonias pequeas, planas o ms grandes, mucoides
verdosas, las colonias circundantes pueden ser verdosas

Pruebas de sensibilidad: Se debe efectuar la lectura de las zonas desde la parte superior de la
placa. La sensibilidad a la penicilina debe confirmarse con una prueba de beta-lactamasa, por
ej., la prueba BD Cefinase.

CARACTERISTICAS DE RENDIMIENTO Y LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO


BD Mueller Hinton Chocolate Agar es un medio no selectivo enriquecido en el que crecen
bacterias exigentes y no exigentes, incluida la flora normal. Por consiguiente, se recomienda
inocular las muestras tambin en medios selectivos adecuados.
El trmino bacterias exigentes se refiere a las bacterias que no crecen o no crecen bien en los
medios de aislamiento primario utilizados normalmente con sangre de carnero: por ej.,
Haemophilus, Neisseria patgena y muchos otros organismos. Consultar las referencias para
obtener las descripciones detalladas acerca del tipo de muestras que deben inocularse en este
medio y el tipo de organismos para los que se utiliza este medio para aislamiento10,11.
No se ha probado si este medio favorece el crecimiento de estreptococos con variaciones en la
nutricin.
Son muy elevados el nmero y los tipos de especies bacterianas que se comportan como
agentes infecciosos. Por consiguiente, antes de utilizar sistemticamente este medio para
microorganismos aislados con poca frecuencia o descubiertos recientemente, primero debe
probarse su idoneidad para lograr cultivos puros del organismo en cuestin.
Los tamaos de zona de sensibilidad encontrados en este medio no presentan una plena
concordancia con las mencionadas en CLSI Standard M26 reseadas con el uso de agar
chocolate GC con un suplemento de crecimiento definido.

REFERENCIAS
1. Bauer, A.W., W.M.M. Kirby, J.C. Sherris, and M. Turck. 1966. Antibiotic susceptibility
testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45: 493-496.
2. Ryan, K.J., F.D. Schoenknecht, and W.M.M. Kirby. 1970. Disc sensitivity testing. Hospital
Practice 5:91-100.
3. Mueller, J.H., and J. Hinton. 1941. A protein-free medium for primary isolation of the
gonococcus and meningococcus. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 48: 330-333.
4. Barry, A.L., F. Garcia, and L.D. Thrupp. 1970. An improved single-disk method for testing
the antibiotic susceptibility of rapidly-growing pathogens. Am. J. Clin. Pathol. 53: 149-158.
5. Ericsson, H.M., and J.C. Sherris. 1971. Antibiotic sensitivity testing. Report of an
international collaborative study. Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sec. B, Suppl. 217.
6. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Approved standard: M2.
Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, PA,
USA.Search for latest version at www.clsi.org
7. Berger, U. 1992. Neisseriaceae. In: Mikrobiologische Diagnostik (F. Burkhardt, ed.). Thieme
Verlag, Stuttgart, Germany.
8. Nash, P., and M.M. Krenz. Culture media. In: Manual of clinical microbiology, (Balows, A., et
al., eds.). 5th edition. American Society for Microbiology, Washington, D.C., USA.
9. Miller, J.M., and H.T. Holmes. 1995. Specimen collection, transport, and storage. In: Murray,
P. R., E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. C. Tenover, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical
microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

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10. Forbes, B.A., and P.A. Granato. 1995. Processing specimens for bacteria. In: P.R. Murray,
E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical
microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.
11. P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.). 1995. Manual of
clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

ENVASE/DISPONIBILIDAD
BD Mueller Hinton Chocolate Agar
N de cat. 254035
Medios en placa listos para usar, 20 placas
N de cat. 254082
Medios en placa listos para usar, 120 placas

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