2.2.

1 TÉCNICAS EN EL ESTUDIO HISTOPATOLÓGICO EN LAS AUTOPSIAS

MÉDICO – LEGALES

La histología se define como el estudio de los cambios microscópicos en los

tejidos como resultado de una lesión o enfermedad, mientras que la
histopatología forense es la disciplina encargada del análisis microscópico
de los tejidos extraídos a través de la autopsia. Este estudio es posterior a
la observación física que realiza el médico forense con el fin de validar,
modificar o rechazar lo examinado anteriormente.

La autopsia se realiza en muertes naturales y no naturales (violentas), en el

primer caso no suelen existir signos de la causa de muerte, por lo cual este
procedimiento significa la única manera para establecerla; esto sucede es la
muerte súbita y algunas de sus causas son: infarto de miocardio;
inflamación del corazón (miocarditis); expansiones anómalas localizadas en
vasos sanguíneos que se rompen, provocando hemorragias graves
(aneurismas rotos), la mayoría en cerebro, de origen congénito o
asteroesclerótico; tumor en glándula suprarrenal que produce sustancias
que generan aumentos repentinos de la presión arterial (feocromocitoma);
inhalación de alimentos mientras se duerme, la alimentacion o la ingesta de
bebidas alcohólicas (broncoaspiración de alimentos), entre otros. Por otro
lado, en las muertes violentas es indispensable identificar presencia o no de
reacción vital para poder determinar el instante en el cual se ha hecho el
daño, determinar el tiempo de supervivencia y en caso de múltiples lesiones
se debe especificar si tienen la misma data o no; lo mencionado
anteriormente constituyen puntos clave en la investigación médico legal.

El análisis de la vitalidad de las lesiones y su desarrollo implica

simplemente el análisis inicial y el avance de la evolución inflamatoria y
reparativa. En este contexto, es fundamental tener en cuenta que la
inflamación representa la respuesta de la defensa de un tejido
vascularizado frente a un ataque patógeno, manifestándose a través de la
presencia de sustancias inflamatorias y la migración de líquido y células
desde el sistema circulatorio hacia el tejido extravascular. Esta reacción
tiene como objetivo localizar y descartar células alteradas, partículas
extrañas, microorganismos y antígenos, al mismo tiempo que comienzan la
evolución de la reparación. En definitiva, la inflamación aguda constituye la
primera y rápida respuesta a una lesión, con la finalidad de proporcionar
glóbulos blancos y proteínas plasmáticas al sitio inflamatorio y es
caracterizado por 2 eventos, el primero de índole vascular y el segundo de
tipo celular.

2.2.1.1 Cambios vasculares

La fase inicial experimenta una constricción temporal de los vasos

seguida de una dilatación de las arteriolas, lo cual conduce a un
incremento en la circulación sanguínea del área lesionada.
Posteriormente, se observa un incremento en la permeabilidad de la
microvasculatura, provocando alteraciones en las presiones y
liberación de agua e iones fuera de los vasos sanguíneos, dando
lugar al edema. Este fenómeno contribuye al incremento en la
acumulación de componentes celulares en la sangre, aumentando
su viscosidad y disminuyendo su fluidez. Estas variaciones se
aprecian en el microscopio al ver numerosos vasos pequeños
dilatados llenos de eritrocitos, conocido como estasis.

Al mismo tiempo la estasis facilita la interacción entre numerosos

leucocitos, especialmente neutrófilos, con la pared del endotelio
vascular, este proceso se ha denominado marginación. El
incremento de la capacidad de paso en los vasos sanguíneos
emerge como la principal característica en el inicio de la
inflamación, permitiendo el abandono del líquido edematoso y
células inflamatorias, lo cual constituye el 1er signo histológico
relevante (1).

2.2.1.2 Fenómenos celulares

El incremento de la permeabilidad facilita la acumulación de
leucocitos en la periferia del vaso, un fenómeno conocido como
marginación, seguido de un desplazamiento en la superficie del
endotelio denominado rodamiento. Continúa la colaboración de
moléculas de adhesión endotelial, lo que permite que los leucocitos
se unan a la mencionada área antes de desplazarse a través de las
células y traspasar la membrana basal hacia el espacio fuera de los
vasos sanguíneos, en un proceso llamado diapédesis, el cual
ocurre especialmente en las vénulas postcapilares de la circulación
sistémica. Después de abandonar la circulación vascular, los
leucocitos siguen un gradiente químico generado por transmisores
inflamatorios presentes en el área lesionada, en un proceso
conocido como quimiotaxis(1).

Leucocitos de cualquier tipo tiene la capacidad de salir del torrente

sanguíneo y los primeros en hacerlo son los neutrófilos, mientras
que los glóbulos blancos activados son los encargados de la
eliminación de microorganismos y células necróticas mediante
fagocitosis, la acción de enzimas lisosómicas y la generación de
combustión oxidativa. Después de 24 a 72 horas los
polimorfonucleares perecen mediante la apoptosis, dando paso a la
aparición de macrófagos y linfocitos, los cuales tienen mayor vida
media y pueden estar más tiempo en el foco de la inflamación.

Es evidente que la aparición de leucocitos debe buscarse

inicialmente alrededor de las vénulas poscapilares. La presencia de
polimorfonucleares infiltrandose en los tejidos se considera el signo
histológico más temprano y relevante. La aparición del infiltrado
inflamatorio puede variar según diferentes criterios diagnósticos,
desde visualizar 3 o 4 polimorfonucleares de gran tamaño fuera del
vaso en el campo microscópico, observado en 2 secciones
 diferentes del tejido analizado, hasta la presencia individual de
estas células en el espacio extravascular.

En cuanto a los tiempos de aparición de los leucocitos, se han

propuesto diversos esquemas cronológicos que describen los
cambios histológicos en la reparación de tejidos. Sin embargo, la
precocidad de la reacción leucocitaria varía en función de los
estudios, oscilando entre 10 minutos y 24 horas. Se destaca que el
tiempo de presentación de los leucocitos están significativamente
retrasados en quemaduras debido a la lesión endotelial causada
por el calor y el frío (1).

En relación con los macrófagos, su presencia se inicia

aproximadamente a los 3 días de evolución del daño, pero la
determinación de su tiempo de permanencia en el foco inflamatorio
es más desafiante y depende de diversos factores, como la salud
previa del individuo, el tipo y la dimensión de la lesión. Los
macrófagos tienen la capacidad de albergar residuos celulares,
grasas (lipófagos), hemosiderina o hematoidina.

2.2.1.3 Angiogénesis: Formación del tejido de granulación

Cuando se ha eliminado el tejido muerto en los extremos de la

región, se inicia la replicación de fibroblastos y yemas vasculares,
dando lugar al tejido de granulación. Este tejido es fácilmente
identificable mediante estudios microscópicos y proporciona la base
sobre la cual se desarrollará la cicatriz reparativa. La observación
de estas yemas suele comenzar alrededor del día 6, siendo más
notorias entre el día 8 y 10. Los factores de crecimiento y las
proteínas de la matriz extracelular actúan como mediadores y
estimuladores en este proceso.

El principal impulsor en la neovascularización y de la creación del

tejido de granulación es el factor de crecimiento endotelial vascular
 (VEGF), bFGF, PDGF y TGF-β; con el tiempo, la densidad del tejido
conjuntivo laxo aumenta, mientras que la cantidad de luces
vasculares disminuye (1).

2.2.1.4 Fibrosis: Formación de la cicatriz

Los vasos nuevos, junto con el incremento de la permeabilidad

capilar y la presencia de fibrina, facilitan la llegada de proteínas
plasmáticas como el fibrinógeno, lo cual facilita la migración y
proliferación de fibroblastos, las células fundamentales del tejido
conjuntivo que constituyen una parte integral del tejido de
granulación esencial para la sanación de la lesión. Otras moléculas
involucradas son las células endoteliales, las células madre
mesenquimales presentes en la capa adventicia de vénulas, venas
y los pericitos (1).

Inicialmente, los fibroblastos poseen una actividad fagocítica pero

su finalidad es la síntesis de los componentes de la matriz
extracelular. En las etapas iniciales (entre el día 4 y 6), presentan
un citoplasma abundante y mayor basofilia debido al aumento en la
síntesis de proteínas, implicando un incremento en el retículo
endoplásmico rugoso. La matriz extracelular inicialmente contiene
abundantes fibras de reticulina y fibronectina, que son cruciales
para la adhesión de los fibroblastos. Sin embargo, la síntesis se
vuelve fundamentalmente de fibras de colágeno, confiriendo
resistencia al tejido conjuntivo neoformado, este proceso alcanza su
punto máximo entre los días 5 y 15 y persiste por periodos. Así
mismo, las fibras colágenas visibles por ese momento, tienen una
apariencia ondulada y fusiforme; la resistencia significativa de este
tejido cicatricial se debe a la elaboración de colágeno y las
modificaciones en su estructura que se producen después de
finalizada su síntesis, en la cual intervienen los factores de
crecimiento como PDGF, FGF, TGF-β y las citocinas IL-1 e IL-4.
 Finalmente, el tejido se remodela a lo largo de una fase que se
extiende durante un tiempo prolongado, aquí los fibroblastos
maduros adquieren una morfología fusiforme, incrementan las
conexiones entre las fibrillas de colágeno, mientras que la
colagenasa elimina el exceso de colageno, los capilares empiezan
a eliminarse y se reduce la celularidad. La evolución del nuevo
tejido también necesita la desintegración de la matriz extracelular
mediante las metaloproteinasas, enzimas producidas por células
inflamatorias, fibroblastos y células epiteliales. Una vez que
cumplen su función, estas enzimas son bloqueadas por inhibidores
tisulares específicos (1).

En una perspectiva histopatológica, se observa cómo los vasos

neoformados y las células inflamatorias desaparecen
progresivamente, dejando una amplia área de tejido conjuntivo
denso. En el momento en que la cicatrización se completa, resulta
totalmente imposible establecer la fecha precisa de la lesión, que
podría tener meses o años de antigüedad.

2.2.1.5 Tinciones

En cuanto a la histoquímica, la tinción fundamental para visualizar

los hallazgos histológicos vinculados a la inflamación es la H-E,
para mejor distinción de componentes del tejido conectivo, se
emplean otras tinciones.

2.2.1.6 Inflamación crónica

En el análisis histopatológico de casos donde el proceso

inflamatorio/reparativo transcurre sin complicaciones, se observan
todos los aspectos descritos anteriormente. Sin embargo, si surgen
complejidades y el procedimiento de reparación se vuelve más
lento, se manifiesta la inflamación de larga duración; en este
escenario se encuentran simultáneamente un infiltrado inflamatorio
 linfoplasmocitario y formación de tejido conjuntivo (fibrosis). Es
fundamental destacar que, cuando se presenta un cuadro de
inflamación crónica, no es posible determinar la fecha precisa de la
lesión.

2.2.1.7 Procesos que alteran la curación y la reparación de las lesiones

Los lapsos de tiempo estimados para la inflamación y reparación se

han establecido mayormente en individuos saludables cuando se
trata de inflamación crónica, sin embargo, existen numerosas
situaciones que alteran el proceso de recuperación de las lesiones,
como la edad, la desnutrición, la diabetes, la administración de
corticoides u otros inhibidores de la respuesta inmunitaria, todos
estos tienen un impacto significativo en la desaceleración de la
inflamación y la restauración de las lesiones. Así mismo esta
desaceleración se observa en individuos bajo tratamiento de
anticoagulantes porque el incremento del sangrado en una herida
ocasiona un retraso en el procedimiento de reparación.

2.2.1.8 Técnica histológica

Recolección del material: Se lleva a cabo mediante biopsia,

necropsia o autopsia.

- Biopsia: Implica la extracción del fragmento de tejido del

organismo vivo.

- Necropsia: Se refiere a la obtención de material de un cadáver.

- Autopsia: Se define como un estudio completo, examinador y

metodico, a nivel macroscópico y microscópico de los órganos,
aparatos y sistemas de un cuerpo y su finalidad es establecer las
causas de la muerte.

2.2.1.8.1 Fijación:
 Después de obtener el material, ya sea mediante los
procedimientos mencionados, se procede a su fijación
para prevenir la lisis celular. Este procedimiento mantiene
los esquemas orgánicos en una fase cercana a la que
tenían en vida, siendo este uno de sus objetivos junto a
impedir la lisis celular y la reproducción bacteriana y
conferir firmeza al tejido o material. Teniendo fijadores
físicos, químicos, mezclas fijadoras y relación del volumen
del tejido con el volumen del fijador.

2.2.1.8.2 Deshidratación:

La muestra se coloca en alcoholes de concentración

creciente con el fin de eliminar el agua, porque la parafina
no se mezcla con ella. Se emplea etanol al 70%, 80%,
96% y 100%.

2.2.1.8.3 Aclaración:

Se emplean disolventes proporcionan transparencia a los

tejidos y solubilizan la parafina; los solventes pueden serl
xilol, toluol, acetona y benceno, siendo el xilol el más
comúnmente utilizado.

2.2.1.8.4 Inclusión en parafina:

La parafina se calienta en una estufa a temperaturas

superiores a su punto de fusión, posteriormente la muestra
se introduce en la parafina, se traslada a la estufa por
unos minutos para que esta penetre en los tejidos y
después se enfría rápidamente sumergiendo el recipiente
en hielo (2).

2.2.1.8.5 Preparación del taco:

 Un fragmento de parafina con la muestra se divide,
dándole forma de pirámide truncada, de manera que la
base más pequeña se adhiere a un pequeño taco de
madera que funcionará como soporte en el micrótomo.

2.2.1.8.6 Corte:

Se hace a través del micrótomo de congelación que

simplifica la tarea de cortar el tejido después de haberlo
fijado mediante la congelación. El tejido se congela
utilizando dióxido de carbono para endurecerlo antes de
cortarlo. Este método rápido se utiliza para el diagnóstico
de biopsias obtenidas durante procedimientos quirúrgicos
y permite que el cirujano actúe de acuerdo con el informe
obtenido. También es eficaz en tejido nervioso y para
visualizar lípidos. Los micrótomos para cortar en parafina
pueden ser de deslizamiento, donde la cuchilla es movible
y el tejido inmovil, y de tipo Minot, donde el tejido se
mueve y la cuchilla permanece fija. El grosor de los cortes
puede variar de 4 a 100 mm o incluso más, dependiendo
de los tejidos a estudiar (2)..

2.2.1.8.7 Colocación sobre portaobjetos:

Una vez hechos los cortes se sumergen en agua tibia para

expandirse y luego se recogen con un pincel para
extenderlos en el portaobjetos. Después que se secan se
realiza el proceso de coloración.

2.2.1.8.8 Desparafinización:

Es necesario eliminar completamente la parafina del tejido

y proceder a aclararlo de nuevo, utilizando xilol.

2.2.1.8.9 Hidratación:
 Se lleva a cabo la hidratación del tejido porque los
colorantes tienen base acuosa. El portaobjetos se
sumerge en soluciones de etanol con volúmenes
descendentes, que van desde etanol al 100%, 96%, 80%,
70% hasta agua destilada.

2.2.1.8.10 Coloración:

Se trata de un proceso físico-químico completo que

colorea los tejidos por períodos largos. Las partículas de
colorantes constan de un cromóforo que proporciona el
color y un auxocromo que lo fija. Los colorantes se
clasifican en básicos, ácidos y neutros. Ejemplos comunes
son la hematoxilina y eosina, así como el azul de
metileno.

2.2.1.8.11 Deshidratación:

Para la preparación de preparados a largo plazo, el

material se sumerge en soluciones de etanol con rango
creciente (70%, 80%, 96%, 100%).

2.2.1.8.12 Aclaración:

Se emplea xilol o benzol para diluir la resina adhesiva

utilizada para fijar el cubreobjetos.

2.2.1.8.13 Colocación de cubreobjeto:

Se coloca un vidrio delgado encima del corte, el cual se

aferra con resina (bálsamo de Canadá), permitiendo su
largo uso.

REFERENCIAS
1. Cabrerizo, Villanueva, Salguero. Estudio hitopatologico de la evolución
temporal de las lesiones. Cuad Med Forense [Internet]. 2017 [citado 13
diciembre 2023]. Disponible en:
file:///C:/Users/Windows/Downloads/Estudio%20histopatol%C3%B3gico
%20de%20la%20evoluci%C3%B3n.pdf
2. Técnica histológica UNSJ [Internet]. [citado 13 diciembre 2023]. Disponible
en: http://dea.unsj.edu.ar/biologia1/th.pdf