TECNOLOGO EN BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

PRODUCCIÓN VEGETAL IN VITRO

Sistema Nacional de Aprendizaje

Área de Producción Vegetal In Vitro
Tecnólogo en Agro Biotecnología

APRENDIZ

DANIEL LOZADA CASTRO

INSTRUCTORA

SANDRA LILIANA LERMA BOCANEGRA

PRODUCCIÓN VEGETAL IN VITRO

LABORATORIO DE OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS

SEGUNDO TRIMESTRE

2828298

2024

Página 1
 TECNOLOGO EN BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
PRODUCCIÓN VEGETAL IN VITRO

1. TEMA DE LA PRÁCTICA: Identificación de microorganismos

2. INTRODUCCIÓN

Los microorganismos, aunque no son visibles a escala normal, desempeñan un papel

fundamental en el funcionamiento cotidiano de la vida como la conocemos, ejerciendo
labores particulares que permiten mediante distintos procesos metabólicos, ayudarnos a
facilitar tareas y es por ello, que prima su identificación oportuna, mediante
caracterizaciones taxonómicas para categorizar dichos microorganismos en función de
sus características macroscópicas, microscópicas, metabolismos, relaciones enzimáticas
y desempeño con el medio donde proliferan, que suele ser regularmente, todo en cuanto
vemos y tocamos, salvo que dicho lugar amerite, de un control estricto visto que se
desarrollen actividades donde los preceptos fundamentales del lugar impliquen
coeficientes, estériles, higiénicos, desinfectantes y de limpieza constante.
Algunos de estos lugares, suelen ser complejos cerrados donde se ejercen tareas
específicas de productividad de una persona jurídica pública o privada donde no puede
haber interrupción microbiana puesto que ello implicaría variaciones negativas en el
coeficiente de calidad de dicha actividad.
Para la identificación de especies, subespecies, familias y géneros se emplean
actualmente distintas técnicas y cada variante de las técnicas fluctúa según sea el
objetivo con el cual haya que identificar el organismo.
Es por ello, que netamente para la observación de microorganismos de esta especie,
utilizaremos tinciones que ayuden a determinar la Gram positividad o Gram negatividad
del mismo, además de su forma y su orden.

Página 2
 TECNOLOGO EN BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
PRODUCCIÓN VEGETAL IN VITRO

3. OBJETIVO GENERAL

Emplear correctas técnicas de tinción química para visualizar e identificar

microorganismos.

4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

A. Comprender los fundamentos, utilidades y funciones de la tinción.

B. Ejercer procesos y protocolos correctos de tinción según el microorganismo.
C. Identificar adecuadamente microorganismos.

Página 3
 TECNOLOGO EN BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
PRODUCCIÓN VEGETAL IN VITRO

5. MATERIALES, MÉTODOS Y REACTIVOS

Materiales Inorgánicos:

 Microscopio
 Mechero
 Portaobjetos
 Cubreobjetos
 Asa de siembra
 Piseta
 Servilletas
 Pinzas
 Embudo

Materiales Orgánicos:

 Yogurt
 Cultivo bacteriano
 Cultivo fúngico

Reactivos:

 Azul de metileno
 Azul algodón de Lactofenol
 Cristal violeta
 Fuscina
 Colorante lugol
 Alcohol antiséptico
 Alcohol acetona
 Agua destilada

Página 4
 TECNOLOGO EN BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
PRODUCCIÓN VEGETAL IN VITRO

6. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Para el día 21 de febrero se llevó a cabo el laboratorio de identificación de
microorganismos mediante técnicas de tinción con el objetivo de interiorizar las
técnicas y protocolos de las mismas para optimizar la realización de las mismas e
identificar correctamente el tipo de microorganismo que se está analizando.
Para ello, se inició con la explicación de la práctica, detallando que se analizarían
unidades bacterianas de yogurt, de un cultivo bacteriano y por otro lado,
estructuras fúngicas provenientes de un cultivo de hongo.
En primer lugar, y antes de iniciar con el montaje de las muestras, se procedió a
desinfectar superficies y microscopio con alcohol antiséptico. A continuación se
prepararon los mecheros con alcohol etílico empleando un embudo para verter la
sustancia en el interior del mechero, y posicionando una cuerda de alto perímetro
para acoplarla a la boca del mechero.
Con esto preparado, se dispensó el yogurt sobre una placa de Petri de ancha
circunferencia, donde cada aprendíz tomó la muestra que considerase para
realizar el frotis inicial sobre el que llevaría a cabo el protocolo de tinción.
Visto que el yogurt empleado contiene como mínimo, dos tipos de bacterias como
lo son los Lactobacillus y los Streptoccocus, se debía de llevar a cabo un proceso
de tinción de Gram, donde pudiésemos visualizar en efecto, dichas bacterias. Sin
embargo, por orden de la instructora, se nos recomendó obstruir el protocolo,
omitiendo todos los pasos salvo la fijación del frotis. Es por esto que, y a orden
directa, únicamente se le aplicó a la muestra mediante goteo, azul de metileno
durante un tiempo total de diez minutos. Pasados los diez minutos, se lavó
ligeramente la muestra con agua destilada empleando piseta. Como si fuera
precepto general, la mayoría de las muestras preparadas, no evidenció
microorganismo, puesto que la tinción había supuesto un fracaso.
Para la preparación de la siguiente muestra, se empleó un cultivo bacteriano
generado a partir del montaje de un cultivo de material vegetal que sucumbió ante
la proliferación y crecimiento no controlado de dichas bacterias.
Al tratarse de bacterias, se empleó la tinción de gram, donde durante todo el
proceso, se evidenció finalmente la multiplicidad de colonias de bacilos gram
negativos, anchos y acumulados.
Para la preparación de la siguiente muestra, se empleó un cultivo de hongos
filamentosos, donde antes de utilizarse la técnica de tinción simple usando azul
de algodón de lactófenol obteniendo resultados bastante gráficos y específicos, se
obtuvo parte del hongo con un poco de cinta para ser dispuesta en el porta y
realizar el protocolo descrito.
Por último, luego de haber realizado todas las tinciones respectivas y haber
recolectado las evidencias suficientes, se limpió el área de trabajo, desinfectando
superficies y microscopios por igual con alcohol y por último hipoclorito de sodio
sin disolver.
De esta manera concluyó el laboratorio establecido para el día 21 de febrero.

Página 5
 TECNOLOGO EN BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
PRODUCCIÓN VEGETAL IN VITRO

7. EVIDENCIA Y RESULTADOS

A) YOGURT

Muestra de yogurt diluido en agua y sometido a fijación de frotis y tinción con azul de
metileno durante diez minutos con lavado de agua destilada por piseta al final del
procedimiento sin someterse a secado previo ni posterior. Se observa acumulación
sostenida de la muestra mediante el microscopio y se concluye que la muestra es una
acumulación excesiva y que por ello, no hay mínimas tonalidad de azul en toda la
muestra.

Algunas ubicaciones de la muestra

presentan áreas que sí pudieron
retener parte del tinte, y son estas
zonas minúsculas sobre las que se
determina poner aceite de inmersión
para verificar el orden y la categoría de
los microorganismos presentes.

Página 6
 TECNOLOGO EN BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
PRODUCCIÓN VEGETAL IN VITRO

En una escala de 100X y empleando aceite de inmersión, se pueden observar una serie
de agrupaciones traslúcidas pero rodeadas perfectamente de un tono azul, estas
estructuras circulares parecen ser a simple vista Staphyloccocus, puesto que se trata de
cocos que conforman grupos espontáneos sin formar series lineales, sino series grupales.
Así mismo se puede visualizar cocos dispersos de dichas series grupales.

Página 7
 TECNOLOGO EN BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
PRODUCCIÓN VEGETAL IN VITRO

B) CULTIVO BACTERIANO

Para la preparación de esta muestra, se debió realizar

una tinción de Gram visto la necesidad que presenta.
Se trata de un cultivo de organismos bacterianos, que
necesita ser diferenciado según la cantidad de
peptidoglucano vigente en su pared celular.

En la presente muestra, se puede observar la fijación

del frotis y como la muestra presenta un color a
simple vista, tan oscuro y degradado con unas
aperturas espontáneas unas de diámetro más
profundo que otras. El tono supone que la muestra, al
ser secada por última vez para ser observada a
microscopio, debió de someterse a un calor
ligeramente intenso.

A escala de 100X y empleando aceite de inmersión, se

puede denotar, en primer lugar, una tonalidad rojiza
bastante bien interiorizada por las células en su
estructura. En segundo lugar, no presentan una serie
lineal, sino simplemente series de agrupamiento, a
este tipo de agrupamiento se le denominada
empalizada, y caracteriza por los agrupamiento tan
notorios y evidentes. Por otro lado, se vuelve a
percibir una serie de vacíos que se encuentran
espontáneamente en medio de todas las
agrupaciones.

Página 8
TECNOLOGO EN BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
PRODUCCIÓN VEGETAL IN VITRO

Página 9
 TECNOLOGO EN BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
PRODUCCIÓN VEGETAL IN VITRO

HONGO FILAMENTOSO

Para la preparación de la siguiente muestra, se tomó imprenta de una parte del hongo
filamentoso, de manera tal que con cinta adhesiva, se obtiene parte de las hifas externas que se
presentan en la parte más superior del organismo, para luego ser puestas en porta con una o dos
gotas de azul de algodón. Lo que se puede verificar en las imágenes, son las hifas y algunos
círculos marrones, además de bastantes y demasiados residuos, que dejan de serlo en tanto
acercamos más el microscopio.

Se puede observar la hifa y dos estructuras

circulares, una traslúcida, y otra marrón. Por un
lado, la traslúcida es indicativo probablemente
de la formación de un esporangio, que se haya
teñido con el azul indica que se encuentra en un
estado de desarrollo de inmadurez. Por otro
lado, vemos una estructura marrón, la cual a
simple vista podríamos considerar que se trata
de un esporangio ya madurado y de éste,
emergiendo multiplicidad de esporas.

Página 10
 TECNOLOGO EN BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
PRODUCCIÓN VEGETAL IN VITRO

Sin embargo, hay que hacer una serie de observaciones para diferencias correctamente la
morfología de estas estructuras y poder hacer un correcto análisis.

Por un lado tenemos una estructura esferoide traslúcida, de la cual emerge otra estructura
esferoide no traslucida, sino marrón que a su vez, emite agrupaciones significativas de esporas. La
estructura esferoide traslucida, implica la existencia de un esporangio, que al sr teñido por el azul
de algodón, podemos argüir que trata de un esporangio inmaduro, empero hay varios
inconvenientes, ¿es factible que una estructura contenedora de esporas como lo es el esporangio,
pueda generar esporas?, ¿Puede emerger un esporangio a partir de otro esporangio? Y aún más,
¿puede hacerlo mientras el esporangio primordial se halla en estado de inmadurez? Suena, a
priori, como algo incompatible y por supuesto, incoherente.

En primer lugar, debemos aclarar que es naturalmente posible, y es común en los hongos
zigomicetos, cuyas hifas contienen distintos esporangios a lo largo de sus hifas, puedan presentar
estas anomalías. De hecho, no solo es posible que pueda emerger un esporangio a partir de un
esporangio primordial en un zigomiceto, sino que a su vez, en el momento en el que un
esporangio libera esporas, puede liberar esporangióforos, que son prolongaciones de una hifa con
un esporangio en su extremo. Sin embargo, el esporangio que vemos que emerge a partir de un
esporangio maduro, no es un esporangio, sino por otro lado, una columela.

La columela, es simplemente una parte del esporangio que se desarrolla en su interior y que
eventualmente se exterioriza cada vez más hacia afuera, llenándose más y más de esporas.

Por otro lado, suena poco coherente pensar que una columela puede exteriorizarse hasta esparcir
las esporas cuando el esporangio es inmaduro, y esto se puede deber a varios factores. El primero,
puede involucrar una anomalía o variabilidad genética, donde al igual que otros organismos,
pueda tener una serie de características poco usuales a nivel genético – molecular que le permitan
a la espora generar partes de estructura interna para esparcir conidios sin siquiera haber llegado a
maduración. El segundo factor tiene que ver más con el hecho de que es posible que su
metabolismo sea acelerado por los nutrientes y las condiciones que le proporciona el sustrato en
el que se encuentra, de manera que esto termina en un desarrollo temprano de conidios, en
tercer lugar puede darse una estructura incompleta donde a pesar de que dicha columela
contenga esporas, otras partes del esporangio no estén completamente desarrolladas puesto que
su maduración implica procesos más complejos y en cuarto lugar, puede deberse a una
adaptabilidad del organismo por intentar adaptarse al medio en el que se encuentra.

Página 11
TECNOLOGO EN BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
PRODUCCIÓN VEGETAL IN VITRO

Página 12
 TECNOLOGO EN BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
PRODUCCIÓN VEGETAL IN VITRO

Podemos observar hifas de este hongo zigomiceto y a esta vista, una pincelada de su
composición. A diferencia de la mayoría de los hongos, que tienen quitina como su principal
polisacárido estructural, los zigomicetos sintetizan quitosano, que es el homopolímero
desacetilado de la quitina. El quitosano está compuesto por unidades de N-acetil glucosamina.

Además, las hifas de los zigomicetos son coenocíticas, lo que significa que no están divididas por
septos en la mayoría de las áreas. Solo forman septos donde se producen gametos o para aislar las
hifas muertas. Estas hifas coenocíticas permiten un flujo continuo de citoplasma y núcleos a lo
largo de la estructura.

Página 13
 TECNOLOGO EN BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
PRODUCCIÓN VEGETAL IN VITRO

8. CONCLUSIÓN
Las tinciones en el área científica de la microbiología o la biotecnología, desempeñan un
papel crucial en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades infecciosas y patologías
asociadas a organismos vegetales igual de infecciosos.
Considero que la vitalidad genuina de todo esto, recae en una serie de caracteres bien
específicos.

Detección temprana: Las tinciones permiten visualizar los microorganismos en medios

especializados, como agentes químicos para teñir tejidos celulares, lo que facilita la
identificación rápida de patógenos de carácter vegetal. Por ejemplo, la tinción de Gram es
esencial para evaluar muestras bacteriológicas y determinar si se trata de bacterias Gram
positivas o Gram negativas según su capa lipídica o el diámetro de su pared de
peptidoglucano.

Identificación precisa: Las tinciones resaltan estructuras específicas dentro de los

microorganismos, como la pared celular, el núcleo o las cápsulas, lo que ayuda a
diferenciar entre diferentes tipos de bacterias, hongos, levaduras y virus
.
Selección de tratamiento: Conocer la naturaleza de los microorganismos presentes en una
muestra es crucial para elegir el tratamiento adecuado empleando antibióticos óptimos
que nos permitan garantizar una seguridad más sustancial en nuestros medios de cultivo.
En esto hallamos la tinción de azul de lactofenol que identifica componentes estructurales
de los hongos.

Investigación científica: Las tinciones son herramientas esenciales en la investigación

microbiológica. Ayudandonos a estudiar la morfología, la distribución y la patogenicidad
de los microorganismos, lo que contribuye al avance del conocimiento científico y a que
demos tratamientos adecuados según la naturaleza del microorganismo.

En conclusión, prima, dentro de nuestra ciencia, interiorizar protoclos de tinción

correctamente para dar diagnósticos precisos, tratamiento puntuales y comprensiones
profundas de microorganismos que pueden interferir en nuestros procesos de producción,
o que así mismo, pueden ser altamente benefactores en los mismos procesos.

Página 14
 TECNOLOGO EN BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
PRODUCCIÓN VEGETAL IN VITRO

9. BIBLIOGRAFÍAS

 https://www.medigraphic.com/cgi-bin/new/publicaciones.cgi?IDREVISTA=279
 https://quimica.unam.mx/
 https://docenciamicrobiologia.umh.es/indice-de-practicas/8-observacion-
microscopica/tinciones-para-hongos/
 https://www.cib.csic.es/es/departamentos/biologia-celular-y-molecular

Página 15