CÓDIGO:

CL-DOC-FT-010
FECHA:
FORMATO GUÍA DE PRÁCTICA DE 2020/07/27
LABORATORIOS VERSIÓN:03

PÁGINA 1 DE 8

Información general
Laboratorio Ciencias Básicas
Asignatura Bioquímica de los alimentos
Programa Ingeniería de alimentos
Docente Dubán González Álvarez
Nombre de Determinación de la actividad antioxidante Código
la práctica Capacidad de Absorción de Radicales de Oxígeno de la
(ORAC) en bebidas. práctica

1. DEFINICIÓN

En general, miden la inhibición de la oxidación inducida por radicales peróxilo y reflejan

un mecanismo clásico de actividad mediada por antioxidantes terminadores de cadena
mediante TAH (Ou, Hampsch-woodill, & Prior, 2001).

1.1 OBJETIVO

Determinar la capacidad antioxidante de granos de cacao y manteca de cacao sin

fermentar, fermentado y seco mediante la capacidad de absorción de radicales de
oxígeno.

1.2 ALCANCE

Este procedimiento se podrá utilizar para determinar la capacidad antioxidante de

cualquier extracto vegetal, así como también muestras de alimentarias como granos de
cacao sin transformar, fermentado y seco.

2. NOTAS DE CAMBIO

No aplica para la primera versión

3. RESPONSABILIDAD

3.1 La responsabilidad de administrar y controlar el presente documento es del

Representante del líder de grupo de investigación para el SGC.
3.2 Las actividades descritas en este documento deben ser implementadas por el
personal del grupo que realice dicha actividad.

4. GLOSARIO Y SIGLAS

 Fluorescencia: las moléculas tienen diferentes estados llamados niveles de

energía. La espectrometría de fluorescencia se refiere principalmente a estados
vibracionales y electrónicos. En general, las especies objeto de examen tendrán
un estado electrónico basal (un estado de baja energía) de interés, y un estado
electrónico excitado de mayor energía. Dentro de cada uno de estos estados
electrónicos hay diferentes estados vibracionales. En la espectroscopia de
fluorescencia, primero se excita la muestra mediante la absorción de un fotón de
luz, desde su estado electrónico basal a uno de los distintos estados vibracionales
del estado electrónico excitado. Las colisiones con otras moléculas causan que la
molécula excitada pierda energía vibracional hasta que alcanza el estado
vibracional más bajo del estado electrónico excitado. La molécula desciende luego
a uno de los distintos niveles de vibración del estado electrónico basal, emitiendo
un fotón en el proceso. Como las moléculas pueden caer a cualquiera de los
diferentes niveles de vibración en el estado basal, los fotones emitidos tendrán
diferentes energías y, por lo tanto, frecuencias. Así pues, mediante el análisis de
las diferentes frecuencias de luz emitida por espectrometría de fluorescencia,
junto con sus intensidades relativas, se puede determinar la estructura de los
diferentes niveles de vibración (Perez, s.f.).
 Antioxidantes: Halliwel y Gutteridge (1998) definieron como antioxidante a toda
sustancia que hallándose presente a bajas concentraciones, con respecto a las
de un sustrato oxidable (biomolécula), retarda o previene la oxidación de dicho
sustrato.
El antioxidante al reaccionar con el RL le cede un electrón oxidándose a su vez y
transformándose en un RL débil, con escasos o nulos efectos tóxicos y que en
algunos casos como la vitamina E, pueden regenerarse a su forma primitiva por
la acción de otros antioxidantes. Tienen diferentes mecanismos de acción; unos
impiden la formación de los RL y/o especies reactivas (sistema de prevención),
otros inhiben la acción de los RL (sistema barredor) y otros favorecen la reparación
y la reconstitución de las estructuras biológicas dañadas (sistema de reparación).
Cada antioxidante posee una afinidad hacia un determinado RL o hacia varios,
puede actuar en los diferentes procesos de la secuencia oxidativa y tener más de
un mecanismo de acción.(Criado Dabrowska & Moya Mir, 2009)

 TROLOX: es un análogo hidrosoluble del alfa-tocoferol. En virtud de su alta

solubilidad en agua y su amplia disponibilidad comercial, el Trolox es
universalmente empleado como estándar en las curvas de comparación de
diversos ensayos de actividad antioxidante (como ORAC, TEAC).
 AUC: Área de fluorescencia bajo la curva.
 AAPH: 2,2`-azobis (2-amidinopropane) dihidro-clorido
 Na2HPO4.12H2O: Fosfato de sodio dodecahidratado
 NaH2PO4.2H2O: Fosfato de sodio dihidratado
5. CONTENIDO

5.1 GENERALIDADES

Estos métodos están basados en los trabajos de Wayner (Wayner, Burton, Ingold, &
Locke, 1985) y Glazer (Glazer, 1988) y perfeccionados por Cao (Cao, Sofic, & Prior,
1997).
Como se muestra en la Ecuación 1, el radical peróxilo es generado de una fuente como
AAPH (2,2’-azobis (2-amidinopropano) dihidrocloruro), el cual sufre una descomposición
térmica para producir nitrógeno molecular y radicales alquilo, que en presencia de
oxígeno generarán radicales peróxilo, los cuales reaccionan con una sonda coloreada o
fluorescente para formar un producto incoloro o no fluorescente, como se muestra en la
Ecuación 2.
𝑂2
𝑅 − 𝑁 = 𝑁 − 𝑅 → 𝑁2 + 2𝑅𝑂𝑂. (Ec. 1)

𝑅𝑂𝑂. + 𝑠𝑜𝑛𝑑𝑎 𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑐𝑒𝑛𝑡𝑒 → 𝑅𝑂𝑂𝐻 + 𝑝é𝑟𝑑𝑖𝑑𝑎 𝑑𝑒 𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑐𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 (Ec. 2)

La capacidad antioxidante es determinada por la disminución en la velocidad de

degradación de la sonda debido a la reacción de los radicales peróxilo con el antioxidante
para generar un producto no radicalario, como se muestra en la Ecuación 3.

𝑅𝑂𝑂. + 𝐴𝐻 → 𝑅𝑂𝑂𝐻 + 𝐴.
𝑅𝑂𝑂. + 𝐴. → 𝑅𝑂𝑂𝐻 + 𝐴𝐻 (Ec. 3)

En ORAC, generalmente se utiliza fluoresceína como sonda y la reacción suele llevarse

por extensos períodos de tiempo (>30 min) para garantizar la estabilización de la
reacción. Como se muestra en la Figura 1, los cálculos para expresar los resultados se
obtienen de la integración del Área Bajo la Curva (ABC) de decaimiento de fluorescencia
calculando el valor de la Ecuación 4:

ABC neta = ABC con antioxidante – ABC sin antioxidante (Ec. 4)

Figura 1. Curva de decaimiento de la fluoresceína por oxidación con radicales peroxil en un típico ensayo
ORAC donde se observa el efecto de un antioxidante (muestra) visto como el aumento en el Área Bajo la
Curva (ABC) de decaimiento de fluorescencia.
Se obtiene así información con respecto a parámetros cinéticos como tiempo de
inducción y velocidad inicial en un solo parámetro. Generalmente, el resultado se expresa
en términos de equivalencia de Trolox (análogo de vitamina E), para lo cual se construye
una curva con diferentes concentración y las respectivas ABC de Trolox, que genera una
curva de calibración que permite interpolar el ABC de la muestra y expresar su capacidad
antioxidante en términos de cantidad equivalente a Trolox (Londoño, 2012).

6. DESCRIPCIÓN

6.1 PRINCIPIO DEL MÉTODO

Determinar de la capacidad antioxidante en una muestra de bebidas determinadas.

6.2 CONDICIONES GENERALES

El método permite determinar los moles equivalentes de Trolox en un rango de 10 a 600

µg/mL, en donde el analito utilizado como referencia tiene un comportamiento lineal. Si
las muestras lo requieren deberán ser diluidas para alcanzar una concentración que se
encuentre en el rango establecido.

6.3 EQUIPOS, REACTIVOS, MATERIALES Y ELEMENTOS DE PROTECCIÓN

6.3.1 Equipos

 Espectrofotómetro
 Centrífuga con sistema de refrigeración
 Balanza analítica
 Vórtex
 Baño de ultrasonido
 Rotaevaporador

6.3.2 Reactivos

 Agua destilada
 Na2HPO4.12H2O
 NaH2PO4.2H2O
 Solución buffer de Fosfato 10mM
 Fluoresceína 1μM
 Solución de AAPH 250mM
 Trolox
 Agua ultrapura

6.3.3 Materiales

 Balones volumétricos
 Beakers
 Pipetas, micropipetas y puntas
 Microplaca Costar
 Tubos de reacción de 2 mL (Ephendorf)
  Tubos de ensayo de vidrio de 10 mL y 20 mL
 Soporte para tubos de ensayo

6.3.4 Elementos de protección

 Bata de laboratorio: Para proteger de cualquier daño que puedan hacer las
sustancias químicas a la ropa o a las personas y evitar contaminaciones
microbianas
 Guantes de nitrito: Evitar el contacto directo con sustancias y/o reactivos que
puedan causar daños en la piel del analista de laboratorio.
 Careta de protección: Impedir la inhalación de vapores o gases peligrosos
derivados de los reactivos utilizados.

6.3.5 Puntos de control

El análisis se debe realizar a temperatura ambiente y las muestras deben ser protegidas
de la luz y almacenadas a -20ºC luego de su preparación.

7. DESARROLLO DEL MÉTODO

7.1 PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

Realizar preparación de las muestras según las indicaciones del empaque. Luego
realizar diluciones 1:10, 1:100, 1:1000 en tubos eppendorf.

7.2 PREPARACIÓN DE REACTIVOS

7.2.1 Solución buffer de Fosfato 10Mm

 Pesar 2,1918 g de Na2HPO4.12H2O y 0,5354 g de NaH2PO4.H2O.
 Aforar en un balón volumétrico de 1000 mL.

7.2.2 Fluoresceína 1μM

 Preparar inicialmente una solución de fluoresceína a 1 mM, para esto se debe
pesar 3,76 mg de Fluoresceína y se lleva a volumen con la solución buffer de
fosfato pH 7.4 en un balón volumétrico de 10 mL (si es necesario calentar a una
temperatura no mayor a 35°C).
 Hacer la dilución a 1 μM según la cantidad que sea requerida para realizar el
ensayo.

7.2.3 Solución de AAPH 250mM

 Pesar 678 mg y llevar a volumen con solución buffer de fosfato en un balón
volumétrico de 10 mL.
En la Tabla 1 se resume las cantidades de cada reactivo necesario para la
preparación de las soluciones antes descritas.
Tabla 1. Resumen de las cantidades a emplear para la preparación de las soluciones

Cantidad de Cantidad de
Na2HPO4.12H2O (g) Na2HPO4.2H2O (g) H2O destilada (g) Observaciones
Buffer fosfato 10
mM
Para una solución de 100 mL
0,276 0,035 99,689 aforar con agua destilada
Cantidad de Fluoresceína
Buffer fosfato 10 mM (g) Observaciones
(mg)
Solución madre de Para una solución de 10 mL aforar un balón
Fluoresceína 1 mM volumétrico con buffer fosfato 10 mM. Calentar hasta
3,76 9,99624
máximo 50 °C si es necesario para disolver
completamente
Cantidad a preparar (mL) Cantidad de solución
Buffer fosfato 10 mM
madre de Fluoresceína Observaciones
(uL)
1 mM (μL)
2 0,002 1,999998 Aforar en balón volumétrico
de 2 mL
5 0,005 4,999995 Aforar en balón volumétrico
de 5 mL
Solución madre de 10 0,01 9,999990 Aforar en balón volumétrico
Fluoresceína 1 μM de 10 mL
25 0,025 24,999975 Aforar en balón volumétrico
de 25 mL
50 0,05 49,999950 Aforar en balón volumétrico
de 5 mL
100 0,1 99,999900 Aforar en balón volumétrico
de 100 mL
Cantidad de 2,2’-azobis(2-
amidino-propane)
Solución de AAPH Buffer fosfato 10 mM (g) Observaciones
dihydrochloride (APPH)
250 mM
(mg)
678 9,322 Aforar en un balón volumétrico de 10 mL

7.3 PREPARACIÓN DE DILUCIONES

 Pesar exactamente 5 mg de Trolox

 Solubilizarlos completamente en la solución buffer de fosfato para Orac hidrofílico
y en ciclodextrina para Orac lipofílico.
 Aforar a un volumen de 10 mL, de esta manera se obtiene una solución a 2000
μM, según la Tabla 2.

Tabla 2. Cantidades requeridas para la preparación de la solución madre de trolox 2000 µM

10 g de Buffer fosfato
Solución madre de Trolox Trolox (mg) Observaciones
mM o Ciclodextrina
2000 μM Aforar en un balón
5 9,995 volumétrico de 10 mL

 Sonicar la solución 5 segundos para diluir más fácilmente.

 A partir de la solución anterior hacer las diluciones respectivas para preparar una
curva de Trolox de 5,10,25,50,100,150,200 μM, utilizando la solución buffer de
fosfato para Orac hidrofílico. De acuerdo como se describe en la Tabla 3:

7.3.1 Preparación de la microplaca (ensayo espectrofotométrico)

Adicionar en estricto orden los siguientes componentes: 150 μL de fluoresceína a

cada pozo seguido a esto 25 μL de buffer fosfato (B) para Orac hidrofílico y
ciclodextrina para Orac lipofílico, 25 μL de dilución respectiva de Trolox
(5,10,25,50,100,150,200 μM) 25 μL muestra (M).
Tabla 3. Ubicación de las diferentes concentraciones de los estándares de la curva de calibración y muestras en el
espectrofotómetro de fluorescencia.

 Preincubar durante 30 min a 37°C.

 Adicionar a cada pozo 25 μL de solución de AAPH 250mM (Figura 2).

Figura 2. Disposición de los estándares y muestras en el pozo del espectrofotómetro de fluorescencia

 Realizar mediciones por triplicado según el manejo del espectrofotómetro de

fluorescencia (Anexo 2).
 La intensidad de la fluorescencia es medida cada 2 min durante 2 horas con
longitud de onda de excitación y emisión de 485 y 520 nm respectivamente.
 La obtención de los datos se detalla en el Anexo 3.

7.4 CÁLCULO Y REPORTE DE RESULTADOS

La protección del antioxidante se mide a partir del área de fluorescencia bajo la curva
(AUC) de la muestra en comparación con la AUC del blanco, donde el antioxidante no
está presente. La AUC se calcula mediante la Ecuación 5:

𝑓
𝐴𝑈𝐶 = (0,5 + (∑𝑖=31 𝑖
𝑖=1 𝑓 )) 𝑥𝐶𝑇 (Ec. 5)
1

Donde:
I: número de ciclos
F: unidades de fluorescencia
CT: tiempo de cada ciclo en minutos. En este caso, CT=2
La capacidad de absorción de los radicales de oxíno está determinada por la Ecuación
6.
𝐴𝐵𝐶 [𝑇𝑟𝑜𝑙𝑜𝑥]
𝑂𝑅𝐴𝐶 = 𝐴𝐵𝐶 𝐴𝐻 𝑥 [𝐴𝐻] (Ec. 6)
𝑇𝑟𝑜𝑙𝑜𝑥

El área limpia bajo la curva (AUC limpia) se encuentra por diferencia entre el AUC de la
muestra y el AUC del blanco. Esta AUC limpia (y) se representa delante de la
concentración de Trolox como patrón (X) obteniendo la recta de regresión lineal, a partir
de aquí, se calculan los moles equivalentes de Trolox (ET) por litro de muestra.

8. DOCUMENTOS DE REFERENCIA

 Cao, G., Sofic, E., & Prior, R. L. (1997). Antioxidant and prooxidant behavior of
flavonoids: Structure-activity relationships. Free Radical Biology and Medicine,
22(5), 749–760. http://doi.org/10.1016/S0891-5849(96)00351-6
 Criado Dabrowska, C., & Moya Mir, M. S. (2009). Vitaminas y antioxidantes, 5–33.
 Glazer, A. (1988). Fluorescence-based assay for reactive oxygen species: a
protective role for creatinine. FASEB J, 2(9), 2487–2491. Retrieved from
http://www.fasebj.org/cgi/content/long/2/9/2487
 Londoño, J. L. (2012). Antioxidantes : importancia biológica y métodos para medir
su actividad. Desarrollo Y Transversalidad, 129–162.
 Ou, B., Hampsch-woodill, M., & Prior, R. L. (2001). Development and Validation of
an Improved Oxygen Radical Absorbance Capacity Assay Using Fluorescein as
the Fluorescent Probe Development and Validation of an Improved Oxygen
Radical Absorbance Capacity Assay Using Fluorescein as the Fluorescent, 49,
4619–4626. http://doi.org/10.1021/jf010586o
 Wayner, D. D. M., Burton, G. W., Ingold, K. U., & Locke, S. (1985). Quantitative
measurement of the total, peroxyl radical-trapping antioxidant capability of human
blood plasma by controlled peroxidation. The important contribution made by
plasma proteins. FEBS Letters, 187(1), 33–37. http://doi.org/10.1016/0014-
5793(85)81208-4
 Pérez, G. (s.f.). Espectrometria.com. Recuperado el 14 de Marzo de 2016, de
Espectrometría de fluorescencia: http://www.espectrometria.com/
 Álvarez, R., Carvalho, C., Sierra, J., Lara, O., Cardona, D., Londoño, J. (2011).
Citrus Juice Extraction Systems: Effect on Chemical Composition and
Antioxidant Activity of Clementine Juice. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, v.60, p. 774-781.
 Alfaro, M.M. (2009). Estudio de reactividad de luteolina en su estado libre y
Formando complejos de inclusión con ciclodextrinas. Tesis para optar al título de
Química. Universidad de Chile, Santiago, Chile.