Está en la página 1de 31

1

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO


FACULTAD DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS MÉDICAS


SECCION – BIOQUÍMICA

FACULTAD DE ENFERMERIA- UNT

AÑO ACADEMICO 2012

TRUJILLO – PERU
2012

DATOS INFORMATIVOS REFERENCIALES


2

DATOS GENERALES

EXPERIENCIA CURRICULAR : BIOQUÍMICA


FACULTAD : ENFERMERÍA
DEPARTAMENTO : CIENCIAS BASICAS MEDICAS
JEFA DEL DEPARTAMENTO : Dra. MARIA SOLEDAD AYALA RAVELLO
SECCION : BIOQUÍMICA
COORDINADOR DEL CURSO : Msc.. WALTER OBESO TERRONES
AÑO DE ESTUDIO : 1 er AÑO
SEMESTRE : SEGUNDO SEMESTRE
EXTENSIÓN HORARIA : INICIO: 2º de Agosto de 2012
TERMINO: 15 de Diciembre de 20123
CREDITOS: HORAS TEORICAS: 02
HORAS DE PRACTICAS: 02
AÑO ACADEMICO : 2012

PERSONAL DOCENTE QUE DESARROLLA LA ASIGNATURA

Msc. WALTER OBESO TERRONES : Prof. Asociado Tiempo Completo


Dr. . CARLOS ARANCIBIA ARROYO : Prof. Auxiliar Tiempo Completo
Dr. JORGE HUAMAN SAAVEDRA : Prof. Principal Tiempo Parcial
Msc.. ALFREDO LARIOS CANTO : Prof. Auxiliar Tiempo Parcial
Dr JORGE PLASENCIA ALVAREZ : Prof. Auxiliar Tiempo Completo
Dra. MARIA E. REYES BELTRAN : Prof. Principal Dedicación Exclusiva
Dr HÉCTOR RODRÍGUEZ BARBOZA : Prof. Auxiliar Tiempo Parcial
Dr. .JUAN VALLADOLID ALZAMORA : Prof. Principal Tiempo Parcial

PERSONAL ADMINISTRATIVO DE LA SECCION

Sr. FREDDY VENTURA NOMBERTO : Químico Farmacéutico


Sra. DALILA SOTO FLORES : Secretaria del Departamento
Sr. ADRIAN VALVERDE CONTRERAS : Técnico de Laboratorio
3

I FINALIDAD DE LAS PRACTICAS

 Las reuniones de Laboratorio tienen por finalidad realizar experimentos que demuestren
los aspectos teóricos abordados en los diálogos, dando al estudiante la oportunidad de
comprobar directamente los fenómenos y procesos que estudia.

 Las reuniones de Laboratorio son trabajos de experimentación de corta duración 2 a 3


horas como máximo. Cada grupo de práctica contará con las asesorías del Profesor
instructor para resolver y aclarar dificultades en el trabajo, induciendo al estudiante a
buscar explicaciones a los resultados y a su estudio.

 Cada alumno debe disponer de una guía de procedimientos y métodos para la práctica
programada, la misma que será analizada previamente para tener una idea clara de los
procedimientos y objetivos que se persigue.

 Las prácticas programadas serán desarrolladas integramente por los alumnos en sub
grupos de dos o tres, quienes en conjunto son responsables de los resultados del trabajo
experimental fijando previamente el problema y objetivos a alcanzar.

 Al finalizar la práctica, los estudiantes compararán sus resultados, harán la interpretación


de los mismos y establecerán las conclusiones respectivas.

II RECOMENDACIONES PARA LA CONDUCCION


DE LAS PRACTICAS

 La asistencia a las reuniones de laboratorio es obligatoria, a la hora exacta, el día


correspondiente y a la mesa de trabajo asignada. El tiempo de tolerancia para tener
derecho de ingresar a la sala de práctica es de 10 minutos como máximo.

 El uso del mandil o guardapolvo es obligatorio durante su permanencia en el laboratorio,


no se permitirá el ingreso del estudiante que no porte este medio de protección.

 Cada alumno debe llevar consigo la guía o manual de práctica a cada reunión de
laboratorio.

 El alumno debe saber los aspectos teóricos de la práctica a realizarse, para entender los
resultados obtenidos al término de ésta..

 Constatar el número, tipo y estado de conservación del material que utilizará en la


práctica, al inicio y al término de la misma.
4

 ADVERTENCIA: Algunos reactivos son tóxicos o pueden provocar quemadura; por


lo que recomienda manipular con el debido cuidado los materiales y reactivos para
evitar accidentes.

 Debe usar una pipeta para cada reactivo; por ningún motivo utilizará la misma pipeta
para dos o más reactivos. Si no hubiese suficiente número de pipetas, la pipeta usada
deberá ser lavada previamente con abundante agua corriente y luego enjuagada con agua
destilada y secada antes de ser nuevamente utilizada.

 Observar estrictamente el orden y secuencia de los reactivos utilizados en la ejecución


de cada sistema en concordancia con las instrucciones dadas en su guía de práctica.

 Identificar el tipo de pipeta a utilizar y tener mucho cuidado en agregar en forma precisa
las cantidades de reactivos indicados.

 Cada mesa de trabajo tendrá el material y reactivos necesarios para realizar la práctica
programada. Queda totalmente prohibido el intercambio de material de trabajo con otras
mesas.

 En caso de faltar material o reactivos o antes cualquier otra dificultad que pueda
presentarse en el transcurso de la práctica, dirigirse al profesor asesor de la misma para
dar solución al problema.

 Cada mesa de trabajo elegirá un representante, quien se responsabilizará del cuidado del
material entregado para la conducción de la práctica.

 Todo material que se pierda, malogre o rompa durante la práctica el estudiante está
obligado a reponerlo a la brevedad posible.

 Al término de la reunión del laboratorio cada alumno deberá presentar un informe de los
resultados y conclusiones de la práctica, para su evaluación respectiva.

 Con la debida anticipación se solicitarán los requerimientos de algún material en


particular de necesidad para la práctica, la asistencia de los alumnos a una hora
determinada para dar muestras (sangre, orina, etc.) para la normal conducción de la
práctica.
5

PRACTICA N° 01

PRIMERA UNIDAD: FACTORES FÍSICOS QUÍMICOS QUE MODIFICAN LA


VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS; CONCENTRACIONES DE
ENZIMAS Y DE SUSTRATO, PH, TEMPERATURA E IONES.

1. INTRODUCCION

Las enzimas pueden ser descritas como catalizadores complejos de origen biológico que
tienen un alto grado de especificidad y eficiencia. Esto permite que las reacciones
químicas dentro de las células ocurran rápidamente a través de vías bien definidas.

La determinación de la actividad catalítica de una enzima en un medio biológico


involucra dos aspectos; uno cualitativo y otro cuantitativo.

En general la actividad de cualquier sistema enzimático puede ser demostrado de dos


maneras:

a. Verificando el sustrato no transformado (sustrato residual) después de un tiempo


determinado de incubación en condiciones específicas de pH y temperatura.
b. Verificando los productos liberados después de una tiempo determinado de
incubación en condiciones específicas de pH y temperatura.

En general todas las enzimas, independientemente del tipo de reacción que catalizan,
presentan características comunes en cuanto a los factores que intervienen, retardando o
impidiendo su actividad. Estos factores se investigan teniendo en cuenta la velocidad de
la reacción enzimática sobre un sustrato adecuado y en determinadas condiciones.
Tomando una determinada enzima como patrón es posible tener una idea más o menos
clara de la influencia de los factores (tiempo, temperatura, concentración de enzima,
concentración de sustrato, pH, iones, etc.) sobre la serie infinita de enzimas que se
conoce. Este patrón general, como se comprenderá, varía en forma característica para
cada enzima en particular. Para estudiar cada uno de estos factores es necesario que los
otros permanezcan constantes, de tal manera que la investigación del factor variable no
se ve afectada por la variación que pudieran sufrir los otros.

La finalidad de este experimento es observar el efecto de iones activadores, pH,


concentración de enzima, concentración de sustrato, tiempo y temperatura sobre la
velocidad de reacción enzimática, tomando como ejemplo la hidrólisis enzimática del
almidón y evaluando las variaciones del sustrato transformado y de los productos de la
reacción enzimática.

2. OBJETIVOS

Armado el sistema amilasa salival + almidón, de acuerdo a las especificaciones del


instructivo, los participantes serán capaces de demostrar la actividad enzimática y las
modificaciones de las reacciones enzimáticas por acción de diversos agentes físicos
6

químicos a través de la determinación del sustrato residual (solución yodada) y de los


productos (solución cúprica alcalina y solución fosfomolibdica), cuyos cambios de color
serán valorados de acuerdo a un tubo patrón.

3. REACTIVOS A UTILIZAR
 Solución de almidón al 1%  Amilasa salival dializada al
 Buffer fosfato 0,1 M pH 6,6 0,25%
 Buffer acetato 0,1 M pH 4,6  Acido clorhídrico 0,05 N
 Buffer borato 0,1 M pH 9,0  Solución yodada (yoduro de
 Solución de cloruro de sodio al potasio + yodato de k)
0,2%  Solución cúprica alcalina
 Solución fosfomolibdica
4. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES. Procedimiento
4.1. Armar el siguiente sistema:
______________________________________________________________________
COMPONENTES (ml)/TUBOS I II III IV V VI VII VIII
______________________________________________________________________
Soluc. de Almidón 1% 1 1 2 1 1 1 1 1,0
Buffer acetato 0,1 M - - - 5 - - - -
Buffer fosfato 0,1 M 5 5 5 - 5 - 5 5,0
Buffer borato 0,1 M - - - - - 5 - -
Solución C1 Na al 0,2% 1,4 - 1,4 1,4 1,4 1,4 1,4 1,4
Agua destilada 2,6 3,4 1 2 2 2 2,4 2,0
_____________________________________________________________________

Mezclar y colocar los tubos del I al VII al baño de agua a 37°C por 5 min., para el
equilibrio de la temperatura.
El tubo VIII mantenerlo en agua helada entre 0°C y 4°C desde el inicio hasta el final..
Agregar el preparado enzimático a los tubos del II al VIII, según se indica en el cuadro
inferior sin sacarlo de la incubación, y tomar el tiempo.

AGREGAR (ml) / TUBO I II II IV V VI VII VIII


____________________________________________________________________________________

Preparado enzimático 0 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,2 0,6


____________________________________________________________________________________
Computar el tiempo desde el momento en que el preparado enzimático fue agregado a
cada tubo.
Mezclar y continuar la incubación, (Tubos del I al VIII al baño agua a 37°C y el tubo
VIII al baño agua helada a 0°C – 4°C. por 20 minutos
Los controles de la actividad enzimática:
 Por el sustrato residual, se realizará en toda la serie de tubos, del I al VIII, a los 20
min. de incubación.
 Por los productos formados, se realizará solamente en los tubos III y V, a los 20
min. de incubación.
De acuerdo a los sistemas que a continuación se presentan:

4.2. CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL


El control del sustrato no transformado se realiza por la reacción del yodo, de la
siguiente manera:
7

Cumplido los 20 min. de incubación, sacar los tubos del baño maría y luego armar
una serie paralela de tubos marcados del I al VIII, agregando a cada tubo marcado,
0,5 ml. del incubado de su correspondiente tubo de la siguiente manera:

TUBOS PARA CONTROL


COMPONENTES (ml) I II III IV V VI VII VIII
___________________________________________________________________
Incubado correspondiente anterior 5,1 (sistema)
Para cada tubo 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
HCL 0,05 N 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Solución yodada 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
___________________________________________________________________
Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de los tubos,
valorando los cambios de coloración (azul oscuro, claro, sin color) en cuadro final.

4.3. CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMATICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS


El control de los productos formados se hará en base a la actividad reductora de
estos (glucosa, maltosa).
Esta determinación se hará en los tubos III y V del incubado de los 20 min.
Armar el siguiente esquema:
___________________________________________________________________
COMPONENTES (ml) /TUBOS III V
___________________________________________________________________
Incubado correspondiente anterior 5,1
III y V para nuevo III y V 1,0 1,0
Solución cúprica alcalina 1,0 1,0
__________________________________________________________________
Mezclar y poner al baño maría hirviendo por 8 min.
Cumplido los 8 min. sacar los tubos y enfriar con agua corriente y agregar.
___________________________________________________________________

COMPONENTES (ml) /TUBOS III V


___________________________________________________________________
Solución fosfomolibdica 1,0 1,0
Agua destilada 5,0 5,0
___________________________________________________________________
Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de los tubos,
valorando los cambios de coloración (azul oscuro, azul claro, sin color) en el
cuadro final.

4.4. CUADRO PARA LA VALORACION FINAL DE LA VELOCIDAD DE LA


REACCION ENZIMATICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL (cambio de color)
a los 20 min.

I II III IV V VI VII VII


8

4.5. CUADRO PARA LA VALORACION FINAL DE LA VELOCIDAD DE LA


REACCION EZIMATICA POR PRODUCTOS FORMADOS (CAMBIO DE
COLOR).

A los 20 min.

III V

5. EVALUACION

5.1. CUESTIONARIO
1. ¿Cómo demostró usted si se ha producido o no reacción enzimática en el
experimento realizado?
2. ¿Cómo objetivó usted los productos de la reacción enzimática en el experimento
realizado?
3. En relación al sistema 4,1, identifique en cada uno de los tubos el factor físico
químico que interviene modificando la velocidad enzimática.
4. Explique que finalidad tiene la utilización de la solución yodada en el sistema 4,2
y de la solución cúprica alcalina + solución fosfomolibdica en el sistema 4,3.
5. Explique los resultados obtenidos del cuadro 4,4.
6. Explique los resultados del cuadro 4,5.
7. Diga ¿Cuáles son los componentes estructurales del almidón?.
8. Diga ¿A que se llama amilasa salival dializada y cuál es su acción sobre el
almidón?.

PRIMERA DEMOSTRACIÓN
UNIDAD: DE LA DISTRIBUCIÓN
INTRACELULAR DE LAS ENMZIMAS DE ÓXIDO – REDUCCIÓN
BIOLÓGICA.

1. INTRODUCCION
Las enzimas del óxido reducción tienen una distribución característica
intracelularmente, encontrándosele de modo fundamental en una subestructura celular
en donde la energía derivada de las oxidaciones es “capturada” en la forma del
intermediario macroérgico ATP.

La finalidad del presente trabajo es objetivizar la distribución intracelular de las enzimas


de óxido – reducción usando los indicadores redox 2- 6 diclorofenolindofenol y p-
fenilendiamina y los componentes celulares de un homogeneizado de hígado de rata
obtenidos por configuración diferencial mediante el método de Scheinder y Col.

2. OBJETIVOS
2.1 Dadas varias fracciones celulares de un homogenizado de hígado de rata en un
sistema bufferado y siguiendo las indicaciones del instructivo, el participante o
grupo de participantes serán capaces de determinar la distribución de las enzimas de
óxido reducción.
9

2.1.1 Al identificar los cambios de coloración del indicador redox 2- 6


diclorofenolindofenol en los siguientes tubos.
2.1.2 Al identificar los cambios de coloración del indicador redox p-
fenilendiamina, en los diferentes tubos.

2.2 Después de logrado el objetivo 3,1, el participante será capaz de graficar en una
cadena de oxido reducción biológica el lugar y acción de los indicadores redox; 2 6
diclorofenolindofenol y p – fenilendiamina.

3. REACTIVOS A UTILIZAR
 Buffer fosfato de sodio 0,1 M pH 7,4
 2 – 6 diclorofenoindofenol 0,02%
 Succinato de sodio 0,1 M.
 P- fenilendiamina 1%
 Homogeneizado total del hígado de rata en sucrosa 0,25 M (y/o KCI 0,154M)
 Fracción nuclear del homogeneizado.
 Fracción mitrocondrial del homogeneizado.
 Fracción Microsomal soluble del homogeneizado.
4. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento

4.1. Armar el siguiente sistema usando 2 – 6 diclorofenolindofenol:


__________________________________________________________________
COMPONENTES (ml) /TUBOS 1 2 3 4 5
___________________________________________________________________
Buffer fosfato 0,1 M pH 7,4 1,0 0,5 0,5 0,5 0,5
2-6 diclorofenolindofenol 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Succinato de sodio 0,1 M 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Fracción nuclear - 0,5 . - -
Fracción mitocondrial - - 0,5 - -
Fracción microsomal soluble - - - 0,5 -
Homogeneizado total - - - - 0,5
__________________________________________________________________
Mezclar. Dejar en reposo a temperatura ambiente.
Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador para
interpretar los resultados.

4.2. Armar el siguiente sistema usando p – fenilendiamina.


___________________________________________________________________
COMPONENTES (ml) /TUBOS 1 2 3 4 5
________________________________________________________________________________
Buffer fosfato 0,1 M pH 7,4 1,5 1,0 1,0 1,0 1,0
p- Fenilendiamina 1% 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Fracción nuclear - 0,5 - - -
Fracción mitocondrial - - 0,5 - -
Fracción microsomal soluble - - - 0,5 -
Homogeneizado total - - - - 0,5
_________________________________________________________________
Mezclar. Dejar en reposo a temperatura ambiente.
Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador para
interpretar los resultados.
10

5. EVALUACION
5.1. CUESTIONARIO
1. ¿Cómo interpreta usted los cambios de coloración del indicador redox 2-6
diclorofenolindofenol en el sistema bufferado 5,1?.
2. ¿Cómo interpreta usted los pasos del estado incoloro a coloreado del indicador
redox p – fenilendiamina en el sistema bufferado 5,2 ?. Grafique en una cadena
de óxido reducción biológica la acción de los indicadores redox 2- 6
diclorofenolindofenol y p – fenilendiamina.
3. De acuerdo al experimento realizado, señale las fracciones celulares que
contienen las enzimas de óxido en los sistemas 5,1 y 5,2.

PRACTICA N° 02

SEGUNDA UNIDAD: CUANTIFICACIÓN DE GLUCOSA EN SANGRE (GLICEMIA)

1. INTRODUCCION

DETERMINACION DE GLUCOSA EN SANGRE (GLICEMIA)

Los valores normales de glucosa en sangre son variables de acuerdo al método


utilizado. Así tenemos que, según el método de Follin-Wu, varía entre los 80 – 120 mg.
por ciento, con el método de la glucosa oxidasa la concentración varía 60 – 110 mg. por
ciento.

En general, podemos señalar que la concentración de glucosa en sangre depende del


balance entre el aporte y el gasto de glucosa en el organismo. El aporte depende de la
producción o ingreso y el gasto depende de la utilización y excreción de la misma.

Diversos factores que inciden sobre la absorción, producción endógena de glucosa así
como la utilización y excreción de la misma, contribuyen a mantener constante la
concentración de glucosa en sangre. El conocimiento de la glicemia es importante no
sólo porque nos permite tener una idea integral del mecanismo de homeostasis
metabólica existente, sino porque las variaciones de ella son expresiones de diversos
estados patológicos que se deben investigar y diagnóstica para su tratamiento.

La finalidad de la práctica es cuantificar la glicemia por el método de Glucosa Oxidasa


en personas normales .

2. OBJETIVOS

2.1 Teniendo como material biológico muestra de sangre total extraída por
venipuntura de la flexura del codo de adultos normales, el participante o grupo
de participantes serán capaces de cuantificar la glicemia por el método de
Glucosa Oxidasa de acuerdo a las especificaciones dadas.
11

2.2 Como los valores de glicemia obtenidos, el participante o grupo de participantes


podrán clasificar los resultados obtenidos, informando verbalmente o por escrito
aquellos casos considerados normales .

3. REACTIVOS A UTILIZAR
Reactivo enzimático y Reactivo Standard (1mg de glucosa /dl)

4. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES

4.1 Obtención de la muestra de sangre: se extraen 5ml. de sangre de la flexura del


codo, con Jeringa de 10 ml. y aguja hipodérmica N° 20. El sujeto debe estar en ayuno
de por lo menos 8 horas, dado que la glicemia varía con la alimentación.

4.2 Se centrifugará la muestra de sangre para obtener el suero

4.3 Armar el siguiente sistema:


______________________________________________________
COMPONENTES (ml) Blanco Standard Desconocido
______________________________________________________
Muestra (ml) ---- ------ 0.01
Standard (ml) ---- 0.01 -----
Reactivo 1.0 1.0 1.0
______________________________________________________
Mezclar e incubar 10 minutos a 37oc o 20 minutos a temperatura ambiente (20 a
25o c). leer las absorbancias llevando a cero el espectrofotómetro con el blanco de
reactivo. El color resultante es estable por a lo menos treinta minutos.

Solución standard.- Es aquella que tiene una concentración conocida de una


determinada sustancia y que sirve de referencia para encontrar los valores de esa
misma sustancia en una muestra problema en la que no se conoce su concentración
y se requiere cuantificarla..

4.4 Cálculos:
1. De cada una de las lecturas de los tubos Standard y Desconocido, restar la
lectura del tubo I o blanco (en todo caso de valoración cuantitativa se emplea el
denominado blanco, para corregir las lecturas de los problemas).
2. Cálculo del Factor (F)

100
F =
Densidad Optica Estándar(Absorbancia Standard)

3. Cálculo de la concentración de glucosa en sangre:


FR x D.O. de los problemas = mg. de glucosa %
Glucosa (mg/dl)= Factor x(Absorbancia desconocido – Blanco)
12

5. EVALUACION
5.1 CUESTIONARIO
1. ¿Cuál fue el rango o el promedio de glicemia considerada normal en su mesa?.
2. ¿Cómo esperaría encontrar los valores de la glicemia deseada en la sangre
venosa y en la sangre arterial?.
Como explicaría usted este fenómeno.
3. ¿Por qué son diferentes los valores de glicemia, según los métodos de Follin-
Wu y la glucosa oxidasa?.
4. ¿Qué variaciones fisiológicas de la glicemia puede usted señalar?.

REGULACIÓN HORMONAL DE LA GLUCOSA SANGUÍNEA: EFECTO


DE LA INSULINA

1. INTRODUCCION
Para poder afrontar con eficiencia las variaciones más o menos bruscas que pueden
afectar a la glucosa sanguínea, el organismo dispone de mecanismos reguladores que de
diferentes maneras aceleran o retardan la entrega o el retiro de glucosa desde o hacia los
tejidos. Los mecanismos reguladores son nerviosos y endocrinos y es muy posible que los
primeros actúan en realidad mediante modificaciones en la entrega de hormonas por las
glándulas de secreción interna, de modo que el mantenimiento de la glicemia en niveles
normales depende del equilibrio entre la producción y la utilización de la glucosa
sanguínea; cuya sensibilidad está regida en medida importante por el balance entre la
insulina por un lado y las hormonas suprarrenales y de adenohipófisis por el otro.

La insulina ejerce profundos efectos sobre el metabolismo de la glucosa y otros


nutrientes. Esta hormona es producida por las células beta de los islotes de Langerhans
del páncreas y es secretado en respuesta directa al incremento de glucosa en la sangre. El
efecto más importante de una deficiencia insulínica es el de un nivel sanguíneo de
glucosa extremadamente elevado (hiperglicemia), una excesiva excreción de glucosa por
la orina (glucosuria) y un reducido nivel de glucógeno en el hígado. La administración de
insulina va seguida de descenso de la glicemia (hipoglicemia) cuya magnitud depende de
la dosis administrada: el efecto se debe fundamentalmente a que la hormona favorece la
formación de glucógeno en el hígado y en el músculo, a la vez que acelera la oxidación
de glucosa en diferentes tejidos. La insulina también favorece la conversión de los
hidratos de carbono en ácidos grasos y por otro lado inhibe la gluconeogénesis a partir de
los aminoácidos. Se explica así que la falta de insulina determina una hiperglicemia que
es el signo fundamental del cuadro denominado diabetes.

La secreción de insulina parece estar condicionada en forma importante por el nivel de


glicemia,de manera que cada vez que se eleva la glicemia, se produce más insulina que
tiende a aminorarla.
La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la
variación de glicemia como consecuencia de administración de insulina.

2. OBJETIVOS

2.1 Utilizando conejos, como especímenes biológicos de experimentación, el


participante o grupo de participantes serán capaces de graficar las curvas de glicemia,
después de la administración parenteral de insulina de acuerdo a las especificaciones
13

dadas en el instructivo.
2.2 Después de desarrollar el instructivo, el participante o grupo de participantes estarán
en capacidad de establecer comparaciones entre las curvas de glicemia, después de
la administración de insulina y la curva de glicemia después de la administración de
adrenalina.

3. REACTIVOS A UTILIZAR

 Conejos adultos de más de 2kg. de peso corporal bien alimentados


 Solución de insulina cristalizada (LILLY): I - Unidad por ml.
 Jeringas hipodérmicas de 2,5 cc ó 5,0 cc.
 Reactivo enzimático
 Reactivo Standard (1mg de glucosa /dl)

4. PROCEDIMIENTO

EFECTO DE LA INSULINA SOBRE LA GLICEMIA


4.1 Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la finalidad
de calcular la cantidad de insulina a inyectar.
4.2 Dosis de la solución de insulina cristalina lilly (I Unidad por ml) inyectar I unidad
por kilogramo de peso corporal. Utilizar una jeringa hipodérmica de 2.5 ml ó 5 ml.
que facilita la medida de la dosis.
4.3 EXTRACCION DE LAS MUESTRAS DE SANGRE Y ADMINISTRACION DE INSULINA:
1. Extraer una primera muestra de sangre por punción cardíaca y transferirla a un
frasquito con oxalato. Servirá para establecer los valores basales de glicemia.
2. Inyectar por vía subcutánea la cantidad calculada de insulina.
3. Luego extraer muestra de sangre a los 15¨, 30´y 60´ minutos después de
inyectada la insulina, lo que hace un total de tres muestras en una hora.
4. Con cada una de las citadas muestras realizar la determinación de glucosa según
el método enzimático de Glucosa Oxidasa.

4.4 DETERMINACION DE GLUCOSA EN SANGRE DE LOS ANIMALES TRATADOS


CON INSULINA.
1. Armar el siguiente sistema:
____________________________________________________________________
COMPONENTES (ml.) /TUBOS B I II III IV
____________________________________________________________________
Sangre Total (plasma o suero)
Muestra basal - 0.01 -- -- --
Muestra a los 15 min. con insulina - -- 0.01 -- --
Muestra a los 30 min. con insulina - -- -- 0.01 --
Muestra a los 60 min. con insulina - -- -- -- 0.01
Reactivo 1 1 1 1 1
____________________________________________________________________
Mezclar e incubar 10 minutos a 37oc o 20 minutos a temperatura ambiente (20 a 25o
c). leer las absorbancias llevando a cero el espectrofotómetro con el blanco de
reactivo. El color resultante es estable por a lo menos treinta minutos.

2. Lecturas (espectrofotométricas); se realizan de menor a mayor intensidad de


color utilizando tubos especiales, en las cuales se trasvasa el contenido de cada
14

uno de los tubos de reacción anteriormente indicados.


Las lecturas se llevan a cabo en el Espectrofotómetricas Spectromic 20 a 420
nm. Las lecturas representan la densidad óptica (D.O) de cada una de las
soluciones coloreadas obtenidas. Dichas lecturas se anotarán en el cuaderno de
notas y servirán para realizar los cálculos subsiguientes.

3. Cálculos. De cada una de las lecturas de los tubos I, II, III y IV restar la lectura
del tubo blanco (en todo caso de dosajes se utiliza el denominado Blanco, para
corregir las lecturas de los problemas).

Cálculo de la concentración de glucosa en 100ml de sangre.

FR X (DO de los problemas – Blanco): mgs de glucosa por 100ml.

Anotar los resultados en relación al tiempo.

5. EVALUACION

5.1. CUESTIONARIO
1. Explique usted brevemente la regulación de la glicemia, como resultado, en
términos generales, de la tasa de llegada e índice de salida de la glucosa de la
sangre.
2. Explique de manera sucinta el efecto de la insulina sobre la glicemia; con
especial referencia al metabolismo de los carbohidratos.
3. ¿Cuál es el efecto metabólico de la insulina sobre el hígado y sobre los músculos
y que efecto produce sobre la glicemia?.
4. Utilizando papel milimetrado, construye una gráfica sobre el efecto obtenido
por la insulina sobre la glicemia, en el espécimen de experimentación.
5. Si obtuvo efectos extremos por la acción de la droga utilizada, de una
explicación sucinta de ellos.

REGULACIÓN HORMONAL DE LA GLUCOSA SANGUÍNEA: EFECTO


DE LA ADRENALINA.

1. INTRODUCCION

Para poder afrontar con eficiencia las variaciones mas o menos bruscas que puedan
afectar a la glucosa sanguínea, el organismo dispone de mecanismo reguladores que de
diferentes maneras aceleran o retardan la entrega o el retiro de glucosa desde o hacia los
tejidos. Los mecanismos reguladores son nerviosos y endocrinos y es muy posible que los
primeros actúen en realidad mediante modificaciones en la entrega de hormonas por las
glándulas de secreción interna, de modo que el mantenimiento de la glicemia en niveles
normales depende del equilibrio entre la producción y la utilización de la glucosa
sanguínea; cuya sensibilidad está regida en medida importante por el balance entre la
insulina por un lado y las hormonas suprarrenales y de la adenohipófisis por el otro.

La adrenalina hormona secretada por la médula suprarrenal, tiene acción


hiperglicemiante; ello se debe a que favorece la conversión del glucógeno en glucosa
15

(glucogenólisis) en el hígado, además de actuar en el músculo, por la ausencia en este de


la glucosa 6 - fosfatasa, la glucogenólisis se realiza con la formación de lactato el que va
a contribuir directamente a la formación de glucosa y glucógeno en la célula hepática por
los mecanismos gluconeogenéticos. El efecto glucogenolítico de la adrenalina es debido a
que activa a la fosforilasa.

La secreción de adrenalina parece estar condicionada en forma importante por el nivel de


glicemia, si aparece hipoglicemia se segrega más adrenalina y glucagón que aceleran la
regulación que espontáneamente debe realizar el hígado.

La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la


variación de la glicemia como consecuencia de la administración de adrenalina.

2. OBJETIVOS

2.1 Utilizando conejos, como especímenes biológicos de experimentación , el


Participante o grupo de participantes, serán capaces de gráficar una curva de glicemia,
después de la administración parenteral de adrenalina de acuerdo a las
especificaciones dadas en el instructivo.
2.2 Después de desarrollar el Instructivo, el participante o grupo de participantes estarán
en capacidad de establecer comparaciones entre las curvas de glicemia, después de la
administración de adrenalina y la curva de glicemia después de la administración de
insulina.

3. MATERIAL BIOLOGICO Y REACTIVOS A UTILIZAR

 Conejos adultos de más de 2 kg. de peso corporal, sometidos ayuno de 8 a 12


horas
 Solución de adrenalina 0,1 mg por ml.
 Jeringas hipodérmicas de tuberculina
 Reactivo enzimático
 Reactivo Standard (1mg de glucosa /dl)

4. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento

4.1 Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la
finalidad de calcular la cantidad de adrenalina a inyectar.
4.2 Dosis: de la solución de adrenalina (0,1 mg/ml) inyectar 0,025mg por cada
kilogramo de peso corporal que corresponde a 0.25ml de la solución a utilizar
por kg de peso. Utilizar una jeringa hipodérmica de tuberculina que facilita la
medida de la dosis.
4.3 EXTRACCION DE LAS MUESTRAS DE SANGRE Y ADMINISTRACION DE
ADRENALINA.

1. Extraer una primera muestra de sangre, 3ml por punción cardiaca y


transferirla a un frasquito con oxalato de potasio. Servirá para establecer los
valores basales de glicemia.
2. Inyectar por vía subcutánea la cantidad calculada de adrenalina según el
peso del animal.
3. Luego extraer muestras de sangre a los 15´, 30´y 60´minutos después de
16

inyectada la adrenalina, lo que hace un total de tres muestras en una hora.


4. Con cada una de las citadas muestras realizar los dosajes de glucosa según
el método de Folin-Wu.
5. Con los resultados así obtenidos, construir un gráfico, tomando las
variaciones en relación al tiempo.

4.4. DETERMINACION DE GLUCOSA EN SANGRE DE LOS ANIMALES TRATADOS CON


ADRENALINA

1. Armar el siguiente sistema:


____________________________________________________________________
COMPONENTES (ml.) /TUBOS B I II III IV
____________________________________________________________________
Sangre Total (plasma o suero)
Muestra basal - 0.01 -- -- --
Muestra a los 15 min. con insulina - -- 0.01 -- --
Muestra a los 30 min. con insulina - -- -- 0.01 --
Muestra a los 60 min. con insulina - -- -- -- 0.01
Reactivo 1 1 1 1 1
____________________________________________________________________
Mezclar e incubar 10 minutos a 37oc o 20 minutos a temperatura ambiente (20 a 25o
c). leer las absorbancias llevando a cero el espectrofotómetro con el blanco de
reactivo. El color resultante es estable por a lo menos treinta minutos.

2. Lecturas (espectrofotométricas); se realizan de menor a mayor intensidad de color


utilizando tubos especiales, en las cuales se trasvasa el contenido de cada uno de los
tubos de reacción anteriormente indicados.
Las lecturas se llevan a cabo en el Espectrofotómetricas Spectromic 20 a 420 nm.
Las lecturas representan la densidad óptica (D.O) de cada una de las soluciones
coloreadas obtenidas. Dichas lecturas se anotarán en el cuaderno de notas y servirán
para realizar los cálculos subsiguientes.

3. Cálculos. De cada una de las lecturas de los tubos I, II, III y IV restar la lectura del
tubo blanco (en todo caso de dosajes se utiliza el denominado Blanco, para corregir
las lecturas de los problemas).

Cálculo de la concentración de glucosa en 100ml de sangre.

FR X (DO de los problemas – Blanco): mgs de glucosa por 100ml.

Anotar los resultados en relación al tiempo.

5. EVALUACION

5.1. CUESTIONARIO
1. Explique usted brevemente la regulación de la glicemia, como resultado, en
términos generales, de la tasa de llegada e índice de salida de la glucosa de la
sangre.
2. Explique de manera suscinta el efecto de la adrenalina sobre la glicemia; con
especial referencia al metabolismo de los carbohidratos.
17

3. ¿Cuál es el efecto metabólico de la adrenalina sobre el hígado y sobre el tejido


muscular y que efecto produce sobre la glicemia?.
4. Utilizando papel milimetrado, construye una gráfica sobre el efecto obtenido por
la adrenalina sobre la glicemia, en el espécimen de experimentación.
5. Si obtuvo efectos extremos por la acción de la droga utilizada, de una explicación
suscinta de ello.

PRACTICA N° 03
TERCERA UNIDAD:

DEMOSTRACIÓN DE LA DIGESTIÓN DE LAS GRASAS IN VITRO:


ACCIÓN EMULSIFICANTE DE LAS SALES BILIARES SOBRE LAS
GRASAS. ACCIÓN DE LA LIPASA PANCREÁTICA SOBRE LOS
TRIGLICÉRIDOS Y EFECTO DE LAS SALES BILIARES.

1. INTRODUCCION
Los lípidos ingeridos con los alimentos sufren modificaciones ligeras en la boca por la
lipasa lingual y en el estómago por acción de una lipasa gástrica.
El hígado, además de la inmensa importancia en el metabolismo intermediario,
desempeña también una función excretoria y es responsable de la formación de bilis que
vierte al intestino delgado por medio del conducto colédoco. El hígado transforma al
colesterol en ácidos biliares y promueve su reacción con bases nitrogenadas como glicina
y taurina, formando las correspondientes sales biliares. Son ejemplo los ácidos
taurocólico y glicocólico. Las sales biliares, una vez llegadas al intestino se emplean
como agentes emulsionantes para preparar, para su absorción, a los ácidos grasos y a los
acilglicéridos. Una gran proporción de las sales biliares es reabsorbida con los lípidos y
ácidos grasos y retornan al hígado por la circulación entero hepática.

Las secreciones pancreáticas se mezclan con la bilis, puesto que son vertidas en un
conducto común antes de su entrada al duodeno. El páncreas también sintetiza lipasa.
Enzimas rompedoras de grasa en el duodeno son activadas solamente en presencia de las
sales biliares que solubilizan las grasas y las hacen por ello, susceptibles a la rotura
enzimática por las lipasas.

La acción combinada de las lipasa pancreática, una isomerasa y la lipasa intestinal dan
como productos ácidos grasos libres 2 - monoacilglicerol, - monoacilglicerol
(monoglicéridos) y glicerol. Los triglicéridos absorbidos del lumen intestinal penetran
en forma de quilomicrones, vierten en el torrente circulatorio por el conducto torácico,
gran vaso linfático que drena el intestino. En esta forma se incluyen fosfolípidos y esteres
de colesterilo.

La quiluria y el quilotórax son anomalías debidas a la conexión anormal entre las vías
urinarias, la cavidad pleural y el sistema de drenaje linfático, respectivamente.

La finalidad de la presente práctica es demostrar la acción emulsificante de las sales


biliares sobre las grasas y así mismo demostrar la acción emulsificante pancreática sobre
los triglicéridos y el efecto de las sales biliares en la reacción enzimática,
18

2. OBJETIVOS

2.1. Armado un sistema de tubos de ensayo que contiene aceite y sales biliares, según las
especificaciones del instructivo, los participantes serán capaces de determinar la
acción emulsificante producida en dicho sistema.

2.2. Armado un sistema que contiene aceite vegetal, sales biliares y extracto pancreático,
según las especificaciones del Instructivo, los participantes serán capaces de
determinar la acción lipolítica de la enzima y el efecto de las sales biliares sobre la
acción enzimática, mediante una titulación final.

3. REACTIVOS A UTILIZAR

 Aceite vegetal, de oliva


 Solución de sales biliares al 1% (en H2 0)
 Buffer fosfato 0,1M pH 8,0
 Emulsificación de aceite vegetal de oliva
 Solución de extracto pancreático 1%
 Solución de fenolftaleína (Solución alcohólica) al 0,1%
 Hidróxido de sodio (Na0H) 0,1N

4. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento

4.1. Acción emulsificante de las sales biliares sobre las grasas.


Armar el siguiente sistema:
___________________________________________________________________
COMPONENTES /TUBOS I II
___________________________________________________________________
Aceite vegetal de oliva (gotas) (3) (3)
Agua destilada (ml) 5 3
Solución de sales biliares (ml) - 2
___________________________________________________________________

Agitar enérgicamente los tubos I y II.


Dejar en reposo y anotar los resultados para interpretarlos.

4.2 Acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos y efecto de las sales biliares
sobre la reacción enzimática.
Armar el siguiente sistema:
____________________________________________________________________
COMPONENTES (ml) /TUBOS I II III IV
____________________________________________________________________
Emulsificación de aceite vegetal -- 3 3 3
Buffer fosfato 0,1M pH 8,0 2 2 2 2
Solución de sales biliares 1% 2 2 -- 2
Solución de extracto pancreático 1% 2 -- 2 2
19

Agua destilada 3 2 2 --
____________________________________________________________________

Mezclar los 4 tubos y llevar al baño maría a 370°C, por 30 min, agitando de vez en
cuando.
Al finalizar el tiempo de incubación retirar los tubos y agregar a cada uno 3 gotas de
fenolftaleina. Mezclar bien y luego realizar la titulación.
TITULACION: Utilizando una pipeta graduada de 1 ml, dejar caer gota a gota
NaOH 0,1N en el fondo de cada tubo del sistema mezclando hasta la aparición de un
color rosado tenue permanente.
Anotar la cantidad de hidróxido de sodio 0,1N gastados.
Anotar los resultados para su interpretación.

5. EVALUACION
5.1. CUESTIONARIO
1. Explique usted el mecanismo por el cual actúan las sales biliares.
2. ¿Qué importancia, desde el punto de vista biológico, tiene el conocimiento del
fenómeno de la emulsificación?.
3. ¿Cuál es su composición y como funciona la bilis?
4. ¿Cómo actúan las sustancias tensioactivas, cuáles son y dónde ejercen su
actividad?.
5. ¿Qué son sustancias hipsótonas y batótonas?. Dé ejemplos.
6. ¿Qué alteraciones metabólicas originaría las extirpación de la vesícula biliar?.

DETERMINACIÓN DEL PERFIL LIPÍDICO

1. IDENTIFICACIÓN:
1.1 Nombre de la Unidad de Trabajo: Metabolismo de los Lípidos
1.2 Contenido: Determinación de Colesterol Total, HDL-
Colesterol y Triglicéridos

2. INTRODUCCIÓN

El colesterol es un alcohol derivado del núcleo ciclopentanoperhidrofenantreno, libre es


anfipático, es decir con una región polar y otra no polar. Al esterificarse, principalmente
con el ácido linoleico, se hace totalmente hidrofóbico. Es componente importante de las
biomembranas, regulando su fluidez. A partir de él se forman los ácidos biliares y las
hormonas esteroideas. En la dieta, se encuentra sólo en los alimentos animales,
especialmente la yema de huevo, las vísceras. Después de su absorción es transportado
por los quilomicrones, y captado por el hígado de los remanentes de los quilomicrones,
a través de un receptor especial. En el hígado el colesterol de la dieta puede inhibir su
propia síntesis. Sale del hígado transportado inicialmente en las VLDL. Ésta se
convierte por acción de la lipasa lipoproteica en IDL, la que finalmente se convierte en
parte en LDL. Esta lipoproteína es la principal transportadora del colesterol; gracias a su
apoproteina B100, es captada por el hígado o los tejidos, a través de un receptor
específico. De los tejidos es captado por la HDL, siendo esterificado y transportado en
forma reversa hacia el hígado, por transferencia a las lipoproteínas, las VLDL o LDI y
LDL.
20

El aumento del colesterol sanguíneo es considerado un factor de riesgo coronario,


especialmente el ligado a la LDL, que es aterogénica. En cambio, la HDL se considera
antiaterogénico.

Los triglicéridos sanguíneos pueden ser de origen exógeno (dieta) o endógeno (síntesis).
Los primeros son transportados por los quilomicrones, y normalmente no existen en
ayunas. Los segundos son transportados por la lipoproteína de muy baja densidad
(VLDL) que se forma en el hígado. Sufre la acción de la lipasa lipoproteica en los
tejidos extrahepáticos liberando ácidos grasos que son utilizados como fuente de
energía. Los triglicéridos en ayunas corresponden en condiciones normales a los de
orígen endógeno.

El III Panel de expertos ha establecido los valores de referencia para el colesterol, el


HDL, y el LDL. En el colesterol se considera 3 niveles: Deseable < 200 mg/dl, limítrofe
alto 200-239 y alto > 240. El HDL colesterol, 3 niveles: Bajo o de riesgo < 40, normal
40 a 59, alto o protector mayor o igual a 60. El LDL colesterol, 5 niveles: Óptimo < 100
mg/dl, casi óptimo 100-129, limítrofe alto 130-159, alto 160-189, y muy alto >190. para
los triglicéridos se considera: normal menos de 150mg/dl, limítrofe de 150 a 199,
Hipertrigliceridemia moderada de 200 a 499
La hipercolesterolemia puede deberse a causas primarias o secundarias. Entre las
hipercolesterolemias primarias se señalan: La hipercolesterolemia familiar, la
hipercolesterolemia poligénica, la hiperlipidemia familiar combinada, la
disbetalipoproteinemia. Entre las secundarias: La diabetes, el lipoteroidismo, el
síndrome nefrótico, ictericia obstructiva, cirrosis biliar.

El aumento de los triglicéridos puede deberse a causas primarias o familiares, o


secundarias a otras enfermedades. Son hipertrigliceridemias primarias, la hiperlipidemia
familiar combinada la hiperkilomicronemia, la hipertrigliceridemia familiar. Son causas
secundarias: la diabetes, el hipotiroidismo, la gota, el alcoholismo, el uso de
anticonceptivos orales, etc. La hipertrigliceridemia se asocia a disminución de HDL,
obesidad central, resistencia a la insulina, hipertensión, en el denominado síndrome
metabólico.

En la presente práctica, se realizará la determinación de colesterol sanguíneo, por el


método enzimático y la determinación de HDL, previa precipitación de las otras
lipoproteínas.

3. COMPETENCIAS
El participante determina el perfil lipídico , señala sus alteraciones y su relación con
el riesgo coronario.

4. REACTIVOS:
Reactivo enzimático para la determinación de colesterol.
Reactivo precipitante de HDL.
Reactivo enzimático pára la determinación de triglicéridos
21

5. PROCEDIMIENTO

5.1 DETERMINACIÓN DE COLESTEROL SANGUÍNEO

Armar el siguiente sistema: utilizando tubos de 15 x 125 mm.

Componente Blanco Problema Estándar


Suero 10 ul
Estándar 200 mg/dl 10 ul
Reactivo enzimático 1 ml 1 ml 1 ml

Incubar a 37º por 10 min.


Leer las absorbancias a 505 nm. en fotocolorímetro.
Restar el blanco tanto a los tubos problema como al estandar.
Luego calcular el Factor (F):
200 mg/dl
F = ------------------------------
Absorbancia del standar

Problema (mg/dl) = F (Absorbancia de la muestra problema)

5.2 DETERMINACIÓN DE HDL-COLESTEROL

En un tubo de prueba medir 0.25 ml de reactivo precipitante y agregar 0.1 ml de


muestra de suero. Mezclar y esperar 15 minutos a temperatura ambiente.
Centrifugar 15 minutos a 3000 rpm. Usar el sobrenadante límpido como muestra
de la siguiente forma:

Sobrenadante 100 ul
Reactivo de trabajo 1 ml

Mezclar e incubar 10 minutos a 37°C. Retirar del baño y enfriar. Leer en


espectrofotómetro a 505 nm.

CALCULOS:
76.5
F = --------------------------------
Absorbancia del Standard

HDL Colesterol (mg/dl) = Absorbancia Desconocido x F


22

5.3 DETERMINACION DE TRIGLICERIDOS


Armar el siguiente sistema:

Componentes blanco problema Estándar


Suero 10ul
Estándar 10ul
Reactivo enzimático 1ml 1ml 1ml

Incubar a 37º por 5 min.


Leer las absorbancias a 505 nm. en fotocolorímetro.
Restar el blanco tanto a los tubos problema como al estandar.
Luego calcular el Factor (F):
200 mg/dl
F = --------------------------------
Absorbancia del standard

Problema (mg/dl) = F x Absorbancia de la muestra problema

5.4 DETERMINACIÓN DEL LDL


Aplicar la fórmula de Friedwald:

LDL = Colesterol Total – ( HDL + TG/5 )

6. EVALUACION FINAL

CUESTIONARIO
1. Señale la importancia del colesterol.
2. Señale los valores de referencia del Colesterol, HDL-Colesterol y LDL-
Colesterol.
3. Causas de hipercolesterolemia.
4. Importancia del HDL como antiaterogénico.
5. Importancia de la LDL como aterogénico.
6. Haga un esquema de la estructura de los triglicéridos.
7. Causas de hipertrigliceridemia.
8. Explique por qué la hipertrigliceridemia es un factor de riesgo coronario
23

PRACTICA N° 4

IV UNIDAD:

DETERMINACIÓN DE LAS PROTEÍNAS SÉRICAS TOTALES.

1. INTRODUCCION

Las proteínas plasmáticas de hecho son una mezcla muy compleja no solo de proteínas
simples sino también de proteínas mixtas o conjugadas, tales como las glucoproteínas y
mucoproteínas y diversos tipos de lipoproteínas. Las dos primeras son combinación de un
carbohidrato (hexosamina) con globulinas y se encuentran principalmente en las
fracciones alfa 1 y alfa 2 de las globulinas. Se define a las mucoproteínas (mucoides)
como aquellos compuestos que contienen más del 4% de hexosamina y se considera
glucoproteínas a los compuestos que contiene menos de esta cantidad.

Las proteínas plasmáticas son importantes para el organismo porque intervienen en una
diversidad de actividades entre las que se destacan catálisis enzimática (enzimas),
transporte y almacenamiento (hemoglobina, transferrina, ferritina), soporte mecánico
(colágeno), movimiento coordinado (contracción muscular y movimiento de los
cromosomas), protección inmune (anticuerpos), generación y transmisión de los impulsos
nerviosos (receptores proteicos como rodopsina, acetil colina en las sinapsis), control del
crecimiento y la diferenciación (información genética controlada), función osmótica,
acción amortiguadora, coagulación sanguínea, regeneración y crecimiento de tejidos, etc.
La concentración sérica de las proteínas totales es de 6,5 a 7,5 gr/100 ml de las cuales,
albúminas: 4, 5 a 5 gr/100ml. y globulinas: 1,5 a 3 gr/100 ml. Ellas constituyen la mayor
parte de los sólidos del suero. La relación albúmina/globulina varía, según el método de
fraccionamiento de albúminas y globulinas. La relación albúmina/globulina es de 1,2 -
1,5.

Las cifras de proteínas plasmáticas totales pueden aumentar en la hemoconcentración o


en el caso de existir proteínas anormales (paraproteínas) habitualmente globulinas como
en el mieloma de células plasmáticas (mieloma múltiple) y en algunas enfermedades
parasitarias como el kal -azar. Clínicamente las proteínas plasmáticas totales pueden
disminuir en los siguientes casos: por pérdida excesiva como: a) albuminuria grave (por
ejemplo en nefrosis), b) quemaduras extensas (en este caso la hipoproteinemia puede
quedar enmascarada por la hemoconcentración ), c) desnutrición de larga duración
(inanición, kwashiorkor, esprue, etc.). d) Lesiones del tubo digestivo que producen
perdidas de proteínas. Enfermedades que afectan la síntesis de proteínas, como en la
cirrosis hepática.

En la hemoconcentración debida a deshidratación (vómitos, diarreas) la albúmina y


globulinas se encrimentan en la misma proporción y la relación A/G permanece normal
(no cambia). Este es el único caso en que la albúmina se incrementa. En otros casos de
incremento de las proteínas totales la albúmina no cambia o disminuye ligeramente
mientras que las globulinas aumentan, como consecuencia, la relación A/G cae
24

marcadamente. Incremento de las globulinas son encontradas en lesiones hepáticas


severas. En algunas enfermedades infecciosas crónicas se incrementan las gamma
globulinas mientras que en enfermedades febriles agudas se incrementan las globulinas
alfa. La disminución de proteínas totales son generalmente asociadas con bajos niveles de
albúminas que a su vez están acompañadas por pequeños cambios en las globulinas, de
manera que la relación A/G es baja.

Los bajos niveles de albúminas pueden ser debidos:


Incrementadas pérdidas de albúmina en la orina.
Disminución de la formación en el hígado.
Insuficiente ingestión de proteínas.
En severa hemorragia.
Si los niveles de albúmina continúan bajos por largo tiempo, es causa de edema.
Agammaglobulinemia es un cuadro relativamente raro, condición frecuentemente debido
a defecto metabólico genético en la cual las gammaglobulinas están muy disminuidas o
totalmente ausentes.
.
La albúmina es una especie molecular relativamente simple, pero las globulinas están
compuestas de distintas fracciones proteicas y para su separación y determinación se usa
comúnmente la electroforesis en acetato de celulosa. Las globulinas son separadas en alfa
1, alfa 2, beta y gamma, glubulinas que son las principales fracciones encontradas en el
suero; en el plasma se encuentra otra fracción que es el fibrinógeno, que puede ser
determinado separadamente en el plasma, si se desea la electroforesis usualmente se lleva
a cabo en suero para evitar la interferencia que el fibrinógeno pudiera causar en la
cuantificación de las otras fracciones proteicas.

2. OBJETIVOS:

Después de haber obtenido una muestra problema de sangre, los participantes serán
capaces de cuantificar las proteínas séricas totales y fraccionadas, en personas normales
y/o con procesos patológicos.

3. REACTIVOS A UTILIZAR:

Kit para determinar proteínas totales

4. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento

4.1 Determinación de Proteínas Totales

CONDICIONES DE REACCIÓN
- Longitud de onda: 540nm en espectrofotómetro o en fotocolorímetro con
filtro verde (520-560nm).
- Temperatura de reacción: 37C.
- Tiempo de reacción:15 minutos.
- Volumen de muestra: 10 ul.
- Volumen de Reactivo Biuret: 1.0ml.
- Volumen final de reacción: 1,1 ml.
25

PROCEDIMIENTO:
En tres tubos de fotocolorímetro marcados B (Blanco).
S (Standard) y D (Desconocido), colocar:

B S D
Suero Patrón - 10 ul -
Muestra - - 10 ul.
Reactivo Biuret 1,0 ml. 1,0 ml. 1,0 ml.

Mezclar e incubar 10 minutos a 37C. Leer en espectrofotómetro a 540 nm. En


fotocolorimetro con filtro verde (520-560 nm) llevando a cero con el Blanco de
Reactivo.

4.2 Determinación de Albúmina.

CONDICIONES DE REACCIÓN:
- Longitud de onda: 540 nm. En Espectrofotómetro
- Temperatura de reacción: 15-28C.
- Tiempo de reacción: 5 minutos.
- Volumen de muestra: 10 ul.
- Volumen de Reactivo BCG: 1 ml.
- Volumen final de reacción: 1,1 ml.

PROCEDIMIENTO:
En tres tubos de fotocolorímetro marcados B(Blanco).
S (Standard) y D (Desconocido), colocar:

B S D
Suero Patrón - 10 ul -
Muestra - - 10 ul.
Reactivo BCG 1ml. 1 ml. 1 ml.

Mezclar, mantener los tubos entre 15 y 28C durante 5 minutos. Leer en


espectrofotómetro a 540 nm llevando a cero con el Blanco de Reactivo.

CALCULOS DE LOS RESULTADOS:

Proteínas Totales (g/dl) = (D - B) x F

Albúmina: (g/dl) = (D - B) x F

Globulina: = Prot. Totales – Albúmina

Relación A/G = Albúmina (g/dl) .


PT (g/dl) – Alb. (g/dl)
26

5. EVALUACION:

5.1. CUESTIONARIO

1. ¿Qué importancia clínica tiene la determinación de las proteínas séricas totales y


las fracciones albúmina y globulinas.
2. ¿Qué importancia tiene determinar la relación albúmina/globulinas, en clínica?
3. ¿En que se basa la determinación de las proteínas totales y fraccionadas en
nuestro experimento?.
4. ¿Qué importancia clínica tiene el diverso origen de las proteínas séricas?.
5. ¿Qué presunciones diagnósticas de laboratorio plantearía usted en base a sus
resultados obtenidos?.

CUANTIFICACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ÚREA EN LA SANGRE

1. INTRODUCCION:

La úrea es el principal producto final del catabolismo de las proteínas, es extremadamente


difusible y consecuentemente se distribuye igual en el agua de todos los tejidos con la
posible excepción de una suave acción diurética, la úrea normalmente no tiene función
útil en el organismo, es excretado casi enteramente por los riñones. La úrea en el plasma
es filtrada por los glomérulos renales pero en condiciones normales aproximadamente el
40% de este filtrado regresa por difusión a la sangre. La importancia clínica de la úrea
viene del hecho de una elevada concentración sanguínea puede estar asociada con una
mala función renal. La capacidad del hígado para formar úrea es una de las últimas
funciones que se pierde cuando ocurre extenso daño hepatocelular.

La concentración de la úrea en la corriente sanguínea es el resultado del balance entre el


grado de degradación de las proteínas y el grado de eliminación por los riñones. Cuando
la dieta es adecuada en calorías y en proteínas, la capacidad del organismo para utilizar
proteínasexógena para síntesis y almacenamiento es limitada. En estas condiciones la
proteína ingerida en exceso es catabolizada, lo que se evidencia por el incremento de la
úrea en sangre y en la excreción urinaria de úrea y amonio.

Los valores normales de úrea en suero (como nitrógeno ureico) es de 9 - 19 mg/100ml


dependiendo en gran proporción de la ingesta de proteínas, mientras que es comunmente
aceptado para sangre total de 9 a 17 mg/100ml (20 a 40 mg de urea/100ml).
La edad y el sexo tienen poca influencia sobre la concentración de nitrógeno ureico. En
ausencia de procesos patológicos la principal determinante es la cantidad de proteína
ingerida y catabolizada.
Concentraciones incrementadas de nitrógeno ureico ocurre en numerosas condiciones
patológicas cuya causa puede ser: 1) Producción incrementada en el curso de un
catabolismo acelerado de las proteínas. 2) Eliminación disminuida como resultado de
una mala función renal, 3) Por combinación de estos dos procesos.

Las principales condiciones en las cuales puede estar incrementada la concentración de


úrea en sangre son: excreción inadecuada y generalmente debido a enfermedad renal u
obstrucción urinaria. Están incrementados los niveles de nitrógeno ureico en sangre en:
27

nefritis aguda y pueden variar de 25 a 160 mg/100ml.

Ocurre retención de urea con destrucción parenquimatosa extensa del tejido renal en 1)
Pielonefritis, 2) Nefroesclerosis avanzada, 3) Tuberculosis renal, 4) Necroisi cortical
renal, 5) Supuración, 6) Neoplasias y 7) Gota crónica. Además una evaluación
moderada sin compromiso renal puede ocurrir sin gran cantidad de proteínas son
degradadas como sucede en 1)Stress, 2) Infarto del miocardio, 3) Ulcera péptica muy
sangrante, etc.

La concentración disminuida de úrea en sangre es causada por producción disminuida. Se


presenta algunas condiciones como: a) Mal nutrición proteica, b) En los últimos meses
de gestación, c) En el estado pre morten de 1a atrofia amarilla aguda. En el último
estaddío de esta enfermedad la concentración de úrea cae, mientras que los aminoácidos
se elevan, d) Ciclo de la úrea deficiente.

Los resultados se pueden reportar como:


Nitrógeno ureico x 2,14 = UREA
Urea x 0,4665 = Nitrógeno ureico.
Aunque ambas determinaciones son muy frecuentes en suero los resultados son
convencionalmente reportados como nitrógeno ureico en sangre. Siendo las
concentraciones de úrea en sangre total, suero o plasma, muy similares, no tiene
significado clínico especial el hecho que la determinación se haga en sangre total o en
suero.

La finalidad de la presente práctica es cuantificar las concentraciones sanguíneas de úrea


por el método de la ureasa y con la adición del reactivo de Nessler, en personas normales
y/o con procesos patológicos.

2. OBJETIVOS:

Dada una muestra problema de sangre, los participantes serán capaces de determinar la
concentración de úrea por el método de la ureasa y el reactivo de Nessler, de acuerdo a
las especificaciones del instructivo.

3. REACTIVOS A UTILIZAR:
Kit para determinar Urea

4. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento

PROCEDIMIENTO
TECNICA EN SUERO O PLASMA
En tres tubos de fotocolorímetro marcados B (Blanco), S (standard) y D
(Desconocido) colocar una o dos gotas de agua y agregar:
28

COMPONENTES B S D
Standard - 20 ul -
Suero o Plasma - - 20 ul.
Ureasa 1 gota 1 gota 1 gota
Mezclar por agitación suave e incubar 5 minutos a 37C. Luego agregar:
Reactivo 1 1 ml 1 ml 1 ml
Reactivo 2 1 ml 1 ml 1 ml
Mezclar por agitación suave e incubar 5 minutos a 37C. Luego agregar:
Agua destilada 10 ml. 10 ml. 10 ml.

Mezclar por inversión y retirar del baño. Después de 10 minutos leer en


fotocolorímetro con filtro verde (510-550nm) o en espectrofotómetro a 540 nm,
llevando a cero con el Blanco.

CALCULOS:
Urea (g/l) = (Abs. Desconocido - Abs. Blanco) x F

Donde: 0,60 g/l


F = ---------------------------------------
Abs. Standard - Abs. Blanco

5. EVALUACION:

. CUESTIONARIO

1. ¿Qué importancia clínica tiene para usted, conocer las concentraciones séricas
de úrea?.
2. ¿Qué influencia tiene la ingesta proteica sobre concentración sérica de úrea?.
3. ¿En relación a las concentraciones séricas de úrea y NH4+. Señale las
características comunes que se encuentran en los defectos enzimáticos
hereditarios del ciclo de la úrea.
4. ¿Qué alteraciones en las concentraciones séricas de úrea y NH4+ podrían
encontrarse en el coma hepático?.
5. ¿Cuál es la importancia metabólica de la existencia del ciclo de la ornitina en el
hígado de los seres humanos?.
6. ¿Cuál es la importancia metabólica que en el hígado humano exista una relación
entre el ciclo de los ácidos tricarboxílicos y el ciclo de la ornitina?

DETERMINACIÓN DE CREATININA SÉRICA

1. INTRODUCCIÓN.

La creatina precursora de la creatinina aumenta en el cuerpo humano fundamentalmente


por síntesis aunque una pequeña cantidad preformada es ingerida con los alimentos. En
los riñones la porción amidina de la arginina se combina con glicina para formar ácido
guanino acético el cual es luego metilado en el hígado para formar creatina. El grupo
metil lábil es proporcionado por metionina, colina u otros donadores de metilo. La
29

creatina así formada es transportada principalmente a las células musculares donde es


fosforilada en creatina fosfato (fosfocreatina) un compuesto de gran importancia en el
mecanismo de la contracción y sirve como fuente de energía. La creatina aparece en el
plasma de adultos masculinos en pequeñas concentraciones, esta presente a niveles
ligeramente más altos en el plasma de mujeres y niños.

Aproximadamente 2% de la creatina fosfato muscular es convertida en creatinina


diariamente; la cantidad total depende de la masa muscular. Una pequeña cantidad de
creatinina preformada es ingerida con los alimentos, pero esta fuente exógena no tiene
efecto perceptible sobre los niveles séricos. La creatinina es fácilmente difusible y es
igualmente distribuida en el agua corporal. Es excretada fundamentalmente por el riñón
el cual clarifica el plasma de creatinina; sólo pequeñas cantidades son eliminadas por las
heces. Las concentraciones de creatinina en suero no es afectada por la dieta,
catabolismo de proteínas, edad, sexo o ejercicios. Elevadas concentraciones se producen
solamente cuando la función renal está muy alterada por factores intrínsecos o
extrínsecos y aunque el mismo tipo de información acerca del diagnóstico y pronóstico
se obtiene por la determinación de nitrógeno ureico o creatinina, esta última
determinación se prefiere por la siguientes razones: 1)La determinación de creatinina
proporciona más ayuda e información relacionada con el estado de la función renal
porque los niveles de creatinina sérica depende del grado de excreción ya que la
producción endógena es constante.

Aunque hay evidencia que se produce alguna depresión en el grado de formación de


creatinina cuando los niveles séricos se elevan a concentraciones por encima de 6
mg/100 ml, hay aun más variaciones en el grado de catabolismo proteica y formación de
urea. 2) El suero es depurado de creatinina en el riñón por el grado de filtración
glomerular proporcionando una buena base para el test de clearance. En cambio la úrea
es depurada aproximadamente en 60% de grado de filtración glomerular a causa de su
difusión retrógada en los tubulis. La concentración normal en suero varía de 0,6 a 1,2
mg/100 ml. En la sangre total las concentraciones son mayores y varían de 1 a 2 mg/100
ml.

Una concentración de creatinina sérica por encima de 1,5 mg/100 ml definitivamente


indica deformación o excreción de orina, condiciones clínicas caracterizadas por
azoemia causada por excesiva degradación de proteínas muestra poco incremento en la
cretinina en los niveles de creatinina sérica (o úrea) no necesariamente indican un
proceso de enfermedad renal; factores extrínsecos al riñón pueden ser responsables para
tal elevación. La causa que incrementan los niveles de creatinina son de origen renal y
extrarrenal. La actividad excretoria representa la suma de la acción individual de las
nefronas. La insuficiencia renal puede ser producida por pérdida parcial de la función de
un gran número de nefronas o por pérdida completa de la función de un pequeño número
de nefronas. El grado de insuficiencia depende entonces del número de nefronas
comprometidas y del grado de lesión involucrado.

Factores extrarrenales que interfieren la formación y eliminación de orina son referidos


como azoemia pre-renal y azoemia post-renal.

I. Azoemia pre-renal con reducción de filtración glomerular y del flujo sanguíneo


renal es la bases del incremento de los niveles de creatinina y otras anormalidades;
tienen como causas:
30

a. Insuficiencia cardíaca congestiva.


b. Depleción de agua y sodio (deshidratación) causada por vómito y diarreas, fístula
gastrointestinal excesiva sudoración con deficiente ingestión de sal, Diabetes
mellitus no controlada, Diabetes insípida, enfermedad de Adisson, disminución
de la presión sanguínea intraglomerular.
c. Shock, además de disminuir el flujo sanguíneo intraglomerular interfiere con la
filtración glomerular.

II. Azoemia post renal: Obstrucción del tracto urinario que impide la eliminación
de orina produce azoemia e incremento de creatinina por ejemplo: 1) hipertrofia
prostática, 2) neoplasias que comprimen ambos uréteres, 3) litiasis obstructiva
bilateral, 4) anormalidades conjuntas. La disminución de la creatinina no tiene
significación clínica.

La creatinina en medio alcalino reacciona con el ácido pícrico para dar un tautómero
de picrato de creatinina de color anaranjado (reacción de Jaffe).

Fundamentos del Método: La creatinina reacciona con el picrato alcalino en medio


tamponado, previa desproteinización con ácido pícrico, obteniéndose un cromóforo
que se mide a 540 nm.

2. CAPACIDAD
Los participantes cuantifican las concentraciones de creatinina sérica por medio de la
reacción de Jaffe (reacción del ácido pícrico en medio alcalino).

3. REACTIVOS A UTILIZAR.
Reactivo 1: Acido pícrico 41,4 mmol/l
Reactivo 2: Buffer glicina/NaOH 1 mol/l, pH final 12,4.
Standard: Solución de creatinina 20 mg/l.

4. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento


PROCEDIMIENTO
En caso de que la muestra a utilizar sea en suero, debe efectuarse una desproteinización
de la siguiente manera: a 0,4 ml de suero agregar 2,0 ml de Reactivo 1. Mezclar por
inversión. Dejar reposar 10 minutos y centrifugar a 3000 r.p.m. durante 5 minutos como
mínimo.
COMPONENTES B S DS
Desproteinizado - - 1,5 ml.
Standard - 0,25ml -
Agua destilada 0,5 ml 0,25 ml. -
Reactivo 1 1 ml 1 ml -
Reactivo 2 0,25 ml 0,25 ml 0,25 ml

Mezclar por inversión. Incubar 20 minutos a temperatura ambiente. Luego leer en


espectrofotómetro a 510 nm o en fotocolorimetro con filtro verde (500-540 nm),
llevando a cero el aparato con agua destilada.
31

ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL.


El color de la reacción es estable durante 10 minutos por lo que la absorbancia debe ser
leída dentro de ese lapso. El Blanco y el Standard pueden leerse hasta los 60 minutos.

CALCULO DE LOS RESULTADOS.

Corregir las lecturas S y D restándoles el Blanco (B).


Creatinina en suero (mg/l) = DS x F

20 mg/l
F = --------------------
S
.
Donde:
0,020 g/l = concentración del Standard

5. EVALUACIÓN FINAL (Informe escrito)

1. ¿Qué información o presunción obtiene al dosar la creatinina


sérica?
2. ¿Por qué se prefiere suero y no sangre total para la determinación
de creatinina?
3. Metabólicamente ¿Qué expresa una concentración sérica de
creatinina?
4. En qué casos aumenta la cifra de creatinina sérica?
5. Qué importancia tiene, determinar el clearence de creatinina?