UNIVERSIDAD DEL MAGDALENA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

PROGRAMA DE MEDICINA

TALLER TECNICAS DE PCR

PRESENTA:

DIEGO ARMANDO PEREZ BLANCO - 2021161005

CARLOS ANDRES SERRANO HERNANDEZ - 2021161039

ASIGNATURA:

BIOLOGIA II GRUPO I

SANTA MARTA (MAGDALENA)

2021
 PARTE I

A. Polimorfismos de restricción
Polimorfismos del tipo 1 (RFLPs).- Desde mediados de los setenta, con la
introducción de las endonucleasas de restricción en el análisis genético molecular
por el grupo del premio Nobel Nathans (Nathans and Smith, 1975), cualquier
molécula de ADN puede ser cortada en sitios específicos produciendo unos
fragmentos llamados por ello de restricción. Estas enzimas son un tipo especial de
endonucleasas (tipo II) capaces de reconocer secuencias específicas del ADN
(dianas de restricción) y catalizar la ocurrencia de cortes diplotómicos 11 (en
ambas cadenas). Los fragmentos liberados se pueden caracterizar mediante
electroforesis en geles de agarosa, y si se realiza el mismo tipo de digestiones en
el ADN de diferentes individuos, se pueden comparar los fragmentos equivalentes
mediante hibridación molecular con sondas específicas utilizando la técnica de
Southern (Southern, 1975)
El polimorfismo del tipo 1 (RFLPs) se produce cuando la secuencia de
reconocimiento de una endonucleasa se ve afectada por una mutación puntual, y
se pierde por consiguiente la capacidad de reconocimiento y corte en ese lugar. La
consecuencia inmediata es el cambio en los patrones electroforéticos que
presentan los fragmentos de restricción. En la figura la se esquematiza la
identificación de dos variantes alélicas de un locus RFLP con la sonda S. Con esta
nueva metodología se empezó a comprobar inmediatamente que los genomas
tenían· niveles de variación muy superiores a los estimados mediante análisis de
proteínas. Jeffreys (1979) estimó que 1 de cada 100 nucleótidos de secuencias no
codificantes podía ser polimórfico. Estudios sistemáticos llevados a cabo con
secuencias génicas (globinas y albúmina) y no codificantes, apuntaban igualmente
una diversidad genética mayor que la demostrada con el análisis de proteínas: 1
de cada 250 o 500 nucleótidos acababa presentando alguna variación (Botstein et
al., 1980). La probabilidad de encontrar una variante de un fragmento de
restricción definido por una endonucleasa con una diana de 4 pares de bases es
del 12,3%. Si la diana es de 6 pares de bases esta probabilidad aumenta hasta el
17.7 %

B. Southern blot

Southern blot. Técnica analítica utilizada en biología molecular para detectar o identificar
ADN de interés a partir de una muestra compleja de ADN. Es también conocida como
hibridación Southern o simplemente Southern, debido al nombre de su inventor, Edwin
Southern, destacado biólogo molecular inglés. Como procedimiento de laboratorio, el
Southern blot se puede utilizar para analizar el ADN total de un organismo, también
conocido como su genoma, con el fin de identificar una secuencia específica de interés.
El proceso implica la transferencia de fragmentos de ADN separados por electroforesis a
una membrana portadora que normalmente es nitrocelulosa y la posterior detección del
fragmento de ADN diana mediante la hibridación de la sonda. La hibridación se refiere al
proceso de formación de una molécula de ADN bicatenario entre una sonda de ADN
monocatenario y un ADN diana monocatenario. Dado que la sonda y el ADN diana son
complementarios entre sí, la reacción es específica, lo que ayuda a detectar el fragmento
de ADN específico.

Procedimiento

1. Extracción y purificación del ADN. Se realiza la purificación del ADN de

interés según los procedimientos estándar de aislamiento o utilizando kits
comerciales que permiten la extracción de fuentes variadas como células de
mamíferos, plantas, bacterias, hongos.

2. Digestión del ADN con endonucleasas de restricción. El ADN extraído de la

muestra se trata con endonucleasas de restricción, enzimas que cortan las hebras
de ADN de alto peso molecular en fragmentos más pequeños. Se pueden usar
una o más enzimas de restricción.
3. Electroforesis en gel de agarosa. Tras la digestión del ADN, los fragmentos
de ADN resultantes se separan según su tamaño mediante electroforesis en geles
de agarosa. Durante el proceso, las moléculas de ADN, que poseen carga
negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al avanzar, su velocidad de migración
se ve reducida por la matriz del gel de agarosa. Las moléculas más pequeñas se
mueven más deprisa a través de los poros del gel que las de mayor tamaño.
Como resultado se produce una separación continua de los fragmentos de ADN
de acuerdo a su tamaño.

4. Desnaturalización. Los fragmentos de ADN ya separados son bicatenarios por

naturaleza por lo que son tratados con una solución alcalina para
desnaturalizarlos, mientras permanecen en el gel de agarosa. Tras la
neutralización de esta, se obtienen los fragmentos de ADN monocatenario
adecuados para la hibridación con la sonda.

5. Transferencia. Los fragmentos desnaturalizados se transfieren luego a una

membrana de filtro de nailon o nitrocelulosa, lo que se hace colocando el gel sobre
un papel de filtro saturado con tampón y luego colocando la membrana de filtro de
nitrocelulosa en la parte superior del gel. Finalmente, se colocan unos papeles de
filtro secos encima de la membrana. Los fragmentos son empujados hacia la
membrana del filtro de nitrocelulosa por acción capilar y dan como resultado la
impresión de contacto del gel.

6. Hibridación. A continuación, la membrana se expone a una sonda de

hibridación que es un fragmento de ADN con una secuencia específica cuya
presencia en el ADN diana se va a determinar. El ADN de la sonda se marca para
que pueda detectarse, normalmente incorporando radiactividad o marcando la
molécula con un tinte fluorescente o cromogénico.

7. Lavado. Después de la hibridación, la membrana se lava a fondo con un

tampón para eliminar la sonda que está unida de forma inespecífica o cualquier
sonda no unida que esté presente.

8. Autorradiografía. Las regiones hibridadas se detectan colocando la membrana

de nitrocelulosa en contacto con una película fotográfica que muestra las
moléculas de ADN hibridadas. El patrón de hibridación se visualiza en una película
de rayos X por autorradiografía en el caso de que se use una sonda radiactiva o
fluorescente o por el desarrollo de color en la membrana si se usa un método de
detección cromogénico.

C. Clonación

La clonación es el proceso mediante el cual, de manera no sexual, se

obtienen dos células, moléculas u organismos idénticos ya desarrollados.
Un clon es un organismo copia en cuanto a su genética.
La clonación parte de tres conceptos principales:
  El proceso de clonación parte de un organismo desarrollado ya que
se busca hacer una copia exacta de ese organismo.

 Dicha copia se obtiene mediante una forma no sexual, ya que ésta

no permite realizar copias idénticas por la diversidad de la
naturaleza.

 Lo que primero se clona son las células, y lo que se necesita es la

secuencia de ADN del organismo.
La clonación molecular: por ejemplo, es utilizada para experimentos
biológicos como por ejemplo para la producción masiva de proteínas.
En 1997 fue un suceso de conocimiento mundial la clonación de un
mamífero (una oveja llamada Dolly) que trajo controversias en todo el
mundo. Por un lado, una gran admiración y por otro, un fuerte rechazo y
crítica. De todos modos, la clonación en plantas ya era conocida un siglo
antes.
La clonación en humanos fue prohibida por la UNESCO.  En 1997 se
aprobó la Declaración Universal sobre el Genoma Humano y los
Derechos Humanos. El artículo 11 dispone claramente que no deben
permitirse en los países las prácticas contrarias a la dignidad del ser
humano, lo que incluye la clonación.
Algunos de los fines de la clonación son:

 En los animales, mejorar la fertilidad de las especies e

investigación.

 Investigación de enfermedades para conseguir posibles curas.

 Mejorar la producción de medicamentos.

 Realizar transplantes de órganos.

Tipos de clonación
 Clonación celular: Como el mismo nombre lo dice, es el proceso por el cual se
clonan las células, creándose cultivos de las mismas.
 Clonación molecular: Este tipo de clonación se utiliza, principalmente, para
llevar a cabo todo tipo de experimentos.
 Clonación natural: Es el tipo de reproducción en el que sólo hay un progenitor
y la misma es asexual. Se da en los animales unicelulares y algunas plantas. Esta
clasificación incluye a los gemelos.
 Clonación terapéutica Su objetivo es poder reproducir tejidos y órganos con
fines médicos.
 Clonación reproductiva: Su fin es reproducir un ser humano igual a otro. Sin
embargo, este procedimiento, aunque posible, es totalmente ilegal. El ejemplo
más famoso de esto fue la oveja Dolly.

 Clonación de especies: Por lo general se enfocan a la reproducción de

animales ya extintos. Sin embargo, estos procedimientos no han tenido mucho
éxito hasta hoy, puesto que los recién nacidos han muerto rápidamente. El
principal conflicto en este tipo de clonación es la conservación del ADN de las
especies, ya que no se han conservado adecuadamente

D. Secuenciación de ADN

 La secuenciación del ADN es una técnica de laboratorio utilizada para

determinar la secuencia exacta de las bases (A, C, G y T) en una molécula
de ADN. La secuencia de bases de ADN lleva la información que una célula
necesita para ensamblar proteínas y moléculas de ARN. La información de
la secuencia de ADN es importante para los científicos que investigan las
funciones de los genes. La tecnología de secuenciación de ADN se hizo
más rápida y menos costosa como resultado del Proyecto del Genoma
Humano.
 El ADN consiste en una secuencia lineal de nucleótidos, o bases, que por
simplicidad se cita por las primeras letras de sus nombres químicos - A, T,
C y G. El proceso de deducir el orden de los nucleótidos en el ADN se
denomina secuenciación del ADN. Dado que la secuencia de ADN confiere
la información que utiliza la célula para la fabricación de las moléculas de
ARN y proteínas, disponer de la secuencia de ADN es clave para entender
cómo funcionan los genomas. La tecnología de secuenciación de ADN se
hizo más rápida y menos costosa, a partir del Proyecto del Genoma
Humano. Y otros progresos más recientes han aumentado aún más la
 eficiencia de la secuenciación del ADN.

E. PCR en tiempo real

La PCR en tiempo real es una variación de la técnica de PCR estándar que se usa
comúnmente para cuantificar DNA o ARN en una muestra. En la PCR punto final,
la detección y la cuantificación de la secuencia amplificada se realizan al final de la
reacción después del último ciclo de PCR, e implican un análisis posterior a la
PCR, como electroforesis en gel y análisis de imágenes.
En la PCR cuantitativa o en tiempo real, a menudo abreviada a PCR en tiempo
real o qPCR, el producto de la PCR se mide en cada ciclo. Al monitorear las
reacciones durante la fase de amplificación exponencial de la reacción, los
usuarios pueden determinar la cantidad inicial del objetivo con precisión alta.
Cómo funciona la PCR en tiempo real
En la PCR en tiempo real, la cantidad de DNA se mide después de cada ciclo a
través de señal fluorescente creciente en proporción directa al número de
moléculas de producto de PCR.
Los datos recopilados durante la fase exponencial de la reacción proporcionan
información cuantitativa sobre la cantidad inicial del objetivo de amplificación. Si
una secuencia particular (DNA o ARN) es abundante en la muestra, se observa
amplificación en ciclos anteriores; si la secuencia es escasa, se observa
amplificación en ciclos posteriores.
Los indicadores fluorescentes utilizados en la PCR en tiempo real incluyen
colorantes de unión al DNA bicatenario (dsDNA) o moléculas de colorante unidas
a iniciadores o sondas de PCR que se hibridan con productos de PCR durante la
amplificación.
El cambio de fluorescencia en el transcurso de la reacción se mide con un
instrumento que combina ciclos térmicos con barrido de tintes fluorescentes. Al
representar la fluorescencia frente al número de ciclo, el instrumento de PCR en
tiempo real genera una gráfica de amplificación que representa la acumulación de
producto durante toda la serie de PCR.

Las ventajas de la PCR en tiempo real incluyen:

 Capacidad para monitorear el progreso de los ciclos individuales de
amplificación, a medida que ocurren en tiempo real.
 Capacidad para medir con precisión la cantidad de amplicón en cada ciclo,
en comparación con un estándar de dilución conocido, lo que permite una
cuantificación altamente precisa de la cantidad de material de partida en las
muestras.
 Un mayor rango dinámico de detección.
 La amplificación y la detección se realizan en un solo tubo, lo que elimina
las manipulaciones posteriores a la PCR.
Etapas en la PCR en tiempo real
Hay tres pasos principales que componen cada ciclo en la PCR en tiempo real.

1. Desnaturalización
La incubación a alta temperatura se utiliza para “separar” dsDNA en hebras
simples y aflojar la estructura secundaria en el DNA monocatenario (ssDNA). La
temperatura más alta que puede soportar la DNA polimerasa sin perder fidelidad
suele ser de alrededor de 95 °C.
2.     Alineamiento (hibridación)
Durante el alineamiento, las secuencias complementarias tienen la oportunidad de
hibridar, por lo que se usa una temperatura apropiada basada en la temperatura
de fusión (Tm) del iniciador.

3.     Extensión
La actividad de la DNA polimerasa es óptima a 70-72 °C, y la extensión del
iniciador se produce a velocidades de hasta 100 bases por segundo. Cuando un
amplicón es pequeño, este paso a menudo se combina con el paso de
alineamiento, aplicando una temperatura de 60 °C.

F. RT-PCR
La reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR, del inglés
Reverse transcription polymerase chain reaction) (también, reacción en cadena de la
polimerasa con transcriptasa reversa y reacción en cadena de la polimerasa con
transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa) es
una variante de la PCR, una técnica de laboratorio comúnmente usada en biología
molecular para generar una gran cantidad de copias de ADN, proceso llamado
amplificación (reacción en cadena de la polimerasa). En la RT-PCR, se retrotranscribe
una hebra o cadena o banda de ARN en ADN complementario (ADNc) usando una
enzima llamada transcriptasa inversa o transcriptasa reversa, y el resultado se amplifica
mediante una PCR tradicional. El término PCR en transcripción reversa no debe
confundirse con la PCR en tiempo real, también denominada PCR cuantitativa (Q-PCR),
que en ocasiones, por una mala traducción del inglés, se abrevia de la misma manera
(RT-PCR, por Real Time-PCR), en vez de ReTi-PCR. La amplificación exponencial
mediante PCR en transcripción reversa supone una técnica altamente sensible, que
puede detectar un número de copias de ARN muy bajo.
Esta técnica es muy precisa, ya que se diseñan primers (también llamados cebadores)
específicos para amplificar una secuencia determinada.1 El uso de grandes bancos de
datos biotecnológicos como el Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI)
brinda un exhaustivo ensayo de predicciones para las secuencias franqueantes diseñadas
y otras especificaciones que hacen de esta técnica la más utilizada hoy en día para
identificar la existencia de la secuencia buscada.
Los principales usos de la RT-PCR están relacionados con el campo del diagnóstico
molecular y con la investigación científica. Puede utilizarse como método de detección
molecular de genes, para estudiar el genoma de virus de ARN como los retrovirus (por
ejemplo, el VIH), el virus de la gripe (el virus de la influenza, Orthomyxoviridae)[cita
requerida], o el SARS-CoV-2.
Otro de sus usos se relaciona con la cuantificación de la expresión génica, mediante la
combinación de esta técnica con el análisis de Northern blot.
Una de las características más importantes es que en el proceso de RT-PCR, el ADNc
generado ya no lleva los intrones que sí tendría el ADN original. De este modo, al
expresar el ADNc producto de la RT-PCR, se generará un ARNm formado exclusivamente
por exones. Esto ha permitido darle a esta técnica uno de sus usos más importantes:
insertar genes eucariota en organismos procariota.
Cómo funciona el RT-PCR?
Todo inicia con el uso de un cotonete u otro dispositivo para la extracción de
material biológico de la garganta o nariz del sujeto. El material se almacena con un
buffer que rompe las membranas celulares, permitiendo la salida del material
hacia el exterior. Se esperaría que, en la muestra de un contagiado, el material
genético del virus salga de la célula.
El material se introduce después en una máquina especializada para llevar al cabo
el examen. Aquí, las hebras de ácido ribonucleico (ARN) viral son detectadas por
una cadena de ácidos nucleicos, denominada partidor (primer, en inglés), que se
le une a una región específica. Estos primers contienen un marcador fluorescente
adjunto. Posteriormente, una transcriptasa inversa (una proteína con un rol
particular) extiende al primer, creando un ADN complementario y libera el
marcador fluorescente
Esta doble hélice que se crea es separada inmediatamente después para pasar
por el mismo proceso. Esto amplifica la cantidad de material genético viral y es
detectado por la máquina gracias al incremento en marcadores fluorescentes.
No cualquier centro médico tiene el permiso o la capacidad para llevar al cabo la
prueba de RT-PCR. En Estados Unidos se requiere aprobación federal que
compruebe que el centro médico cumple con los estándares de calidad, tiene a los
técnicos entrenados y un alto nivel de esterilidad en el laboratorio, para poder
realizar la prueba.
 PARTE II
1. Polimorfismos de restricción: Una de las aplicaciones que pueden
destacarse acerca de esta técnica es la de determinar el estado de
enfermedades genéticas, en el artículo adjunto N°1 podremos encontrar
una investigación acerca de las enfermedades Mycoplasma
genitalium y Ureaplasma urealyticum en pacientes femeninas con
complicaciones genitales por reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
-polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)

2. Southern blot: Esta técnica puede ser utilizada por ejemplo para la
detección del tamaño y cantidad de un fragmento de ADN de interés, en
este caso se presenta el artículo N°2 que utiliza esta técnica para la
validación de alelos obtenidos por recombinación homóloga.

3. Clonación: En la denominada clonación verdadera se transfieren núcleos

procedentes de células de individuos ya nacidos a óvulos o cigotos
enucleados, originando individuos idénticos entre sí y muy parecidos al
donante (del que se diferencian en mutaciones somáticas y en el genoma
mitocondrial, que procede del óvulo receptor). Una de las aplicaciones más
famosas y controversiales que podemos destacar es la oveja Dolly, caso
del cual podemos encontrar evidencia en el artículo N°3 adjunto.

4. Secuenciación del ADN: Dentro de las aplicaciones de la secuenciación

del ADN podemos encontrar la detección de mutaciones, Secuenciación de
ADNs fósiles, diagnóstico de enfermedades genéticas, Identificación de
especies y control de cruces entre animales, entre otras. En el artículo N°4
podremos encontrar como se ayuda a diagnosticar la leucemia mieloide
aguda (LMA).

5. PCR en tiempo real: La PCR en tiempo real ofrece sensibilidad,

especificidad y un amplio rango dinámico para detectar ácidos nucleicos
diana, lo que la convierte en una tecnología útil y poderosa para
aplicaciones de investigación que cubren el espectro de la biología, desde
la investigación básica hasta la medicina traslacional y la biología aplicada.
Por ende, en el artículo N°5 encontraremos un ejemplo de la aplicación de
la PCR.