Laboratorio Nº 12

CONSERVACIÓN DE CULTIVOS

1. INTRODUCCIÓN:

En todo laboratorio de microbiología es fundamental el

mantenimiento y conservación de las colecciones de
microorganismos con las que trabajamos ya que, obviamente, son
nuestro reactivo primordial.

Existen una gran variedad de métodos de mantenimiento y

conservación de los microorganismos cuya utilización va a depender
en parte del tiempo previsto (Mantenimiento  cortos períodos de
tiempo, días; Conservación  Largos períodos de tiempo, años) y en
parte de las características de los diferentes microorganismos
(bacterias, hongos, virus, algas, protozoos (2)(3)(4).

La conservación de cultivos microbianos es esencial para las

actividades de investigación o industriales basadas en la actuación de
estos microorganismos. Las cepas valiosas se tienen que conservar
durante largos períodos de tiempo, libres de cambios fenotípicos
adversos. Implica largos períodos libre de cambios fenotípicos, sobre
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todo con respecto a la capacidad de alta producción de productos

metabólicos primarios o secundarios (1).

Tres objetivos hay que alcanzar para conservar correctamente las

cepas microbianas en los laboratorios de microbiología, estos son:

- Que el cultivo a conservar sea puro, evitando que se produzcan

contaminaciones durante el proceso de contaminación;
- Que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos 70 –
80% de las células, y
- Por último, que éstas células permanezcan genéticamente
estables, sin cambios en sus características.

Los dos primeros objetivos no son muy difíciles de conseguir cuando

se conoce bien la técnica microbiológica, pero el tercero puede
presentar dificultades, y éste es el motivo por el cual existen varios
métodos de conservación para los microorganismos, y ninguno de
ellos es de utilización general.

Una forma de clasificar a los varios métodos de conservación que

existen es agrupándolos en tres apartados, que son: Métodos de
elección o de conservación a largo plazo, métodos alternativos y
métodos restringidos. Las técnicas de conservación que se han

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desarrollado para la aplicación de éstos métodos son varias: 1) el

subcultivo de células activas, 2) la desecación de cultivos, 3) la
liofilización, 4) la congelación mecánica (-5 ó –80ºC) y 5) la
ultracongelación en vapor de nitrógeno líquido (-156ºC) o en
nitrógeno líquido (-196ºC) (1)(2)(3)(4).

Los métodos de elección son los mejores porque en ellos se

paraliza el crecimiento de las células microbianas, pero éstas no han
muerto; así se garantiza al máximo la estabilidad genética, al evitarse
la aparición de generaciones sucesivas. Aunque es de tener en cuenta
que aún así no se puede descartar algún cambio originado por el
método preparatorio en si mismo. Un tipo de éstos métodos lo
constituye el método de congelación ordinaria (congelación en
refrigeración)

En la conservación en refrigeración el objetivo es incrementar la

vida útil de los cultivos, y en consecuencia incrementar sus
posibilidades de conservación. Generalmente hace falta resiembras en
medio fresco a intervalos regulares. Es un procedimiento laborioso y
que consume mucho tiempo. El intervalo entre las transferencias
depende de la temperatura y la humedad de almacenamiento. Los
tubos de cultivos almacenados en contenedores que no permiten la
pérdida de humedad pero si el intercambio de gases, a una

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temperatura entre 5 –8ºC necesitan transferirse cada 6 – 8 meses. Las

condiciones que permiten que se dé una deshidratación rápida del
cultivo requieren intervalos de transferencia más cortos. En éste
método el cultivo en un tubo o vial es colocado en el compartimiento
de un refrigerados o en un congelador ordinario con temperatura
oscilando desde –5 a –20ºC; aquí la viabilidad de varios
microorganismos puede ser mantenida por 1 a 2 años (1).

Los métodos alternativos son los que se utilizan cuando no se

pueden emplear los métodos de elección, bien por carecer de los
equipos necesarios, o bien por que la cepa microbiana no resiste los
tratamientos de la conservación por éstos métodos. Conviene tener en
cuenta que nunca se debe usar un único método alternativo, sino que
se recomienda conservar el microorganismo empleando varios de
estos métodos. Constituyen tipos de métodos alternativos los de
conservación por transferencia periódica (subcultivo seriado), los de
inmersión en aceite mineral, etc.

En el método de conservación por transferencia periódica la cepa

microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de
cultivo en el que ha crecido. Aquí las células no pueden permanecer
indefinidamente en el mismo tubo, porque al seguir activas excretan
productos tóxicos del metabolismo que se acumulan, provocando el

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envejecimiento y muerte celular, por lo que es necesario que sean

transferidas a otro tubo con medio de cultivo fresco. Este es el peor
método para conseguir la estabilidad genética, puesto que al estar las
células creciendo hay una alternancia de generaciones, y al cabo del
tiempo las células que se están guardando serán descendientes lejanas
de las células iniciales y es posible que ya no conserven algunas de
sus características. Si se va a utilizar éste método es aconsejable
retardar el envejecimiento y alargar los períodos entre dos siembras.
Esto se puede conseguir de varias maneras como por ejemplo:
disminuyendo la cantidad de inóculo; rebajando la proporción de
algunos nutrientes en el medio de cultivo; inoculando en picadura los
microorganismos que son anaerobios facultativos, ya que el
crecimiento en presencia de oxígeno es más rápido y origina
productos generalmente tóxicos; y almacenando los cultivos a 4ºC-
8ºC. A veces también se suele recubrir el crecimiento con una capa
de aceite mineral estéril. Con esto se consigue también evitar en la
medida de lo posible la desecación del medio de cultivo, que podría
ser tóxico para las células al aumentar su concentración. Hay que
tener en cuenta que los microorganismos muy aerobios, como por
ejemplo los hongos filamentosos, no se pueden guardar en tubos
completamente cerrados. Por último, otro inconveniente que tiene la
transferencia periódica es que la contaminación de los cultivos resulta
más fácil al tener que manejar los tubos a lo largo del tiempo y

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también por la posibilidad de entrada de ácaros en los mismos. En

éste método el microorganismo se resiembra cada cierto tiempo en un
medio adecuado; generalmente se utiliza agar inclinado ya que en
medio sólido se detectan mejor los contaminantes que en medio
líquido y el hacerlo inclinado tiene por objeto el evitar la desecación
rápida del medio. Éste método es válido para cortos períodos de
tiempo (semana – 15 días) por lo que deben ser resembrados con
frecuencia lo que incrementa el riesgo de contaminación; además que
al mantenerlos a temperatura ambiente pueden crecer y
espontáneamente cambiar sus características genéticas (mutación,
pérdida de plásmidos, etc.) que pueden afectar el carácter por el que
fueron seleccionados. Estos dos inconvenientes pueden subsanarse
en parte enlenteciendo el metabolismo de los microorganismos al
mantenerlos a 4ºC con lo que su crecimiento es inferior y la
necesidad de hacer subcultivos se prolonga a 1 –3 meses. En
microbiología industrial se recomienda pensar en mantener las
colecciones durante períodos de años y no de meses, por lo tanto se
utilizan otras técnicas que nos ahorran trabajo y disminuyen los
riesgos.

En el método de conservación por inmersión en aceite mineral el

cultivo (agar inclinado o caldo de cultivo) es inmerso en aceite
mineral y almacenado en una posición vertical a 25ºC. El aceite

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puede ser esterilizado en una estufa a 170ºC por 1 a 2 horas. El

subcultivo, fácil de realizar, se hace sobre medio fresco con aguja de
inoculación. Éste método no es recomendado para almacenamiento
de largo tiempo.

Los métodos restringidos engloba métodos no empleados

habitualmente, pero a los que es necesario recurrir a la hora de
conservar grupos de microorganismos muy determinados que no
resisten bien la liofilización o la congelación, como por ejemplo los
géneros bacterianos Spirillum , Rhodospirillum, etc. La desecación
en suelo es un tipo de éstos métodos, es particularmente útil para
conservar microorganismos productores de esporas, por ejemplo
actinomicetos. En éste método hay paralización del crecimiento por
eliminación del agua disponible para las células; aquí la suspensión
de células es añadida al substrato suelo, que previamente es secado y
esterilizado por calentamiento con aire caliente (no utilizar autoclave
y sí calor seco), y se deja secar a temperatura ambiente. El suelo
protegerá a las células al desecar. Los microorganismos productores
de esporas se pueden conservar durante bastante tiempo por éste
método (1)(2)(3)(4).

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2. OBJETIVOS:

- Aplicar el método de conservación por subcultivo en agar, por

inmersión en glicerol y el de conservación en suelo a un microbio
esporulado.
- Evaluar la sobrevivencia del microbio esporulado a través del
tiempo y comparar esta sobrevivencia a diferentes condiciones de
temperatura en los tres métodos de conservación aplicados.

3. MATERIALES:

CONSERVACIÓN POR SUBCULTIVO EN AGAR:

MATERIAL:
- Cultivo de un microbio esporulado
- Medio de cultivo para el microbio esporulado
- Algodón
- Pabilo
- Pipetas
- Placas petri
- Matraz Erlenmeyer
- Aza de drigalsky
- Tubos de ensayo

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- Piceta
- Gradilla
- Horno
- Cocina eléctrica
- Autoclave
- Frigider
- Aza bacteriológica

CONSERVACIÓN EN GLICEROL:

MATERIAL:
- Cultivo de un microbio esporulado
- Glicerol
- Medio de cultivo para el microbio esporulado
- Algodón
- Pabilo
- Pipetas
- Placas petri
- Matraz Erlenmeyer
- Aza de drigalsky
- Tubos de ensayo
- Piceta

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- Gradilla
- Horno
- Cocina eléctrica
- Autoclave
- Frigider
- Aza bacteriológica.

CONSERVACIÓN EN SUELO

MATERIAL:
- Suspensión de un microbio esporulado
- Suelo de jardín cernido
- Medio de cultivo para el microbio esporulado
- Viales o tubos de ensayo
- Algodón
- Pabilo
- Pipetas
- Placas petri
- Matraz Erlenmeyer
- Aza de drigalsky
- Tubos de ensayo
- Piceta

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- Gradilla
- Horno
- Cocina eléctrica
- Autoclave
- Balanza de gramos

4. PROCEDIMIENTO:

A. CONSERVACIÓN POR SUBCULTIVO EN AGAR:

4.1. Sembrar con una aza bacteriológica, por duplicado, un

inóculo del microbio esporulado en su medio de crecimiento
(medio agarificado e inclinado en un tubo de ensayo) e incubarlo
en sus condiciones de crecimiento correspondiente hasta que esté
en plena fase de desarrollo.

4.2. Guardar los tubos de ensayo con las muestras en ellos

presentes, uno a 25ºC y el otro a 4ºC para su conservación.

4.3. Comparar y evaluar los tubos, que están a 25 y a 4ºC

cada cierto tiempo.

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4.4. Para la evaluación tomar con el asa bacteriológica una

pequeña muestra del microbio conservado de ambos tubos en
determinados tiempos (meses o años) para obtener una suspensión
en agua destilada de este microbio y sembrarlo por encamada en
su medio de agar de aislamiento para efecto de comprobar la
sobrevivencia del microbio.

B. CONSERVACIÓN EN GLICEROL:

PROCEDIMIENTO:
4.1. Cubrir con aceite mineral o glicerol el microbio esporulado que
está en plena fase de desarrollo sobre su propio medio de
crecimiento sólido que está en dos tubos de ensayo
4.2. Guardar un tubo de ensayo a 25ºC y el otro a 4ºC para su
conservación.
4.3. Comparar y evaluar los tubos, que están a 25 y a 4ºC el
grado de conservación del microbio esporulado cada cierto
tiempo.
4.4. Para la evaluación tomar con el aza bacteriológica una
pequeña muestra del microbio conservado de ambos tubos en
determinados tiempos (meses o años) para obtener una suspensión
en agua destilada de este microbio y sembrarlo por encamada en

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su medio de agar de aislamiento para efecto de comprobar la

sobrevivencia del microbio.

C. CONSERVACIÓN EN SUELO

PROCEDIMIENTO:
4.1 Preparar una suspensión densa de un microbio esporulado ( hongo
o bacteria esporulada) en agua destilada estéril
4.2. Colocar 5 g de suelo de jardín cernido en un vial o tubo de
ensayo. Tapar el vial o tubo de ensayo con algodón y esterilizarlo
en el horno.
4.3. Inocular 1 ml de la suspensión densa del microbio
esporulado sobre la muestra de suelo contenido en el vial o tubo
de ensayo esterilizado.
4.4. Dejar se seque a 25ºC el suelo humedecido con la
suspensión microbiana contenido en el vial o tubo de ensayo.
4.5. Conservar el microbio inoculado en la muestra de suelo a 25ºC.
4.6. Evaluar el proceso de conservación; para lo cual tomar con el aza
bacteriológica una pequeña muestra del suelo con el microbio
conservado en determinados tiempos (meses o años) para obtener
una suspensión en agua destilada de este microbio y sembrarlo
por encamada en su medio de agar de aislamiento para efecto de
comprobar la sobrevivencia del microbio.

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5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

1. DEMAIN; A.L. and N.A. SOLOMON. 1986. industrial

microbiology and biotechnology. Edit. American Society for
microbiology. Washington, D.C.
2. UNAVARRA. 2005. Microbiología industrial. España.
http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia
%20genral/010- introd%20micro%20industrial.htm
3. USAL. 2005. Microbiología industrial. España.
http:/edición-micro.usal.es/web/SEFIN/MI/tema04MI.html
4. UV. 2005. Conservación. España.
http://www.uv.es/cect/docs/cons.doc

ANEXOS

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CULTIVOS DE Rhizobium CONSERVADOS POR SUBCULTIVO Y

SUELO

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