PRESERVACIÓN DE BACTERIAS, HONGOS FILAMENTOSOS Y LEVADURAS

CON POTENCIAL AGROINDUSTRIAL

PRESENTADO POR
LIZBETH JOHANA PERALTA SALAZAR

PRESENTADO A
ELIANA MENDOZA MENDOZA

UNIVERSIDAD CATÓLICA DE MANIZALES

BIOTECNOLOGÍA
MANIZALES-CALDAS
2021
PRESERVACIÓN DE BACTERIAS, HONGOS FILAMENTOSOS Y LEVADURAS
CON POTENCIAL AGROINDUSTRIAL

RESUMEN
Con el objetivo de esta práctica de conocer los principales métodos de conservación y
preservación de microorganismos de interés agroindustrial, como el método de
criopreservación, el de agua destilada, el de aceite mineral y el de papel filtro para conocer
cómo se comporta y cuál es la metodología adecuada, los criterios a considerar para la
elección de las técnicas más apropiadas de conservación para cada grupo de
microorganismo, de acuerdo a su viabilidad, pureza, observando sus características
macroscópicas y microscópicas y la estabilidad genética.
OBJETIVO GENERAL
Identificar los principales métodos de preservación y mantenimiento de bacterias, hongos
filamentos y levaduras con potencial agroindustrial.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Identificar los elementos a emplear en los diferentes métodos de preservación de
microorganismos, con el fin de elegir el más adecuado de acuerdo a la
infraestructura del laboratorio y del microorganismo a conservar.
 Evaluar la viabilidad de los microorganismos preservados mediante los diferentes
métodos.
INTRODUCCIÓN
En la actualidad las potencialidades de los microorganismos son explotadas en diversos
sectores de la economía y la salud, de ahí la importancia de contar con colecciones bien
conservadas que cumplan las premisas de un buen proceso de conservación. (Gómez. 2008)
La preservación de cepas microbianas no es nada fácil, ya que se debe garantizar la
viabilidad, pureza y estabilidad genética de los cultivos, estas características deben
coincidir con un buen método de conservación. (García et, al, 2000) El método que se elija
debe asegurar la supervivencia de al menos el 70% de celulas por un periodo considerable
de tiempo, de forma tal que la población sobreviviente de asemeje a la original como sea
posible, es decir, que en este punto se evalúa su pureza y estabilidad genética. De igual
manera debe reducir al mínimo el riesgo de contaminación y permitir que la pureza del
cultivo permanezca inalterable.
MARCO TEÓRICO
Fundamentos de los métodos
Criopreservación
Tiene como objetivo el mantenimiento de la viabilidad y funcionabilidad celular a
temperaturas bajas. La criobiología se refiere a entender los efectos de las temperaturas
bajas sobre los sistemas celulares ya que el tiempo biológico es una consecuencia de
determinadas reacciones bioquímicas y el frío prolonga el tiempo biológico puesto que
enlentece estas reacciones. (Portillo et al., 2006). Este consiste en congelar las células en
suspensión en un líquido con un agente crioprotector como el glicerol y se guardan a
temperaturas inferiores a cero grados centígrados, con lo que el agua se congela. De esta
forma, al no disponer las células de agua en forma líquida, no hay crecimiento. Cuando se
quiere trabajar con las células así conservadas, se recuperan subiendo la temperatura.
(Beech FW, 1971).
Ventajas
 Mejor método de conservación desde todos los puntos de vista.
 La utilización de un crioprotector ayuda a garantizar que no habrá ningún daño a
nivel celular a temperaturas inferiores a -10°C esto es una gran ventaja en el
momento de asegurar que no ha existido en la colonia ningún tipo de cambio o
daño, ya que crioprotectores son sustancias que protegen del daño que se pueda
producir en las células microbianas en el momento de la congelación. (García y
Uruburu, 2001; Uzunova-Doneva y Donev, 2004-2005).
 Las temperaturas de conservación a las cuales se realiza este método logra
garantizar una completa inactividad del microorganismo además que se puede
disminuir contaminación puesto que a estas temperaturas no crecen ningún tipo de
microorganismos esto ayudara a que se obtenga un éxito en la conservación.
 Este es uno de los métodos que a comparación en costos con métodos a largo plazo
como lo son congelación en nitrógeno es mucho más asequible, puesto que es más
fácil obtener glicerol y refrigeradores que congelen a temperaturas inferiores a -10
C que refrigeradores que congelen aproximadamente -196 C y nitrógeno que es un
reactivo que requiere de altos cuidados.
Desventajas
 Requiere aparatos especiales.
 Existe el peligro de que algún fallo del sistema produzca una subida no deseada de
la temperatura durante el almacenamiento
 Método mas molesto para realizar el envió de las cepas
 Al realizar la recuperación de la conservación por este método se debe hacer una
transferencia periódica para poder hacer una observación macroscópica y esto
 podría generar una contaminación que no se había obtenido en el trascurso de la
conservación.
 Como método a largo plazo la congelación por glicerol es una de las conservaciones
más económicas, pero con respecto al crioprotector utilizado, el glicerol es uno de
los más costosos.
Conservación por suspensión en agua destilada
Es un método alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos
tipos de microorganismos, tanto hongos filamentosos como levaduras y algunas bacterias.
Consiste en suspender en agua estéril unas cuantas células del cultivo que se quiere
conservar. En este caso la concentración celular no debe ser superior a 104 -105 células/ml
en el caso de bacterias y levaduras. Para los hongos filamentosos que no esporulan, se
pueden poner en suspensión trocitos de agar con el crecimiento del hongo.
Ventajas
 Muestran altos porcentajes de viabilidad en periodos a veces superiores a 5 años.
 La estabilidad para caracteres morfológicos y fisiológicos es buena.
 Es un método simple, económico y seguro, capaz de garantizar la supervivencia de
los cultivos fúngicos por períodos prolongados, y evita el pleomorfismo y la
contaminación con ácaros. (Pasarell y McGinnis, 1992; Malik y Hoffmann, 1993)
Desventajas
 No se ha comprobado para caracteres específicos como la virulencia, el poder
fermentativo.
Conservación por suspensión en agua mineral
La esencia del método está en cubrir el cultivo bien desarrollado sobre medio nutritivo
líquido con el aceite mineral no tóxico y estéril, como la parafina o vaselina; también se usa
petrolato líquido. (Uzunova-Doneva y Donev, 2004-2005). Los cultivos pueden mantenerse
por varios años, o en casos excepcionales por más de treinta y dos a 15-20°C (Nakasone et
al., 2004). Este método está especialmente recomendado para conservar micelio u hongos
no esporulados, donde la congelación puede ser adversa para ellos.
Ventajas
 Se recomienda este método en climas tropicales para prevenir la desecación del
cultivo e impedir la penetración de ácaros
 Es un método fácil de realizar y no requiere de equipos caros.
 Evita en la medida de lo posible la desecación del medio de cultivo, que podría ser
tóxico para las células al aumentar su concentración.
Desventajas
 Su mayor desventaja es que el hongo puede continuar su crecimiento, al menos
durante los primeros períodos, y así ocurrir que sobrevivan mutantes capaces de
 crecer bajo las condiciones adversas que implican la conservación. (Nakasone et al.,
2004)
Conservación por papel filtro
Es un método de conservación que reduce drásticamente el metabolismo bacteriano. Este,
implica la utilización de papel absorbente preferentemente Whatmann número 3, al cual se
le aplica una suspensión fuerte de más de 108 células, que posteriormente se desecan a
temperatura ambiente en condiciones estériles o si es posible utilizando un liofilizador sin
congelación previa de las células para utilizar el vacío y desecar mejor el papel. (Morales et
al., 2010).
Ventajas
 Por medio de este método no es necesario realizar un escalonamiento de
temperaturas.
 Es económico y fácil de realizar.
Desventajas
 Debido a las condiciones en las cuales se realiza esta conservación se pueden tener
altos riesgo de contaminación uno de ellos puede ser efectuado a causa de la
temperatura de conservación.

METODOLOGÍA
Conservación del microorganismo
Previamente inoculados los microorganismos en los medios de cultivos indicados, se
procedió a realizar los métodos de conservación y preservación. Primeramente, se hizo el
método de Criopreservación que consiste en preparar una suspensión madre del
microrganismo, en este caso Bacillus thuringiensis en glicerol al 10% con una escala de
McFarland 4, mezclar bien para tener una buena homogenización, después se toma 1 mL y
se adicionan en tubos Eppendorf y se lleva a congelación a – 20°C. Se realizó por
triplicado.
 Imagen 1. Tubos Eppendorf con
suspensión de B. thuringiensis
en glicerol al 10%
Después se realizó el método de agua destilada y agua mineral. Este consiste en hacer
una suspensión del microorganismo (Bacillus thuringiensis) en solución salina con una
escala de McFarland 4, luego se toma 1 mL de esta suspensión y se depositan en 2mL de
agua deshilada y el otro mililitro en 2mL de agua mineral se homogenizan y se incuban o
almacenan a temperatura ambiente y en oscuridad. Se realizo por duplicado en ambos
métodos.

Imagen 2. Tubos con Imagen 3. Tubos con

suspensión de B. suspensión de B.
thuringiensis en Agua thuringiensis en Aceite
destilada mineral

Finalmente se hizo el método en papel filtro estéril. Este consta de impregnar trozos de
papel filtro en la suspensión del microorganismo (Bacillus thuringiensis), estos se pusieron
en un vidrio reloj estéril y se llevó a un desecador, hasta que se absorbiera la humedad del
papel, cuando estos ya se encontraban totalmente secos, se tomaron con una pinza estéril y
se almacenaron en tubos Eppendorf a temperatura ambiente y en oscuridad.

Reactivación del microorganismoImagen 4. Tubos Eppendorf con

suspensión de B. thuringiensis
Para la reactivación de Bacillus thuringiensis,
en papelen el método de criopreservación se sometió
filtro
el vial a descongelación rápida en baño maría a 37°C por 5 minutos, y se procedió a
sembrar por estría en medio nutritivo, para el método de agua destilada y agua mineral, solo
se tomó el inoculo con asa en argolla y se sembró por estría en el medio nutritivo. Para el
caso de papel filtro se tomó con un estilete estéril un papel filtro y se colocó en el medio
nutritivo, posteriormente se llevó a incubar todo a 37°C por 24-48 horas.

RESULTADOS
Después de pasar el tiempo de almacenamiento, se obtuvieron los siguientes resultados de
la reactivación del microorganismo.
 Agua destilada Agua mineral Criopreservación Papel filtro

Imagen 5. Resultados de la Imagen 6. Resultados de la

reactivación de agua destilada y agua reactivación de criopreservación y
mineral papel filtro.

DISCUSIÓN
Según los resultados obtenidos, se evidencia el crecimiento bacteriano de Bacillus
thuringiensis, por sus características macroscópicas, ya que Bacillus es una bacteria que
desarrolla colonias blancas, planas, opacas con bordes irregulares, sin embargo, para
corroborar su pureza se debe realizar coloración de gram para observar las características
microscópicas, y verificar si coinciden con este bacilo esporulado, además de observar los
cristales propios de esta especie. Además, observando los resultados de los cuatro métodos
que se emplearon, hubo un desarrollo eficiente, no obstante, se debe evaluar también su
viabilidad mediante un recuento, por medio de cuantificación de la concentración del
microorganismo en una fase inicial y durante, en un tiempo determinado. Y finalmente
evaluar su estabilidad genética mediante técnicas moleculares para tener la certeza de que
se realizó un adecuado método de conservación. Según la literatura el mejor método de
conservación es el criopreservado porque este logra garantizar una completa inactividad del
microorganismo, por lo tanto, mantiene su estabilidad, además que se puede disminuir
contaminación puesto que a estas temperaturas no crecen ningún tipo de microorganismos
esto ayudara a que se obtenga un éxito en la conservación. No obstante, si no se cuenta con
los recursos se puede utilizar cualquiera de los demás métodos.

CONCLUSIONES
  Se logró establecer que los métodos cumplieron con los objetivos propuestos en esta
práctica, las colonias conservadas no tuvieron ningún tipo de contaminación ni
ningún cambio a nivel morfológico.
  Los métodos de conservación de agua destilada y aceite mineral, garantizan la
preservación adecuada de hongos levaduriformes y filamentosos durante largos
períodos de tiempo, asegurando viabilidad, pureza y estabilidad morfológica. Son
de bajo costo y fácil manejo, pero necesitan de constante vigilancia.
 Para la utilización de estos métodos de conservación depende también del costo-
beneficio de cada laboratorio, lo importante es realizar las técnicas de la manera
adecuada como este estandarizada.

BIBLIOGRAFÍA
o Ávila-Portillo, Luz Mabel, Madero, José I, López, Claudia, León, María Fernanda,
Acosta, Lucía, Gómez, Claudia, Delgado, Lucy Gabriela, & Gómez, Claudio.
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