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Clase # 4. Replicacion y ARN

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ASPECTOS MOLECULARES DE LA GENETICA

:

Actualmente los aspectos moleculares de la genética se basan en estudios realizados en células eucariotas como son algunas levaduras y en reticulocitos . La información genética esta contenida en la secuencia de nucleótidos de la molécula de ADN . A partir de esta secuencia nucleotidica la información va a ser traspasada al ARN , también en forma de secuencia nucleotidica , que sera en definitiva la responsable mediante el mecanismo de la síntesis de proteínas de fijar la secuencia aminoacidica en estos últimos compuestos, con lo que se logra poner de manifiesto la información genética ; en tanto la transmisión de esta información se logra mediante la duplicación de la molécula del ADN , para originar células idénticas entre si , luego , la expresión de la información genética se lograra a través del mecanismo de la biosíntesis del ARN y de la síntesis de proteínas , en tanto que la transmisión de estos caracteres se lograra por intermedio de la sintesis del ADN.

REPLICACION DEL ADN : La transferencia de la información genética de los padres a los hijos constituye el fenómeno mas importante de la materia viviente , pues no solo garantiza la sucesión de la vida sino además constituye el mecanismo básico de la conservación de las especies , pues los descendientes siempre poseerán características estructurales y funcionales similares a los progenitores . En los organismos pluricelulares existen células especializadas en esta función , que son las células sexuales . La célula sexual masculina ( espermatozoide) y la femenina ( óvulo) portan cada una la información genética de la especie , se unen en un proceso denominado fecundación y a través de complejos y mas o menos prolongados procesos dan origen al organismo completo. Como la fecundación es especifica todos los seres vivos darán descendientes iguales a si mismo , es decir de la misma especie. Esa transferencia de información de una célula u organismo a sus descendientes tiene su fundamento molecular , precisamente , en la duplicación o replicación del ADN , que no es mas que el proceso de biosíntesis del ADN , puesto que de el se obtendrán dos moléculas idénticas a la predecesora .

Para llevar a cabo la replicación se hacen necesarios : 1Sustratos : ellos son los 4 desoxirribonucleotidos 5’ trifosfatados ( dNTP) , es decir : el dATP , dGTP , dCTP y el dTTP. En el inicio del proceso se requerirán también los 4 ribonucleotidos 5’ trifosfatados. Molde : Se trata de la existencia de una molécula de ADN que tendrá función de “ molde” o “ patrón” . Enzimas : En este proceso participaran varias enzimas : a. ADN polimerasa dependiente del ADN . b. ADN ligasa. c. ARN polimerasa dependiente del ADN.

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Las ADN polimerasas dependientes del ADN , catalizan una reacción general que producirá la unión de un desoxirribonucleótido al hidroxilo 3’ libre de una molécula de ácido nucleico preexistente. Nótese que a diferencia de la ARN polimerasa , estas enzimas son incapaces de catalizar la unión de dos desorribonucleotidos ; sino que lo único que pueden hacer es catalizar el crecimiento de una cadena de ácido nucleico preformado , que tiene que servir como molécula “cebadora”. - ADN POLIMERASA I : Su acción fundamental estriba en la reparación del ADN ya formado. Esta enzima utiliza para realizar la catálisis de la reacción general una sola molécula cebadora , por lo que ella sola no logra la replicación . Además tiene acción exonucleasa tanto en sentido 5’....3’ como 3’....5’ , es decir , cataliza la hidrólisis de los nucleótidos que se encuentran en los extremos de la cadena del ADN, preferentemente en sectores donde la cadena ha sufrido mella o ruptura.

- ADN POLIMERASA II : Es capaz de catalizar la reacción general aunque con mucho menor actividad que la pol I , y posee acción exonucleasica en sentido 3’---5’ ; pero carece de esta acción en sentido 5’---3’. - ADN POLIMERASA III : Es la mas activa de todas , pero su forma biológicamente activa requiere de la unión con una proteína a la que se ha denominado copolimerasa . Cataliza la reacción general utilizando como molécula cebadora a cualquier ácido nucleico , tanto el ADN como el ARN, lo cual la diferencia de la Pol . I , que solo utiliza el ADN como molécula cebadora. Se considera la principal enzima encargada de catalizar la síntesis del ADN. No posee actividad exonucleasica. En su forma mas activa esta asociada con otras ocho proteínas formando la holoenzima polimerasa III . El termino holoenzima se refiere a una enzima que contiene varias subunidades diferentes , pero que retiene alguna actividad aun cuando haya perdido algunas de esas subunidades . La menor fracción que conserva la actividad es llamada el núcleo ( core) de la enzima.

LIGASA DEL ADN : Catalizan la síntesis de un enlace fosfodiester entre un grupo hidroxilo del extremo 3’ de una cadena polinucleotidica y el grupo P del extremo 5’ de otra cadena , siempre que ambos fragmentos estén asociados con una cadena complementaria común y formando una doble hélice con ella . Es decir , que en realidad esta solo es capaz de actuar reparando una “ mella” en la cadena del ADN con la cooperación de un ATP. OTROS FACTORES : Los demás factores necesarios son los iones inorgánicos Mg ++ que participan como co factores inorgánicos de las ADN polimerasas y las llamadas proteínas desenrrolladoras. Las proteínas desenrrolladoras constituyen un grupo de proteínas que se unen a la cadena del ADN desenrollando , y evitan que el mismo pueda volver a realizar el pareamiento de bases y la formación de la doble hélice . Además tiene un efecto cooperativo que determina que la unión de una de ellas a una cadena del ADN , facilite la incorporación de otras , con lo que el efecto desenrrollador se propaga a todo un segmento de la molécula.

MECANISMO DE REPLICACION O SINTESIS DEL ADN : Toda la información genética contenida en el ADN reside en su secuencia de bases , por lo tanto el papel primordial de cualquier modo de replicación es la de duplicar la secuencia de bases de la molécula “ paterna’ . La especificidad en el apareamiento de bases adenina con timina y guanina con citosina provee el mecanismo usado por todos los sistemas eplicativos . En los ADN de doble cadena el proceso de replicación se produce copiándose ambas cadenas simultáneamente , por lo que las moléculas formadas contendrán una cadena que proviene del ADN paterno y una cadena hija o neoformada . Como las cadenas paternas son complementarias y cada una se copia de forma complementaria , las moléculas hijas serán iguales a la paterna y además serán iguales entre si. Como en cada molécula hija se conserva la mitad de la molécula paterna se dice que la replicación es semiconservativa .

Como sabemos las cadenas de la molécula del ADN son antiparalelas ( de polaridad opuesta ) , siendo esta disposición la que permite mejor apareamiento de las bases . Como de cada cadena paterna ya surge una molécula hija ,esta debe tener ya su estructura estable , por lo que la síntesis de cada cadena hija es antiparalela a la cadena paterna que esta copiando. En resumen , la replicación se produce por complementariedad de bases , añadidas una a una en forma unidireccional y antiparalelas , tiene carácter semiconservativo y esta acoplada a la hidrólisis del pirofosfato.

ETAPAS DE LA REPLICACION : 1INICIACION :

Destruir el superenrollamiento positivo mediante la formación del topoisómero negativo que ermite separar las cadenas y evitar la formación de interacciones intratecarias . Este topoisómero se forma mediante la acción de enzimas llamadas topoisomerasas ( ADN girasa). Así comienza el desenrollamiento de la doble hélice , para lo cual deben ser vencidas las uniones hidrofobicas y los puentes de hidrogeno , lo cual se logra por otras enzimas llamadas helicasas que producen la separación de ambas cadenas con el consumo de 2 moléculas de ATP. Las cadenas una vez separadas no pueden unirse de nuevo gracias a la acción de un grupo de proteínas nombradas estabilizadoras de ADN de una sola banda ( ssb). La estructura formada por la abertura de la hélice y su estabilización recibe el nombre de iniciación . Los eventos previos a la iniciación en los que intervienen las topoisomerasas , las helicasas y las proteínas estabilizadoras , conducen a la formación de la horquilla de iniciación.

Las cadenas una vez separadas no pueden unirse de nuevo gracias a la acción de un grupo de proteínas nombradas estabilizadoras de ADN de una sola banda ( ssb). La estructura formada por la abertura de la hélice y su estabilización recibe el nombre de iniciación . Los eventos previos a la iniciación en los que intervienen las topoisomerasas , las helicasas y las proteínas estabilizadoras , conducen a la formación de la horquilla de iniciación. Una vez separadas las dos cadenas intervienen en el proceso unas seis proteínas , que forman un complejo unido a una cadena de ADN y que se llama : complejo de iniciación . Estas proteínas utilizan la energía de hidrólisis del ATP y se mueven sobre el ADN , hasta localizar una señal genética ( especifica para cada organismo ) y es donde comienza la síntesis de un pequeño fragmento de ARN que permanece unido a la cadena del ADN formando un híbrido ARN-ADN y recibe el nombre de ARN- iniciador . De esta forma se producirá la síntesis de varios fragmentos de ARN .

Los fragmentos de ARN obtenidos servirán como moléculas cebadoras . Recuérdese que la síntesis del ADN tiene que producirse exclusivamente por alargamiento de un ácido nucleico preformado. Comoquiera que la única ADN polimerasa capaz de adicionar desoxirribonucleótidos a una molécula de ARN , es decir , al extremo del ARN – iniciador , es la Pol III ( copiando por complementariedad la secuencia de bases del ADN ) , se hace responsable a esta enzima de catalizar la formación de fragmentos de ADN. Se debe tener presente que esto ocurre en las dos cadenas del ADN , pero en direcciones contrarias. En resumen , la iniciación comprende el ensamblaje del complejo iniciador , el reconocimiento de la señal de iniciación y la formación del ARN-iniciador al cual la Pol . III une el primer desoxinucleotido.

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ELONGACION :

Comprende la serie secuencial de eventos que conducen al alargamiento de las cadenas del ADN . Es valido aclarar que aunque siempre nos referimos que el crecimiento de las cadenas nuevas o hijas es unidireccional , pues este ocurre en sentido 5’ a 3’ , la replicación de las dos cadenas es bidireccional , es decir , la horquilla de replicación se mueve en las dos direcciones a partir del punto de origen , llegando a formarse dos horquillas que se mueven en dirección opuesta sobre las dos cadenas del ADN . Una vez incorporado el primer desoxinucleotido , la Pol . III continua incorporando uno a uno los siguientes nucleótidos cuyas bases son complementarias a las que ocupa la posición correspondiente en el ADN , luego se trata de un proceso repetitivo.

En la otra cadena se mueve en dirección contraria a la síntesis , 3’ a 5’ , pero como la ADN-polimerasa III solo sintetiza en dirección 5’ a 3’ el movimiento de la horquilla detendría su funcionamiento , pero se sabe que esto no ocurre . ¿ Como se resuelve este problema ? . En esta cadena la síntesis se produce por fragmentos , cada cierto tramo de la molécula del ADN se forma un nuevo ARN- iniciador que permite un nuevo crecimiento. Cuando la Pol . III encuentra el híbrido ADN- ARN no puede continuar incorporando desoxinucleotidos y entonces abandona el ADN , volviendo a unirse al extremo 3’-OH del iniciador , formándose pequeñas cadenas de ARN y ADN unidas covalentemente . Interviene entonces la enzima ADN .Pol . I , que tiene actividad exonucleasica 5’ – 3’ para ADN de doble cadena , con lo cual va eliminando uno a uno los ribonucleótidos del ADN – iniciador , y por su actividad polimerasa va alargando la cadena del ADN . Al llegar al ADN de doble cadena están todos los desoxirribonucleótidos pero hay dos de ellos que no están unidos por enlaces fosfodiester , existe una mella en la cadena . Actúa entonces la ADN – ligasa que cataliza la formación del enlace fosfodiester y sella la mella que existía en el ADN.

Este proceso se va repitiendo constantemente en una de las cadenas por lo que se dice que la síntesis es discontinua . En la otra cadena sin embargo , la síntesis progresa sin interrupciones , pues se realiza a favor del movimiento de la horquilla , por lo que en ella la síntesis es continua. De ahí que se describe la replicación como un proceso que es al mismo tiempo continuo y discontinuo ( algunos autores lo llaman semidiscontinuo ). La ADN polimerasa I tiene también actividad exonucleasica y en su movimiento por el ADN es capaz de producir desenrollamiento. Como las horquillas se mueven en dirección opuesta la cadena que se sintetiza continuamente ( a favor del movimiento de la horquilla ) no es la misma en cada horquilla y recibe el nombre de cadena conductora , en tanto la que se sintetiza discontinuamente recibe el nombre de cadena conducida. En resumen , durante la elongación las dos cadenas son alargadas de manera diferente . Para la hebra conductora solo hace falta la participación de la Pol . III . La otra hebra se alarga discontinuamente y requiere de la participación del complejo de iniciación , la Pol . III , la Pol . I y la ADN ligasa .

3- TERMINACION : Culmina el proceso de replicación y da como resultado la separación de las dos moléculas de ADN hijas , cada una de ellas contiene una cadena del ADN paterno y otra de nueva formación , por lo que se denomina a la síntesis como semiconservativa . Las unidades de replicación inician el proceso a diferentes tiempos en la fase S del ciclo celular , hasta que se copia todo el ADN , formando las dos moléculas hijas completas.

La replicación del ADN ocurre una sola vez durante el ciclo de vida de la célula , de ahí la necesidad de que el proceso ocurra con una alta fidelidad de copia , que las moléculas hijas contengan exactamente la misma secuencia de bases nitrogenadas que la molécula paterna. En estudios realizados con bacterias , que se reproducen rápidamente y permiten estudiar en corto tiempo varias generaciones de células se ha calculado que en la replicación se comete un error, es decir, se incorpora una base errónea por cada mil a cien mil millones de bases incorporadas ( muestra muy despreciable ).

¿ Cómo se garantiza entonces esta alta fidelidad de copia ?.

Entre los factores que lo permiten se encuentran: 1- La alta especificidad del apareamiento de bases formando los pares Adenina – Timina y Citosina- Guanina . 2- La alta especificidad de las polimerasas que solo incorporan los nucleótidos que forman pares complementarias al ADN que se esta copiando. 3- La utilización de un ARN iniciador , ya que como este es eliminado y reemplazado por el segmento de ADN correspondiente , estas zonas son rectificadas siempre. De usarse un segmento de ADN como iniciador , estas zonas no se leerían de nuevo y cualquier error en ella se podría mantener.

Existe además un mecanismo de rectificación . Cuando a pesar de todo lo que hemos dicho , se incorpora una base errónea , entra a funcionar el mecanismo reparador . La base incorrecta no forma pares de bases tan estable como la correcta y esa zona del ADN se debilita. La ADN polimerasa I , con su actividad exonucleasica 3’-5’ comienza a eliminar los nucleótidos mal apareados , cuando llega a la zona donde el apareamiento es correcto detiene su acción y la polimerasa III o ella misma puede continuar alargando la cadena en la forma adecuada. Todo estos mecanismos contribuyen a que los errores de copia sean mínimos y el proceso transcurre con una alta fidelidad.

REPLICACION EN EUCARIOTAS : En los cromosomas eucariotas la replicación presenta muchos problemas no encontrados en los procariotas , debido entre otros factores al enorme tamaño de ADN eucariota y a la complejidad geométrica impuesta por la organización del ADN en nucleosomas . Las polimerasas de eucariotas son mucho menos activas y tienen una velocidad muy alta , entre 500 y 5000 pares de bases por minuto . El tiempo de replicación del ADN es unas 1000 veces mayor que los procariotas ( unos pocos minutos ) . Los cromosomas eucariotas utilizan múltiples puntos de replicación y la misma es bidireccional . Se han calculado hasta 5000 sitios de iniciación en un mismo cromosoma , cada uno separado por 3000 pares de bases . El numero de horquillas es un reflejo del numero de moléculas de las polimerasas , contienen hasta 60 000 de la polimerasa alfa , que es la principal.

La estructura nucleosomica del ADN eucariota debe disociar el complejo ADN- proteína y reformarse con la molécula neoformada. Se ha comprobado que esto sucede simultáneamente . Las histonas se sintetizan simultáneamente a la replicación , de ahí que es mas correcto referirse a la replicación del cromosoma que a la del ADN. Por ultimo , es bueno recordar que las células de los animales superiores como el hombre contiene una doble dotación de genes ( son diploides ) y cuando se produce la duplicación de los cromosomas contendrá cuatro copias de genes homólogos ( son tetraploides ) . Es decir , el numero de copias de un mismo gen es variable durante todo el ciclo celular . Así en ( G1) es doble , durante el periodo S , la información se duplica y por lo tanto es cuádruple durante todo el periodo ( G2 ) . Durante el periodo ( M) la información se divide en dos yendo a parar a cada una de las células hijas , que así inician su ciclo celular nuevamente con una doble dotación de la información genética.

ILUSTRACIONES :

CARACTERISTICAS ESTRUCTURALES DEL ARN :

Los ARN son ácidos nucleicos ubicados en todo el protoplasma celular , que tienen como principal característica el tener como azúcar en su estructura a la ribosa . En el ARN existen , al igual que en el ADN , 4 bases principales : la adenina , la guanina , la citosina y el uracilo . Nótese que la diferencia que tiene el ADN es que en vez de poseer a la timina , entre las bases predominantes se encuentra el uracilo. Debe destacarse también a la composición de bases que en ellos se encuentran con mayor frecuencias las llamadas bases inusuales o raras . En sentido general esta carencia de regularidad en la composición nucleotidica del ARN es una consecuencia de que el mismo esta formado por una sola hebra polinucleotidica que a su vez no presenta regularidad alguna , por lo que al no existir complementariedad de entre dos cadenas no tiene por que producirse esta característica estructural . Debe señalarse , no obstante , que en la molécula del ARN existe pareamiento de bases intratecario que forma sectores de doble hélice.

TIPOS DE ARN : Como quiera que el ARN descubierto hasta ahora tiene muy diversos tamaños y realiza distintas funciones dentro de la célula , resulta imprescindible realizar su estudio según los diferentes tipos identificados de acuerdo con su estructura y función . Así , en toda célula eucariota se reconocen 4 tipos de ARN : 1234El ARN ribosomal ( ARNr ). El ARN mensajero ( ARNm ). El ARN de transferencia ( ARNt ). El ARN heterogéneo nuclear ( ARNhn ).

1 - ARN RIBOSOMAL : Estos tipos de ARN son mas abundantes en las células y constituyen además las moléculas de ARN mas pesadas y grandes de las conocidas ya que su peso molecular puede alcanzar valores de varios millones de Dalton. En realidad no existe un solo tipo de ARNr , sino que en el ribosoma bacteriano existen al menos tres bien definidos , a los que se les denomina : 23s , 16s , y 5s de acuerdo con su peso molecular , en tanto , en las células eucariotas se han identificado 4 tipos: 5s , 5.8s , 18s y 28s. A pesar de conocerse que estos ARN se encuentran unidos siempre a proteínas para formar los complejos núcleoproteicos denominados ribosomas , y que estos organitos citoplasmáticos son los sitios donde va a ocurrir la síntesis de proteínas , no se conoce con exactitud el papel que desempeñan los ARNr en este mecanismo biosintetico.

2- ARN MENSAJERO : Estos tipos de ARN son muy variables , están constituidos por una sola hebra de polirribonucleotido y contiene solamente 4 bases nitrogenadas principales . Su peso molecular oscila entre 200 y 500 mil Dalton. Estos compuestos , al igual que los otros tipos de ARN son sintetizados en el núcleo , copiando la secuencia nucleotidica de un sector de la cadena del ADN , por lo que sera complementaria a la hebra que copia . Con posterioridad el ARNm pasa al citoplasma y se fija al ribosoma donde actúa como la “plantilla” para la organización de la secuencia de aminoácidos de una proteína , por lo que se afirma que la función básica de este tipo de ARN es la de copiar la información genética contenida en el ADN del núcleo para trasladarla hasta el ribosoma , lugar donde se efectúa la síntesis de proteínas. Como quiera que cada una de las miles de proteínas presentes en la célula son sintetizadas a partir del código que brinda el ARNm , se comprende que este ARN tiene que aparecer en muchas formas diferentes y con muy variados pesos moleculares y que además deben poseer una vida media muy corta.

3- ARN DE TRANSFERENCIA : Constituyen los ARN mas pequeños conocidos , ya que solo poseen entre 75 y 90 nucleótidos y pesos moleculares entre 23 y 28 mil Dalton. Se conoce que cada uno de los 20 aminoácidos presentes en las proteínas tienen al menos un ARNt especifico correspondiente , y algunos poseen mas de uno . Su función es la de actuar como transportadores de los aminoácidos individuales específicos para introducirlos en el sitio apropiado durante la síntesis proteica. La unión del ARNt con el aminoácido determina que se introduzca un enlace rico en energía en ese complejo , por lo que se facilita la posterior formación del enlace peptídico , y también se le confiere a los aminoácidos especificidad para su incorporación a la cadena peptídica en crecimiento en el sitio apropiado. La estructura de estos ARN resulta la mas conocida de todos los tipos; así , se sabe que están caracterizados por contener un elevado numero de bases raras o inusuales.

Además , todos los ARNt tienen en su extremo 5’ un residuo de ácido guanilico , en tanto que en su extremo 3’ presentan siempre la secuencia A-C-C, siendo este sitio el punto de unión con su aminoácido especifico. Estos ARNt tienen una configuración tridimensional característica toda vez que poseen entre 60 y un 70% de sus bases pareadas. Esto es posible al plegarse la cadena sobre si misma y establecer pareamientos intratecarios . De todas formas , en estas moléculas se reconocen 4 brazos de sectores no pareados en cadena , que son de una secuencia nucleotidica similar en todos los ARNt. Uno de ellos , llamado brazo aminoácido le sirve para unirse al aminoácido , otro opuesto al anterior y denominado brazo anticodon es el que le permite ubicar específicamente el aminoácido en el lugar que le corresponde dentro de la cadena peptídica en crecimiento.

ARN HETEROGENEO NUCLEAR :

En las células eucariotas aparece además de los tres tipos ya mencionados de ARN , otro tipo que ha sido denominado heterogéneo nuclear , ya que no abandona el núcleo . Este tipo de ARN resulta el de mayor peso molecular de todos los conocidos y tiene una vida media muy corta , solo unos minutos , lo cual dificulta considerablemente su estudio. Se ha podido comprobar que la extensión de su cadena alcanza cifras de 2 a 20 mil nucleótidos y que su función primordial es la de ser un precursor del ARNm ; lo cual se obtendría por fragmentación del ARNm . Sin embargo aunque no ha podido ser demostrado plenamente también se le ha atribuido funciones en la regulación de la expresión genética en este tipo de células que lo poseen. En algunos virus ha sido posible encontrar un tipo de ARN de doble cadena , con una estructura y función muy similar al ADN.

TRANSCRIPCION DEL ARN :

Anteriormente hemos visto como la replicación del ADN es el fundamento molecular de la transferencia de información de una célula u organismo a sus descendientes . Se asegura que el ADN contiene la información que determina las características estructurales y funcionales de las células que lo contienen . Luego en las células deben existir mecanismos por medio de los cuales se logre la expresión de la información genética. Ese mecanismo en líneas generales consiste en sintetizar proteínas cuya secuencia de aminoácidos esta codificada en la secuencia de bases nitrogenadas del ADN.

Este proceso recibe el nombre de trascripción y es el que posibilita la síntesis de todos los tipos de ARN . Su nombre proviene de la similitud que existe entre este proceso y la copia de una información escrita en uno de los idiomas humanos , pues el “idioma’ del ARN se “escribe” utilizando una secuencia nucleotidica , y esta información va a ser copiada en el mismo “idioma’ en otra molécula , la del ARN. En sentido general , este proceso consta de dos etapas fundamentales : 1- La secuencia de bases del ADN es copiada en una molécula especifica del ARN ue recibe el nombre de mensajero ( Transcripción ). 2- Utilizar la secuencia de bases del ARN mensajero , para , a partir de ella sintetizar una cadena polipeptídica con una secuencia especifica de aminoácidos ( Traducción ) .

Estos dos procesos que ocurren continuamente , en algunos casos hasta simultáneamente, constituyen el mecanismo fundamental mediante el cual el ADN determina las características estructurales y funcionales de una célula y un organismo como un todo. Por eso , como vimos anteriormente no es imprescindible la duplicación exacta de todos los componentes celulares al producirse la división celular , pues basta con la división del ADN y los componentes celulares que intervienen en su expresión , para que las células hijas sean de la misma especie que las parentales.

Compuestos que se requieren para la síntesis del ARN :

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Sustratos : Lo constituyen los 4 ribonucleótidos trifosfatados ( NTP) , es decir el ATP , GTP , CTP y el UTP. Molde: Una molécula de ADN que cumple funciones de “molde” o “patrón” para la síntesis de los ARN.

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Enzima: ARN polimerasa dependiente del ADN , pues en ausencia del ADN la misma carece de actividad , esta enzima cataliza la formación del enlace 3’ 5’ fosfodiester entre los diversos nucleótidos , para posibilitar la polimerización de los mismos y la formación del ARN. La misma varia estructuralmente de una especie a otra , sin embargo , se puede afirmar que en sentido general esta formada por varias subunidades proteicas con acción catalítica y por otra subunidad reguladora denominada : factor sigma( σ). Independientemente de una estructura ,todas ellas tendrán también la misma función catalítica de unir al ( P) de la posición 5’ de un ribonucleósido al hidroxilo de a plaza 3’ de otro ribonucleósido 5’ trifosfatado o al hidroxilo 3’ terminal de un sector de la cadena del ARN en crecimiento.

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Otros factores :

Se requiere también de la presencia de iones Mg++ , como cofactores inorgánicos y de factores proteicos diferentes a la ARN polimerasa , que son los denominados factores Kappa ( K ) y rho .

La cadena de ARN crece en el sentido 5’ a 3’ , pero la lectura del ADN se hace en dirección 3’ – 5’ , luego la síntesis es antiparalela.

MECANISMO DE LA TRANSCRIPCION : La trascripción es un proceso mas simple que la replicación . Los eventos pre-iniciación consisten en la localización por parte de la ARN polimerasa de un sitio especifico del ADN , y la separación de las dos cadenas de forma que la secuencia de bases sea accesible a la enzima. La porción del ADN al cual se une la polimerasa para iniciar la trascripción recibe el nombre de promotor . En los promotores conocidos se distinguen dos secuencias importantes , la primeras se consideran variantes de las secuencias TATAATG . La otra secuencia importante contiene típicamente nueve bases , por ejemplo ACATTTAC. La subunidad sigma al unirse al núcleo de la polimerasa aumenta su afinidad por estas secuencias de manera que permite a la enzima unirse a esta zona especifica del ADN .

La unión de la polimerasa en el sitio adecuado provoca un desenrollamiento local del ADN ( favorecido por el alto contenido en pares AT ) . Esta estructura es muy estable y recibe el nombre de promotor abierto. Una vez formado el promotor abierto la enzima comienza a deslizarse sobre el ADN hasta arribar a la primera base que va a ser copiada. En ocasiones para la unión de la polimerasa al sitio especifico del ARN se requiere el concurso de proteínas adicionales. En resumen los eventos pre-iniciación comprenden el reconocimiento de señales especificas y la formación de un promotor abierto.

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INICIACION :

La ARN polimerasa contiene dos sitios de unión para nucleótidos trifosfatados , llamados sitio de iniciación y sitio de elongación . El primero es especifico para nucleótidos de purina , generalmente ATP , luego la primera base en ser copiada es casi siempre la timina . Una vez formado el par AT se incorporara otro nucleótido trifosfatado al sitio de elongación . Solo se incorporara aquel capaz de formar un par con la base # 2 , es decir , la citosina . Cuando los dos sitios están ocupados se produce la reacción y queda formado el primer enlace fosfodiester . Inmediatamente después se produce el movimiento de la polimerasa hacia el siguiente nucleótido.

2- ELONGACION : Durante esta etapa se va produciendo el alargamiento paulatino de la cadena siempre que el nucleótido entrante pueda formar pares de bases con la correspondiente del ADN . Aproximadamente después de añadir unos ocho nucleótidos se produce un cambio en la conformación de la enzima que provoca la disociación del factor sigma , continuando solamente el núcleo con el resto de la elongación . Un detalle interesante es que el desplazamiento de la polimerasa no se produce a una velocidad constante. Hay zonas donde el desplazamiento es mas rápido que en otros . Incluso hay pausas donde la enzima se detiene . Estas pausas están relacionadas con zonas ricas en pares GC.

Recuérdese que la polimerasa en su movimiento va desenrrollando la doble cadena del ADN y esto es mas difícil en las zonas donde predominan los pares GC. Durante la elongación se forma un híbrido ADN –ARN pero mucho mas corto que el formado en la iniciación de la replicación . Algunos autores aseguran que la zona híbrida solo comprende dos pares de bases. A medida que la polimerasa avanza al ADN vuelve a enrrollarse detrás de ella. En resumen , la elongación consiste en el aumento gradual de la cadena polirribonucleotidica por acción fundamentalmente del núcleo de la ARN polimerasa.

3- TERMINACION : La terminación de la síntesis del ARN ocurre en sitios de secuencias de bases especificas en la molécula del ADN . Se conocen numerosas de estas secuencias . Hay tres regiones importantes : 1- Hay una secuencia repetida - invertida con un segmento no repetitivo central . Esta es la secuencia capaz de formar pares de bases intratecarias formando una estructura en “tallo” y “asa”en el ARN y posiblemente también en el ADN. 2- Una secuencia rica en GC muchas veces localizada dentro del tallo aunque puede parcialmente estar dentro del asa . 3- Usualmente a continuación se presenta una secuencia rica en AT , que sale fuera del tallo y hace que el ARN contenga una adenina seguida por seis a ocho uracilos.

Todo parece indicar que la formación de la estructura en tallo y asa en la molécula del ARN esta implicado notablemente en el mecanismo de terminación . No se conoce exactamente como se produce la terminación , pero parece estar relacionada con una pausa en el movimiento de la polimerasa .

El proceso de terminación incluye : a) Cese de la elongación de la cadena de ARN. b) Liberación del ARN neoformado . c) Liberación de la ARN – polimerasa del ADN.

En el proceso de terminación intervienen proteínas especificas cuya acción no esta aun esclarecida . Existen dos tipos de señales de terminación . Una de ellas es reconocida por la propia polimerasa pero parece necesario que a ella se encuentre unida una proteína especifica conocida como Nus A . Esta proteína se une al núcleo de la polimerasa en cualquier momento de la elongación después de la disociación del factor sigma , pues no pueden unirse simultáneamente al núcleo de la polimerasa . En estas condiciones la terminación se produce al llegar la polimerasa a una determiada secuencia. El otro tipo de terminación ocurre por la acción de una proteína especifica denominada ( rho ) . Esta es una proteína oligomerica que no se une ni a la polimerasa ni al ADN . Su unión al ARN estimula en ella una fuerte actividad de ATPasa . Aun cuando el mecanismo del factor ( rho ) no esta totalmente esclarecido el mismo esta relacionado igualmente con la existencia de pausas en el movimiento de la polimerasa que se producen en secuencias especificas o señales de terminación .

En resumen la terminación incluye el detenimiento de la elongación , la liberación del ARN y la ARN – polimerasa , determinadas por secuencias especificas del ADN y con el concurso de proteínas especificas. Así se sintetiza una larga molécula de ARN , que va a ser transformada posteriormente en un proceso de maduración post- transcripcional para constituir los diversos tipos de ARN.

EVENTOS POST – TERMINACION : MADURACION : Los diferentes tipos de ARN sufren modificaciones antes de ser totalmente funcionales . La estructura típica de los ARN mensajeros contienen cuatro sectores diferentes funcionalmente . Una secuencia inicial hacia el extremo 5’ conocida como secuencia conductora ( leader ) y que contiene una zona rica en purinas y un triplete de bases especifica ( AUG) , llamado también codon de iniciación . Hacia el extremo 3’ contiene igualmente una secuencia de longitud variable , conocida co mo secuencia de terminación . Un tercer tipo de sector esta constituido por las secuencias codificadoras , es decir , aquellas que contienen la información para la síntesis de polipéptidos específicos .

Los ARN ribosomales son transcritos en forma de un precursor único de alto peso molecular , con sectores espaciadores , en los que a veces se incluye algún ARN de transferencia . La maduración consiste en la hidrólisis del transcrito primario en puntos especificos que van reduciendo el tamaño de la molecula originando así cada tipo particular de ARN . Los ARN de transferencia también se obtienen a partir de la hidrólisis especifica de un transcrito primario de alto peso molecular . Es durante esta fase que se producen las modificaciones de las bases nitrogenadas , que constituye una de las características estructurales mas sobresalientes de los ARNt .

LA TRANSCRIPCION DE EUCARIONTES : Se realiza por tres tipos de ARN polimeasas llamadas I , II y III. La Pol . I se localiza en el nucleolo y realiza la síntesis de los ARNr . La tipo II es del nucleoplasma y realiza la síntesis de los ARNm , en tanto la tipo III que es también del nucleoplasma lleva a cabo la síntesis de los ARNt y del ARNr de 5 s . Cada enzima esta formada por dos subunidades grandes y de cuatro a ocho subunidades pequeñas .

Existen diferencias escenciales en la trascripción entre eucariontes y procariontes con relación a cada tipo de ARN , las principales diferencias con respecto al ARN mensajero son :

1- Es realizado por la polimerasa II en el nucleoplasma. 2- Muchos ARNm tienen una vida media biológica muy larga . La vida media de los ARNm , es de 1.8 minutos en procariontes , en tanto en eucariontes puede llegar a varias horas . 3- Ambos extremos , el 5’ y 3’ , están modificados . Una estructura llamada Cap se encuentra en el extremo 3’. 4- El ARNm usado como molde en la síntesis de proteínas es generalmente 1/ 10 del tamaño del transcrito primario .

Durante la maduración se eliminan los intrones . En esta eliminación intervienen los ARN pequeños nucleares , que producen el acercamiento de los exones facilitando su unión . Un elemento que favorece el proceso es el hecho de que todos los intrones comienzan con la secuencia GU y terminan con AG. En cuanto a los ARNr es bueno comenzar diciendo que los eucariontes tienen cuatro tipos llamados 5s , 5.8s , 18s y 28s , debido a su coeficiente de sedimentación . La organización de sus genes difiere de la de los procariontes. Los genes del ARNr 5s están fuera del nucleolo. Como los genes para los ARNr , en general , no presentan intrones su maduración es similar a la de los procariontes . Los ARNt de eucariontes se obtienen también a partir de transcritos primarios mucho mayores , que pueden contener 1 o mas ARNt . Algunos genes de ARNt presentan intrones de 10 a 20 bases que son eliminados . A diferencia de los procariontes , los ARNt de eucariontes no contienen en su versión inicial la secuencia terminal CCA. Su adición es también parte del proceso de maduración . Por ultimo , numerosas bases nitrogenadas son modificadas por la acción de enzimas especificas.

Como hemos visto hasta este momento , la información genética se encuentra codificada en forma de una secuencia de bases nitrogenadas en los ADN y así pasa de una generación de células a la siguiente , previo al proceso de duplicación . En la trascripción que se acaba de estudiar , comienza el proceso mediante el cual la información genética se expresa en una célula determinada , y así pasa de la secuencia de bases de los ADN a la secuencia de bases de los ARNs , fundamentalmente de los ARNs mensajeros . Es decir , la información sigue codificada en el mismo lenguaje , a saber , el de las bases nitrogenadas . Pero para que el gen se exprese totalmente , de manera que pueda influir en las funciones celulares , debe poder sintetizarse una proteína especifica a partir de esa información .

El lenguaje de las proteínas no es de las bases nitrogenadas sino el de los aminoácidos . El paso de información de un lenguaje a otro recibe el nombre de TRADUCCION . Para realizar la traducción es necesario la existencia de un código , es decir , de una relación de equivalencia entre los símbolos utilizados por el otro: EL CODIGO GENETICO . Este se refiere , pues a la relación de equivalencia existente entre la secuencia de bases del ARN mensajero y la secuencia de aminoácidos de una proteína. Es evidente que si cada base fuera equivalente a un aminoácido las proteínas solo contendrían 4 aminoácidos diferentes. Si dos bases fueran equivalentes a un aminoácido solamente se utilizarían 16. Si fueran tres las bases entonces pudieran utilizarse 64 aminoácidos , es decir , la relación de equivalencia es de tres bases nitrogenadas para cada aminoácido , o como se dice: la relación de codificación es 3:1.

Según Watson y Crick la secuencia de bases de los ADNs ( y por tanto de los ARNs transcriptos ) no tiene ninguna restricción , de lo que se desprende que existirán las 64 combinaciones y de los cuales se puede inferir además , que las 64 son utilizadas.

CODIGO GENETICO: En las proteínas existen cuatro tipos de bases nitrogenadas y 20 aminoácidos. Era necesario entonces buscar una cantidad de bases que reconocieran a estos 20 aminoácidos y se determino que seria en tripletes o codones. La información genética se almacena dentro de la molécula de ADN en forma de un código de tripletes , esto es, una secuencia de tres bases que determina un aminoácido. Este diccionario recibe el nombre de CODIGO GENETICO . Mediante experimentos se han asignado los tripletes que codifican los 20 aminoácidos.

Algunos aminoácidos están codificados por mas de un triplete, y por ello se dice que el código es degenerado. El triplete de bases nucleotidicas del ARNm que codifica un aminoácido particular se denomina codon, mientras que el triplete complementario de la molécula de ARNt que se une a el, con un aminoácido particular se denomina anticodon. Luego , se define como codon a un triplete de nucleotidos consecutivos existentes en la cadena de ARNm que codifica a un solo aminoácido. Existen tres codones ( UAA , UAG y UGA ) que no codifican a ningun aminoácido , por lo que han sido denominados codones sin sentido o también codones de terminales, por su función en la terminación de la síntesis proteica.

Características del código genético: 1- Como ya se ha mencionado , el código genético esta formado por unidades de información denominadas codones y que son tripletes de nucleotidos presentes en el ARNm. 2- Es continuo , es decir no existe separación entre un codon y el otro ,sino que los mismos están en forma consecutiva a lo largo de la cadena del ARNm. 3- El código es degenerado ,pues hay mas de un codon para la mayoria de los aminoácidos. Sin embargo , no puede decirse que sea imperfecto , toda vez que no existe ningún codon que codifique mas de un aminoácido. 4- Una vez concluida la “lectura” de los codones , estos no se superponen , o lo que es lo mismo , que ya iniciada la síntesis proteica , un nucleotido solo pertenece a un codon y no a varios simultáneamente.

5-

Como quiera que no hay signos de puntuación deben existir señales que indiquen la iniciación y la terminación de la síntesis proteica. Así , los codones AUG y GUG significaran el inicio de la síntesis , en tanto que los codones sin sentido expresaran el final.

6- El código es universal , ya que todas las especies tienen igual código genético. Este hecho constituye una prueba irrefutable de la evolución de las especies. 7- La base del tercer nucleótido que conforma al codon es menos especifica que las dos primeras. Esto representa una gran ventaja , pues si se cambia esta tercera base por otra , por medio de una mutación puntual , existen grandes posibilidades de que no se produzcan modificaciones de la proteína resultante. De esta forma se produce la interpretación de una secuencia nucleotidica del ARNm para su conversión en la secuencia aminoacidica de una proteína.

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