ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
ENZIMOLOGÍA

INFORME DE LABORATORIO
PRÁCTICA N° 1

1. TEMA: Actividad de la Amilasa

2. OBJETIVOS:

2.1. Objetivo General:

 Determinar la actividad de la amilasa en el suero de la sangre.

2.2. Objetivos Específicos:

 Extraer muestras de sangre para su posterior separación y utilización en el

ensayo.
 Utilizar técnicas de espectrofotometría para obtener datos de absorbancia a
partir de soluciones a diferentes concentraciones de almidón.
 Generar a partir de datos experimentales la curva de calibración para el
compuesto en estudio.
 Analizar la curva de calibración generada para estudiar la actividad de la
amilasa en el suero sanguíneo.

3. MARCO TEÓRICO

Las enzimas son compuestos presentes en los organismos y son esenciales para la vida.
Promueven infinidad de reacciones químicas, tanto anabólicas como catabólicas, con gran
rapidez, y en consecuencia, sin su presencia las reacciones químicas serian tan lentas que
no podrían mantenerse los procesos vitales (Silver, 2001).

La amilasa es una enzima de tipo hidrolasa que se produce en las glándulas salivales y en
el páncreas. Su función es catalizar la reacción de hidrólisis de los enlaces 𝛼-1,4
glicosídicos de la amilosa, amilopectina y  glucógeno para formar azucares simples. Su pH
óptimo de acción es 5,5 y su temperatura optima de 37°C. Al variar dichas condiciones, la
actividad enzimática se modifica. (Prasanna V., 2005).

En organismos vivos, su aumento está relacionado en la mayoría de los casos con

pancreatitis aguda, elevándose bruscamente la concentración de la enzima en la sangre y
orina, permaneciendo elevada por más tiempo en la orina que en el plasma, siendo por
ello de gran valor el estudio de la actividad en suero y orina para saber sobre el curso de
la enfermedad. Su concentración normal en suero es de 18-87 U/L a 37°C
Las amilasas son enzimas que tienen numerosas aplicaciones biotecnológicas, un ejemplo
de ello es la producción de jarabes que contienen oligosacáridos como maltosa y glucosa
que se obtienen a partir de polisacáridos como el almidón (Silver, 2001).
4. MATERIALES Y REACTIVOS

4.1. MATERIALES DE PROTECCIÓN PERSONAL

- Mandil
- Guantes
- Vestimenta apropiada
4.2. INSUMOS

- Soporte con probetas de - Matraces aforados de 50 ml

centrifuga - Fotoelectrocolorímetro
- Probetas de centrífuga - Celdas para el
- Pipeta 10ml fotoelectrocolorímetro
- Micropipetas de 0.1 ml - Probetas de 50ml
- Termostato (37 C) - Vaso de precipitación de 50ml
- Centrifuga eléctrica

4.3. REACTIVOS
- Almidón soluble, disolución al 1%
- Cloruro sódico, disolución 0,5 M
- Mezcla de disolución de almidón al 1% con disolución de cloruro sódico 0.5 M.
- Disolución amortiguadora de fosfato, pH 7.2
- Ácido clorhídrico, disolución 1N.
- Iodo, disolución al 0.3% en disolución de ioduro potásico al 3%.

5. PROCEDIMIENTO

5.1. Curva de Calibración

Para trazar la curva de calibración en 5 matraces aforados de 50 ml se vierten de 30 a
40 ml de agua. Añadir 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 ml de disolución de almidón. Agregar 0,5
ml de disolución de ácido clorhídrico, 0,1 ml disolución de iodo, el contenido se lleva
con agua hasta la raya de enrase y se mezcla. Al cabo de 5 min la coloración se mide
en fotoelectroclorímetro con respecto al agua en las cubetas de 1 cm de distancia
entre las cara de trabajo, usando el filtro de luz rojo (618 – 780 nm).

5.2. Marcha de los trabajos

En dos probetas de centrífuga se vierten 0,5 ml de mezcla de disoluciones de almidón
con cloruro sódico y 0,3 ml de mezcla amortiguadora de fosfato. Añadir 0,1 ml de
suero de la sangre en la probeta 1 (experimental) y en la probeta 2 (control) 0,1 ml de
agua destilada. Incubar ambas probeta en el termostato (37 C) durante 30 min. Añadir
en ambas probetas 0,1 ml de disolución de ácido clorhídrico y centrifugar durante 1
min a 1500 r.p.m. Verter en dos matraces aforados de 50ml, en cada uno, de 30 a 40
ml de agua, se añaden 0,2 ml de líquido centrifugado y se realizarla reacción coloreada
como se ha descrito anteriormente, para el trazado de la curva de calibración.
6. RESULTADOS PRIMARIOS

6.1. Cálculos para los reactivos

Ácido clorhídrico, disolución 1N.

g de soluto
N=
litros de solución∗peso equivalente

g
HCl=36,5
mol

Peso equivalente de HCl=36,5

g de HCl
1N=
0,250 L∗36,5 p . e

masa de HCl puro=9,125 g

100 g 37 HCl
x 9,125 HCl

g de HCl al 37 %=24,64 g

masa
densidad=
volumen

24,64 g
volumen=
1,19 g /ml

volumen de HCl=20,71 ml

Se toma 20,71ml de HCl y se afora a 250ml.

Almidón soluble disolución al 1%

1 g en100 ml

Se toma un gramo de almidón y se lo disuelve en 100ml de agua destilada.

Disolución amortiguadora de fosfato, pH 7.2

Na H 2 PO 4 ácido
Na2 HP O 4 sal
 Datos:
−8
K a de Na H 2 P O4=6,2∗10

[ Na H 2 PO 4 ]=0,1 M
120 g
Peso molecular de Na H 2 P O4 =
mol

142 g
Peso molecular de Na2 HP O4 =
mol

pH =7,2

pH =−log ¿ ¿

(6,2∗10−8)(0,1)
[ sal ] = −7,2
(1∗10 )

[ sal ] =0,098
0,098 mol
∗142 g
L
∗1 L
mol
masa sal= ∗100 ml
1000 ml

masa sal=1,39 g de Na2 HP O4

0.1 mol
∗120 g
L
∗1 L
mol
masa ácido= ∗100 ml
1000 ml

masa sal=1,2 g de NaH 2 P O4

Se mezcla en 98ml de agua destilada, se ajusta el pH y posteriormente se afora a 100ml.

Cloruro sódico

g de soluto
M=
litros de solución∗peso molecular

g de cloruro sódico
5 M=
0,250 L∗58,44 g/mol

g de cloruro sódico=73,05 g
 Se toma 73,05g de NaCl y se afora a 250ml.

6.2. Datos obtenidos para la curva de calibración.

Tabla 1. Absorbancias. En la columna izquierda de muestra la el volumen de solución al 1% de almidón en

la muestra ; en el centro la concentración de almidón en miligramos y en la derecha la absorbancia
obtenida por espectrofotometría

Tubos de ensayo mg de almidón Absorbancia (nm)

(ml de solución al 1%)
Blanco 0 0
0,5 ml 5 0,033
1 ml 10 0,044
2 ml 20 0,177
3 ml 30 0,110
4 ml 40 0,410

Los valores que se presentan en color rojo no se tomaron en cuenta para realizar la curva de
calibración ya que no concuerdan con los datos esperados. Se asume un posible error en la
medición.

6.3. Curva de calibración

Curva de calibración para el almidón

0.45
0.4
f(x) = 0.010585 x − 0.025975
0.35 R² = 0.980463102976334
0.3
Absorbancia

0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Concentración de almidón (mg)

Fig. 1. Curva de calibración para el almidón. Gráfico y ajuste realizado en Microsoft Excel

6.4. Marcha de los trabajos

 Tabla 2. Absorbancias obtenidas a partir de la muestra de control y la muestra experimental

MUESTRA ABSORBANCIA

Muestra de control (Agua) 0.06

Muestra experimental (Suero sanguíneo) 0.022
7. CÁLCULOS ESTADÍSTICOS

7.1. Determinación de las concentraciones de almidón en la muestra experimental y de

control.

Muestra de control:

y=0.0106 x −0.026
y=absorbancia=0.06

0.06=0.0106 x−0.026
x=8.113

La concentración de almidón en esta muestra es de 8.113 mg

Muestra experimental:
y=0.0106 x −0.026
y=absorbancia=0.022

0.022=0.0106 x −0.026
x=4.528

La concentración de almidón en esta muestra es de 4.528 mg

7.2. Cálculo de la actividad de la amilasa

a=cantidad de almidón en muestra experimental (4.528mg)

b=cantidad de almidón enla muestra de control(8.113 mg)

( b−a )∗100
E=
( 0.2 )(0.1)

( 8.113 mg −4.528 mg )∗100 ml

E=
( 0.2 ml ) (0.1 ml)

mg
E=17923.49
ml
8. REPORTE DE RESULTADOS

8.1. Reacciones que se producen

Hidrólisis Ácida de polisacáridos

Hidrólisis enzimática del almidón

8.2. Actividad de la amilasa

Se determinó una actividad de 17923.49 mg/ml para la amilasa obtenida a partir de suero
sanguíneo. La muestra experimental presentó una menor concentración de almidón en
relación a la muestra de control, por lo que se puede afirmar que la amilasa degradó al
almidón durante el tiempo de incubación.

9. CONCLUSIONES

 La concentración de almidón en la muestra experimental es menor que en la

muestra de control comprobando de esta manera la actividad biológica de la
amilasa.
 En animales, la amilasa es la enzima responsable de las reacciones de hidrólisis de
almidón y glucógeno.
  Los problemas asociados a la producción de esta encima están relacionados a
enfermedades de las glándulas que lo producen y en algunas ocasiones dichas
enfermedades pueden ser de gravedad.
 La actividad de la amilasa podría de cambiar de individuo en individuo generando
de esta manera trastornos metabólicos.
 La amilasa es una enzima de importancia biotecnológica por sus aplicaciones
industriales, por tal motivo es importante dominar técnicas que nos permitan
estudiar sus características cinéticas.

10. CUESTIONARIO

1) Nombre algunas razones por las que la cantidad de amilasa puede aumentar en una
persona.

Por lo general, el aumento en los niveles de amilasa son asociados a lesiones

pancreáticas. Sin embargo, existen además otros factores que pueden afectar la
producción normal de este enzima. A continuación se citan algunos de los principales
razones asociadas a dicho problema:

 Pancreatitis o inflamación del páncreas. Esto hace que los niveles de amilasa y
lipasa aumenten hasta 3 veces el límite normal. Ambos valores deben estar altos
para hacer el diagnóstico de pancreatitis.
 Tumores: los niveles de la enzima amilasa pueden aumentar en algunos tumores
pancreáticos, salivales, prostáticos, pulmonares y ováricos.
 Infección de la vesícula biliar: la inflamación de la vesícula biliar (colecistitis)
puede causar niveles altos de amilasa (hiperamilasemia).
 La insuficiencia renal puede resultar en hiperamilasemia.
 Una reciente colangio-pancreatografía retrógrada endoscópica (CPRE) puede
resultar en hiperamilasemia.
 Medicamentos: algunos pueden provocar pancreatitis con causar hiperamilasemia
e hiperlipasemia.

El riesgo de que un individuo obtenga hiperamilasemia e hiperlipasemia incrementa en

caso de:

 Tener demasiado sobrepeso

 Tener niveles altos de triglicéridos en sangre
 Beber demasiado alcohol
 Si se le ha diagnosticado cálculos en la vesícula (que pueden bloquear el flujo de
secreciones del páncreas a los intestinos)
 Tener historia familiar de pancreatitis.
11. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

- Owyang C. Pancreatitis. In: Goldman L, Ausiello D, eds. Cecil Medicine. 23rd ed.

Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier; 2007:chap 147.

- Prasanna V. (2005). Amylases and their applications. S.P.T. Arts & Science College,
Godhra, 389 001, Gujarat. India. Extraído el 28 de marzo del 2013 desde
http://www.academicjournals.org/ajb/PDF/Pdf2005/Spe%20Rev/Aiyer.pdf

- Tenner S, Steinberg WM. Acute pancreatitis. In: Feldman M, Friedman LS, Brandt LJ,
eds. Sleisenger and Fordtran's Gastrointestinal and Liver Disease. 9th ed. Philadelphia,
Pa: Saunders Elsevier; 2010:chap 58.

- Amilasa en sangre. (s.f.). Medline PLus Extraído el 28 de marzo del 2013 . Disponible
en: http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003464.htm

- Hiperamilasemia (nivel alto de amilasa en sangre) (s.f.). Extraído el 28 de marzo del

2013. Disponible en:
http://chemocare.com/es/chemotherapy/side-effects/Hiperamilasemia.aspx