Universidad Nacional Mayor San Marcos

Universidad del Perú, Decana de América

Facultad de Ciencias Biológicas

Escuela de área profesional de Genética y Biotecnología

CURSO: Microbiología General

SEMANA 5

PRÁCTICA 6

Aislamiento de microorganismos anaerobios

INTEGRANTES

Fernanda Nayli Pomasunco Huillca

PROFESORES

Susana Monica Gutierrez Moreno

Marcos Alejandro Sulca López
Priscila Rosse Mamani Zapana

Lima, Perú, 2022

 I. Introducción

Las bacterias anaerobias son aquellas que para crecer necesitan que la superficie del medio de

cultivo se encuentre libre de oxígeno, ya que este mismo es perjudicial para ellas. La razones

por la que los anaerobios varían su tolerancia al oxígeno son múltiples: una es que la

tolerancia al oxígeno de muchos anaerobios obligado moderados depende de su producción

de superóxido dismutasa (SOD), catalasas y peroxidasas que son protectoras contra los

productos tóxicos de la reducción del oxígeno y otra es que la exposición al 𝑂2 atmosférico

provoca diversas reacciones dentro de las células bacterianas, mediadas por

flavoproteínas.(Beltrán, 2009)

Dentro de los microorganismos anaeróbicos encontramos a los anaerobios facultativos los

cuales crecen mediante procesos oxidativos, utilizando el oxígeno como aceptor final de

electrones, o en anaerobiosis utilizando reacciones de fermentación para obtener energía

(Alzamora, 2004) y a los anaerobios estrictos, los cuales solo obtienen energía de reacciones

fermentativas.

Debido a esta característica no se pueden aislar de igual manera que a una bacteria aeróbica,

para ello encontramos tres métodos: físicos, biológicos y químicos, para esta práctica nos

enfocaremos en los métodos químicos y biológicos con el objetivo de conocer los principios

básicos del estudio de microorganismos anaeróbicos.

II. Métodos

Para la cuantificación de bacterias sulfito reductoras, se diluyó 10 g de heces de vaca

en 90 mL de solución salina para luego colocar 1 mL de la solución madre en 9 mL de

solución salina y por consiguiente de esta dilución obtener 1 mL y colocarla en 9 mL

𝑜
de solución salina. Posteriormente se calentaron las diluciones en baño maría a 80 𝐶

durante 10 minutos. Finalmente se sembraron las diluciones en agar TSC por el

método del estriado por planos.

Para la segunda experiencia se inocularon dos tubos con caldo tioglicolato, uno con

Clostridium sporogenes y el otro con Bacillus subtilis para luego agregar una capa de

parafina,, posteriormente por el método de punción se sembraron dos tubos con agar

nutricio, en el primero Clostridium sporogenes y en el segundo Bacillus subtilis.

Para la tercera experiencia se utilizó la dilución a -2 y una cepa de Clostridium con

los cuales se inocularon en un caldo de carne glucosado, el cual fue calentado

previamente a la siembra, por el método de punción ; finalmente a ambos tubos se

agregó parafina.

Para la cuarta experiencia se sembró en un tubo con agar inclinado Clostridium

sporogenes y otro con Bacillus subtilis. Después de sembrar cada tubo se los tapó con

algodón y luego con el mando del asa de siembra se empujó el algodón hasta tocar el

agar, posteriormente se le añadió ácido pirogálico y luego se le agregó a cada tubo 3

gotas de hidróxido de sodio al 4%. Finalmente se taparon los tubos con un tapón de

jebe y colocamos los tubos en posición invertida.

En la quinta experiencia se utilizaron las dos últimas diluciones preparadas en la

primera experiencia, de cada dilución se recolectaron 0.1 mL con pipeta y se

colocaron en tubos con agar TSC licuado posteriormente se agitaron en vortex.

En la sexta experiencia se utilizó el método biológico en el cuál se utilizaron dos

placas petri y se dividieron por la mitad cada una. En la primera placa petri se sembró

por estriado Clostridium sporogenes y Bacillus subtilis, en la segunda placa se sembró

la primera dilución de la muestra de heces y Bacillus subtilis.

Figura 1. Cultivo de Clostridium sporogenes y

Bacillus subtilis

Figura 2.Tubos inoculados con Clostridium

sporogenes y Bacillus subtilis
III. Resultados

Cuantificación de bacterias sulfito reductoras

No se observó la formación de colonias negras, es decir, no hubo crecimiento de

colonias de bacterias anaeróbicas, sin embargo, en una de las placas, la diluida al -2,

si se observó la formación de una colonia blanca.

Figura 3. Placa petri con agar TSC sembrada con la

dilución -2 de la muestra de heces de vaca incubada
por 48 horas.

Figura 4. Placa petri con agar TSC sembrada con la

dilución -3 de la muestra de heces de vaca incubada
por 48 horas.

Caldo Tioglicolato

En el tubo con caldo tioglicolato en el cual se sembró Clostridium sporogenes se

observó turbidez lo que indica la presencia de bacterias anaerobias , sin embargo en

los tubos restantes no se observó ningún cambio.

 Figura 5. Tubos con caldo tioglicolato sembrados
con Clostridium sporogenes y Bacillus subtilis
incubados 48 horas

Figura 6. Tubos con agar nutricio sembrados con

Clostridium sporogenes y Bacillus subtilis
incubados 48 horas

Medio carne cocida

Después de incubar los tubos por 48 horas no se observó la presencia de turbidez ni de

gas.
 Figura 7. Tubos con caldo carne glucosado
sembrados con Clostridium sporogenes y la dilución
-2 de la muestra de heces de vaca incubados 48
horas

Cultivo usando Pirogalol e NaOH

No se pudieron observar formación de colonias negras indicando que posiblemente no

haya presencia de bacterias anaerobias.

Figura 8. Tubos con agar inclinado sembrados con

Clostridium sporogenes y Bacillus subtilis
incubados 48 horas
Cultivo en Agar TSC licuado

No se observó la formación de colonias negras a lo largo del tubo indicando que

posiblemente no haya presencia de bacterias anaerobias, sin embargo al recolectar con

el asa de siembra el cultivo y realizar la tinción de Gram se pudo observar bacilos

gram positivos con esporas.

Figura 9. Tubos con agar TSC licuado con las

diluciones a -2 y -3 de la muestra de heces de vaca
incubados 48 horas

Figura 10. Bacilos esporulados Gram positivos

Cultivo por método biológico

En ambas placas petri se observó el la formación de colonias de Bacillus subtilis de

color blanquecino de borde irregular, por otro lado no se observó la formación de

colonias negras en el lado correspondiente a Clostridium sporogenes ni en el lado

correspondiente a la muestra de heces de vaca diluidas en solución salina.

IV. Discusión

El cultivo de los Clostridium exige una atmósfera exenta de oxígeno, lo que se

consigue por el cultivo en anaerobiosis, es decir, haciendo uso de cámaras

anaeróbicas, según Díaz et al. (2014) otra forma de obtener el cultivo es mediante el

cierre del medio sembrado con una capa de parafina, otro método es la siembra en

profundidad del medio.

El uso de la cámara anaeróbica garantiza que las condiciones a las cuales se van a

someter las placas petri sean anaeróbicas lo cual es importante para la formación de

colonias de Clostridium ya que estas bacterias son estrictamente anaeróbicas, por lo

que esto explicaría el porqué no hubo crecimiento de estas bacterias.

V. Conclusiones

Se usaron diferentes medios de cultivos para obtener la formación de colonias de

bacterias anaerobias, sin embargo, no se obtuvieron resultados favorables para el caso

de las bacterias anaerobias estrictas, como lo es Clostridium sporogenes. En el caso de

una bacteria anaerobia facultativa como Bacillus subtilis si se pudo observar la

formación de colonias en las placas petri con agar nutricio, al ser ser anaerobias

facultativas pueden crecer en mediante procesos oxidativos, usando el oxígeno como

su receptor final de electrones.

VI. Cuestionario

1. ¿Por qué debe calentarse la dilución de la muestra antes de sembrarse en el medio?

Se calienta la dilución con el fin de obtener esporas, ya que las esporas de

Clostridium tienen la propiedad de reducir el ion sulfito a sulfuro en presencia del

citrato férrico u otra sal de metales pesados, formando colonias negras características,

además estas esporas son termorresistentes por lo que se aprovecha esta característica
 𝑜
elevando la temperatura a 80 𝐶 y así eliminar las células vegetativas existentes en la

dilución con el fin de obtener un cultivo puro de Clostridium.

2. ¿Cuál es la diferencia que existe entre una bacteria anaerobia, una microaerófila y

una anaerobia facultativa?

Bacteria anaerobia:Las bacterias anaerobias cuentan con un metabolismo que genera

su energía a partir de sustancias que carecen de oxígeno, lo hacen generalmente a

través de procesos de fermentación, aunque en ocasiones, como en el caso de las que

se encuentran en grietas hidrotermales marinas a grandes profundidades, que lo hacen

mediante reacciones que emplean compuestos químicos inorgánicos. Dentro de ellas

podemos encontrar a las anaerobias estrictas y las anaerobias facultativas.

Microaerófila: Son bacterias que requieren la mínima concentración de oxígeno (en

forma típica 2 a 10%) y, en muchos casos, una concentración elevada de dióxido de

carbono; crecen muy poco en condiciones anaerobias

Bacteria anaerobia facultativa: Son bacterias que crecen mediante procesos

oxidativos, utilizando el oxígeno como aceptor final de electrones, o en anaerobiosis

utilizando reacciones de fermentación para obtener energía

3. ¿Qué finalidad tiene el empleo de sustancias reductoras para el aislamiento?

La adición de determinadas sustancias a un medio de cultivo puede convertirlo en

selectivo. Así, por ejemplo, la adición de cristal violeta, sales biliares, azida sódica,

telurito potásico, antibióticos, etc., a una concentración adecuada hará que actúen

como agentes selectivos frente a determinados microorganismos.

VII. Referencias bibliográficas

Alzamora, A. A. O. (2004). Microbiología endodóntica. Duazary: Revista internacional de

Ciencias de la Salud, 1(1), 39-44.

Beltrán, L. A. Q. (2009). Infecciones por bacterias anaerobias: Criterios de manejo clínico y

 procedimientos microbiológicos de diagnóstico. Revista logos ciencia y tecnología,

1(1), 119-136.

Cobo, C. F. (2017). Evaluación de medios de cultivo líquidos para la multiplicación de la

bacteria Bacillus subtilis [Trabajo de titulación]. Universidad San Francisco de Quito.

https://repositorio.usfq.edu.ec/bitstream/23000/6598/1/131031.pdf

Corrales, L. C., Antolinez Romero, D. M., Bohórquez Macías, J. A., & Corredor Vargas, A. M.

(2015). Bacterias anaerobias: Procesos que realizan y contribuyen a la sostenibilidad

de la vida en el planeta. Nova, 13(24), 55-81.

Díaz, M., del Pilar, M., Darré, M., Cofre, M., López, M., Condorí, M., Lazarte, D., Trevisán, V.,

Peirano, C., Del Bó, C., Cañete, A., & del Carmen, M. (2014). Análisis microbiológico

de los alimentos.

http://www.anmat.gov.ar/renaloa/docs/analisis_microbiologico_de_los_alimentos_vol

_iii.pdf