Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Universidad del Perú , Decana de América.

Facultad de Farmacia y Bioquímica
Escuela Profesional de Farmacia y Bioquímica

INOCUIDAD DE LOS ALIMENTOS

INFORME 4: Bacterias coliformes. Coliformes termotróficos E. coli. Método del

Número Más Probable (NMP). Pruebas bioquímicas de identificación.

Integrantes:

● Bautista Samaniego, Pedro

● Bravo Becerra, Eliana
● Herrera Ccari Rubén
● Pérez Noriega, Jilmer
● Valles Casimiro, Alison
● Yupanqui Gallegos, Briggitte

Docentes:

❖ Q.F. Teresa Celina Gallardo Jugo

❖ Mg. Celia B. Vargas De la Cruz

Lima - 2021
 INFORME PRÁCTICA Nº 4

I. OBJETIVOS

❖ Conocer los procedimientos para la determinación de coliformes totales,coliformes

termotróficos y E.coli.
❖ Interpretar los resultados obtenidos para poder dar un resultado cuantificable de
coliformes totales,coliformes termotróficos y E.coli.

II. COLIFORMES

A. Prueba presuntiva:

Medio de cultivo, temperatura y tiempo de incubación: Caldo LST, 35°-37°C, 24-48 horas

Fundamento de las reacciones:

En el medio LST, el desarrollo de microorganismos fermentadores de lactosa se produce de
acuerdo a sus componentes y función de cada uno de ellos, es así que la triptosa es la fuente
de nitrógeno, vitaminas, minerales y aminoácidos, la lactosa es el hidrato de carbono
fermentable, las sales de fosfato proveen un sistema buffer, y el cloruro de sodio mantiene
el balance osmótico y el lauril sulfato de sodio inhibe el desarrollo de la flora acompañante.
Por la fermentación de la lactosa, se produce ácido y gas, éste último se evidencia al utilizar
las campanas Durham. 1

B. Prueba confirmativa:

Medio de cultivo, temperatura y tiempo de incubación: Caldo lactosado verde Brillante Bilis
(CLVBB), 35°-37°C, 24-48 horas
Fundamento de las reacciones:
En el medio de cultivo CLVBB, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado
desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes selectivos que inhiben el
desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas a excepción de coliformes, y la
lactosa es el hidrato de carbono fermentable. Es una propiedad del grupo coliforme, la
fermentación de la lactosa con producción de ácido y gas. 2

III. COLIFORMES TERMOTRÓFICOS

Medios de cultivos, temperatura y tiempo de incubación: Caldo EC, 44.5 ± 2° C, 24-48 horas.

Fundamento de las reacciones:

En el medio de cultivo la tripteína es la fuente de péptidos, aminoácidos y nitrógeno. La
lactosa es el hidrato de carbono fermentable y favorece el desarrollo de bacterias
coliformes, las sales biliares inhiben el crecimiento de la flora acompañante Gram positiva,
las sales fosfato constituyen un sistema buffer que impide que los productos ácidos
originados por la fermentación de lactosa afecten el crecimiento microbiano y el cloruro de
sodio mantiene el balance osmótico.3
E. coli

Fundamento de las pruebas IMViC

- Prueba de Indol:
Determina si la bacteria posee la enzima triptofanasa. La triptofanasa hidroliza el
triptófano en indol y alanina. El triptófano forma parte de las peptonas del medio.
La degradación del triptófano proporciona como productos indol, energía, acido
pirúvico y amoniaco. La molécula de indol liberado se detecta mediante la
incorporación del reactivo de Kovac’s que se combina químicamente produciendo
un color rojo cereza en la capa superior del caldo de cultivo. 4
- Prueba de Rojo de metilo:
El resultado positivo de esta prueba se muestra cuando el caldo de cultivo tiene un
pH menor a 4,5 por lo que se torna rojo, esto quiere decir que el microorganismo
genera gran cantidad de ácidos orgánicos como productos finales. Caso contrario si
el pH del medio se incrementa a un valor de 6 o superior debido a la producción de
etanol y acetoína, el caldo tiende a tomar un color amarillo. 4
- Prueba Voges-Proskauer:
Se fundamenta en la detección de acetoína, que se obtiene a partir de la
degradación de glucosa en bacterias. La familia Enterobacteriaceae se divide en dos
grupos, fermentadoras de ácidos mixtos y fermentadores del 2,3-butanodiol. 4
La acetoína en contacto con el oxígeno y la potasa origina diacetilo. El alfa naftol
incrementa la sensibilidad de la reacción. El diacetilo origina un compuesto de color
rosado. Y eso se debe a que cuando el núcleo de guanidina que se encuentra en la
peptona del medio reacciona con el diacetilo y provoca un color rosa. Además algo
del 2,3-butanodiol puede oxidarse a acetoína y es por esto que en la fase que se
encuentra expuesta al aire la formación de color es más notoria. 4
La prueba será positiva si en 20 minutos aparece una coloración roja. Los cultivos
negativos se incuban 1-2 horas a 37 °C en posición inclinada efectuándose de nuevo
la lectura. Asimismo el contacto con el oxígeno y la elevada temperatura favorecen
la reacción.4
- Prueba de consumo de Citrato: Esta prueba se usa para distinguir aquellos
microorganismos que poseen la capacidad de emplear citrato como única fuente de
carbono y sales inorgánicas de amonio como única fuente de nitrógeno. 4
La utilización de citrato depende de la existencia de la enzima citrato permeasa
producida por el microorganismo, esta enzima ayuda al transporte del citrato hacia
el interior de la célula. El azul de bromotimol se utiliza como indicador (verde a pH
neutro y azul a pH mayor a 7.6); cuando el citrato de sodio se metaboliza, se genera
dióxido de carbono que se combina con sodio y agua para formar carbonato sódico
que es un producto alcalino responsable del cambio de color del indicador de verde
a azul siendo esto una prueba positiva.4
IV. RESULTADOS

Coliformes E.C E. coli

Diluciones
P.P P.C C.T I RM VP C Observaciones

I RM VP C

10-1 +++ ++- -+- --- -+- --- --- E. coli indol -

10-2 -++ --+ --+ --- --- --- --- E. coli indol -

10-3 ++- --- --- --- --- --- --- E. coli indol -

● CÓDIGO Coliformes: 2 1 0 NMP/g o ml Coliformes: 15 NMP/mL

● CÓDIGO Col. termotrófico: 1 1 0 NMP/g o ml Coli. termotrófico : 7 NMP/mL
● CÓDIGO E. coli:1 0 0 NMP/g o mi E. coli: 4 NMP/mL

V. DISCUSIÓN

Los coliformes son bacterias gramnegativas, anaerobias facultativas en forma de bacilo.

Entre las características más resaltantes se tiene que la identificación se puede con la
producción de gas a partir de glucosa (y otros azúcares) y la fermentación de lactosa a ácido
y gas dentro de las 48 horas a 35ºC. La prueba más relevante utilizada para la determinación
de coliformes, es la hidrólisis de la lactosa. El rompimiento de este disacárido es catalizado
por la enzima ß-D-galactosidasa.5,6

Entre los coliformes se incluyen especies de los géneros Escherichia, Klebsiella, Enterobacter
y Citrobacter, e incluye E. coli. Este grupo incluye coliformes termotolerantes y bacterias de
origen fecal, así como algunas bacterias que pueden aislarse de fuentes ambientales. Por lo
que, la presencia de coliformes totales puede indicar o no contaminación fecal. 5

Los coliformes termotróficos, suelen crecer a temperaturas mayores como 44 o 44.5 °C,
estos pueden no ser de origen fecal. Sin embargo, la presencia de coliformes
termotolerantes casi siempre indica contaminación fecal. Por lo general, más del 95 % de los
coliformes termotolerantes aislados del agua son el organismo intestinal Escherichia coli,
cuya presencia es prueba definitiva de contaminación fecal. Como resultado, a menudo no
es necesario realizar más pruebas para confirmar la presencia específica de E. coli. La
detección de los coliformes termotróficos se realiza en medios que contienen lactosa y a
temperaturas de 44 °C, se identifican provisionalmente por la producción de ácido y gas a
partir de la fermentación de lactosa.6

Por otro lado, E. coli se encuentra naturalmente en el tracto intestinal de todos los animales
de sangre caliente, incluidos los humanos. La infección alimentaria por E. coli causa
 calambres abdominales, diarrea con sangre o agua, fiebre, náuseas y vómitos La presencia
de este microorganismo es indicativo de contaminación fecal. 5

Para la identificación de este grupo, se puede usar la técnica de fermentación en tubos

múltiples el cual consiste en inocular una serie de tubos con diluciones decimales de la
muestra de agua. La producción de gas, formación de ácido o abundante crecimiento en los
tubos después de 48 h de incubación a 35 ºC constituyen resultados presumiblemente
positivos. Todos los tubos con reacción presumiblemente positiva son inmediatamente
sometidos a pruebas de confirmación. La formación de gas en caldo lactosado bilis verde
brillante en los tubos de fermentación tras 48 h de incubación a 35 ºC constituye una prueba
de confirmación positiva. La prueba de coliformes fecales usando medio Escherichia coli
(EC), puede aplicarse para determinar coliformes totales y fecales, la producción de gas
después de 48 h de incubación a 44,5 ºC en caldo EC se considera un resultado positivo. Los
resultados de la técnica FTM se expresan en términos del número más probable (NMP) de
microorganismos presentes.7

En la práctica, se analizó una muestra de alimento líquido de lo cual se obtuvo 15 NMP/mL lo

que quiere decir que en la prueba confirmatoria 2 tubos de la dilución 10 -1 y 1 tubo de la
dilución de 10-2 fueron positivos lo que indica que en el caldo lactosado verde brillante hubo
formación de gas por la acción de la ß-D-galactosidasa, lo cual es una característica
importante para los coliformes confirmando así su presencia en el alimento. Así mismo,
cuando se realizó la prueba en el caldo E.C se obtuvo 7 NMP/mL fueron positivos lo que
quiere decir que 1 tubo de la dilución 10 -1 y 1 tubo de la dilución de 10 -2 fueron positivos lo
cual es indicativo que este medio al ser incubado a temperaturas mayores comparado con la
prueba anterior, fueron capaces de crecer y formar gas, lo cual indica que se trata de
coliformes termotróficos. Por otro lado, al realizar las pruebas IMViC, se obtuvo 4 NMP/mL
fueron positivos lo que indica que solo 1 tubo de la dilución 10 -1 dió resultados
característicos a estas pruebas, como lo son indol negativo, rojo de metilo positivo, Voges
Proskauer negativo y citrato negativo.

VI. CONCLUSIONES

❖ Se conocieron los procedimientos para la determinación de coliformes totales,el

cual requiere de una prueba presuntiva y confirmativa; de coliformes termotróficos,
que requiere una mayor temperatura de incubación (44.5ºC aproximadamente) y
E.coli, que requiere de la prueba IMViC.
❖ Se interpretaron los resultados obtenidos para poder dar un resultado cuantificable
(en NMP/ g o mL de muestra) de coliformes totales,coliformes termotróficos y E.coli,
esto en función del número de tubos que dan positivo a las diferentes pruebas y el
nivel de su dilución.
VII. CUESTIONARIO

1. Explique brevemente los criterios que se deben considerar para seleccionar un indicador
de patógenos entéricos

Las características ideales de un buen indicador incluyen:

- Que estén limitados al hábitat intestinal.

- Que sean detectados en la muestra cuando los patógenos fecales están presentes.
- Mostrar mayor resistencia que los patógenos frente a desinfectantes y condiciones
adversas en el ambiente .
- Ser incapaces de multiplicarse en el ambiente.
- De detección fácil, rápida y con métodos económicos.
- La densidad del indicador debe correlacionarse con el grado de contaminación fecal
o con el riesgo a la salud

Es recomendable seleccionar el indicador más adecuado a las condiciones locales. 8

2. ¿Por qué los coliformes termotrófico son considerados un mejor indicador de patógenos
entéricos que los coliformes?
Esto debido a que la determinación de coliformes termotróficos (o coliformes de origen
fecal) que toleran hasta 45ºC, permite detectar Escherichia coli, bacteria termotolerante,9 el
cual es el más adecuado indicador de contaminación fecal, debido a su presencia en
elevadas cantidades en heces humanas y animales, en aguas residuales y en agua con
reciente exposición a contaminación fecal, 10 dentro de las especies patógenas entéricas de
E. coli se encuentran, la E. coli enterohemorrágica (ECEH), en particular el serotipo O157:H7
de E. coli, que es causante principal de colitis hemorrágica, E. coli enterotoxigénica (ETEC) y
E. coli enteropatógena (ECEP).11 A su vez dentro de este grupo de coliformes termotróficos
encontramos a Citrobacter freundii, causante de infecciones intestinales y extraintestinales. 9,
12

VIII. Referencias Bibliográficas:

1. Britania Lab. Lauril Sulfato Caldo [internet]. [Citado el 07 de Nov de 2021]. Disponible en:
https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_60706ced914d3.pdf
2. Britania.com. Verde Brillante Bilis 2% Caldo. [ Citado el 7 de Nov de 2021]. Disponible en:
https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_6054e8cd82576.pdf
3. Britania.com. E. C. Medio. [ Citado el 7 de Nov de 2021]. Disponible en:
https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_6092dcb116850.pdf
4. Muso Jami, E. F. Evaluación de bioaerosoles asociados en el sitio de desposición final de
residuos sólidos en la Empresa Pública de Aseo y Gestión Ambiental del cantón Latacunga
(EPAGAL) (Bachelor's thesis, Universidad Técnica de Ambato. Facultad de Ciencia e
Ingeniería en Alimentos. Carrera de Ingeniería Bioquímica). 2017. [ Citado el 7 de Nov de
 2021]. Disponible en: http://repositorio.uta.edu.ec/bitstream/123456789/25304/1/BQ
%20119.pdf
5. Coliformes. Cap 14. Oregon State University Disponible en:
https://seafood.oregonstate.edu/sites/agscid7/files/snic/compendium/chapter-14-
coliforms-fecal-coliforms.pdf
6. Bartram J., Ballance J. Water Quality Monitoring - A Practical Guide to the Design and
Implementation of Freshwater Quality Studies and Monitoring Programmes. Chapter 10.
Disponible en:
https://www.who.int/water_sanitation_health/resourcesquality/wqmchap10.pdf
7. Larrea-Murrell, Jeny Adina, Rojas-Badía, Marcia María, Romeu-Álvarez, Beatriz, Rojas-
Hernández, Nidia Mercedes, Heydrich-Pérez, Mayra, Bacterias indicadoras de
contaminación fecal en la evaluación de la calidad de las aguas: revisión de la literatura.
Revista CENIC. Ciencias Biológicas [Internet]. 2013;44(3):24-34. Recuperado de:
https://www.redalyc.org/articulo.oa?id=181229302004
8. Leclerc H., Mossel S., Edberg C., Struijk B. Advances in the bacteriology of the coliform
group: Their suitability as markers of microbial water safety. Annual Review Microbiology:
2001; 55: 201-234.
9. Larrea J, et al. Bacterias indicadoras de contaminación fecal en la evaluación de la calidad de
las aguas: revisión de la literatura. Revista CENIC Ciencias Biológicas.2013; 44 (3): 24-34.
10. Fernández M. Determinación de coliformes totales y fecales en aguas de uso tecnológico
para las centrífugas. ICIDCA.2017; 51 (2): 70-73.
11. Vandenberg O, Gerard M, Kane A. Guide to infection control in the healthcare setting.
Bacterial enteric pathogens: Clostridioides difficile, Salmonella, Shigella, Escherichia coli, and
others. [Internet]. Citado: 6 de noviembre del 2021.Disponible en:
https://isid.org/guide/pathogens/bacterial-enteric-pathogens/
12. Ullauri C, Freire S. Citrobacter freundii multirresistente como agente etiológico de infección
de vías urinarias. Kasmera.2019;47 (1): 9-13.