Instrucciones: Resuelva cada uno de los siguientes problemas, en equipos de dos

personas. Para los textos utilice letra arial de 2 puntos, espaciado sencillo, texto
justificado. Las grficas, dibujos, as como los resultados de regresin (donde se requiera)
debern ser insertados como imagen.

1. Las etiquetas de cuatro frascos (A, B, C y D) de conjugados de Hapteno-acarreador

de perdieron accidentalmente. Sin embargo, se saba que cada frasco contena 1)
Hapteno 1-acarreador 1 (H1-A1), 2) Hapteno 1- acarreador 2 (H1-A2), 3) Hapteno 2
acarreador 1 (H2-A1) y 4) Hapteno 2 acarreador 2 (H2-A2). El acarreador 1 tiene un
peso molecular de 60,000 daltones y el acarreador 2 uno mayor, de 120,000
daltones. Suponga que tiene un anticuerpo anti-H1 y uno anti-H2 (ambos de conejo) y
marcadores de peso molecular de 150,000, 100,000 y 80,000 daltones. Utilice
western-blot para determinar el contenido de cada frasco y muestre los patrones de
reconocimiento que cabra esperar de 1, 2, 3 y 4. Su respuesta tambin debe indicar
que anticuerpo o combinacin de anticuerpos se utilizara para cada prueba, as
como la explicacin de su razonamiento.

2. Ud Usted obtiene una preparacin de albmina srica bovina (BSA) purificada de

suero normal de bovino. Para determinar si en la preparacin de BSA quedan
algunas otras protenas sricas decide utilizar western-blot.
a) Qu antgeno utilizara para preparar el antisuero necesario para
detectar la impureza en la preparacin de BSA?
b) Asumiendo que la preparacin de BSA es pura, dibuje en patrn
electrofortico que cabra esperar, si utilizar el anticuerpo preparado en
el inciso a.
En ambos casos, esplique su razonamiento.

3. Ud., inmuniza un ratn con un antgeno denominado p30qfb, para la obtencin

de anticuerpos monoclonales. Despus de realizar el procedimiento de fusin,
seleccin de hibridomas y clonacin, obtiene un anticuerpo de clase IgG que
denomina QFB.313.

a. Realiza la titulacin del anticuerpo por ELISA, para lo cual, sensibiliza una
placa de poliestireno con una solucin de p30qfb (30 g/mL), Despus del
proceso de bloqueo, adiciona diferentes diluciones del Ab QFB.313 y deja
interaccionar durante una hora a 37C. Lava la placa tres veces y adiciona
un anticuerpo anti-ratn conjugado a HRP. Repite la incubacin y el lavado y
revela con H2O2-OPD y despus de 15 minutos detiene la reaccin con
H2SO4 8N. Lee la absorbancia a 490 nm y los resultados que obtiene son los
siguientes (Valores brutos):

1/dilucin de
mAb QFB.313
1600
3200
6400
12800
25600
51200
102400
204800
409600
Abs control Negativo = 0.095

A490 nm
1.5
1.5
1.5
0.98
0.754
0.54
0.205
0.2
0.1

Haga un grfico de los resultados, determine la ecuacin de la recta y calcule el

ttulo del anticuerpo, definido ste como la dilucin con la que se obtiene el 50%
de la interaccin mxima, medida como absorbancia (redondee sin decimales).
b. Posteriormente, realiza un ensayo competitivo para determinar la
especificidad del Ab QFB.313, para lo cual mezcla 0.1 g del Ab QFB.313
con diferentes cantidades del antgeno p30qfb o de otro antgeno
denominado BGM. Esta mezcla la utiliza como anticuerpo primario para
realizar un ensayo de ELISA similar al descrito en el prrafo (a) y obtiene los
siguientes resultados (valores brutos):

A490 nm
[g Ag]
adicionado
0
1
2.5
5
10
15
20
Abs. Control negativo = 0.095

p30qfb
0.65
0.555
0.425
0.327
0.175
0.1
0.095

BGM
0.65
0.65
0.65
0.65
0.65
0.65
0.65

Haga un grfico de los resultados.

Cules son sus conclusiones de este experimento?

c. Finalmente, para calcular la constante de afinidad del Ab QFB.313, utiliza el

mtodo descrito por Beatty et al (1987)*, basado en la ley de accin de
masas. Para ello, sensibiliza una placa de poliestireno con diferentes
concentraciones de p30qfb (3, 2, 1.5, 1 y 0.5 g/mL). Despus de
bloquearlas, se incubaron con diferentes concentraciones del Ab QFB.313 (5
diluciones dobles seriadas, iniciando con 3.0 g/mL) y se prosigui con el
ensayo de manera similar a lo descrito en el inciso (A) y obtiene las
absorbancias a 490 nm. Los resultados obtenidos (brutos) se muestran en la
siguiente tabla:

[mAb] g/mL

3
0.715

[Ag] g/mL
2
1.5
0.645
0.605

1
0.515

0.5
0.445

0.575

0.505

0.425

0.365

0.315

0.495

0.425

0.335

0.285

0.245

0.465

0.385

0.295

0.245

0.215

0.445

0.375

0.265

0.225

0.195

0.435

0.365

0.255

0.215

0.185

3
Dilucin 1
Dilucin 2
Dilucin 3
Dilucin 4
Dilucin 5
Control Negativo = 0.065
CTRL Abs Max = 0.65 (indica la mxima absorbancia obtenida, y representa el 100% de
interaccin [Ag-Ab]).
i.

Calcule la ecuacin de la recta para cada una de las concentraciones

de Ag utilizadas, utilizando los datos de absorbancia vs concentracin
de mAb QFB.313.

ii.

Utilizando la ecuacin de la recta, calcule la concentracin del mAb

necesario para obtener el 50% de la unin con el Ag, con respecto al
CTRL Abs Max..

iii.

Calcule la constante de afinidad del mAb QFB.313, para lo cual

seleccione los dos valores ms cercanos de la concentracin de mAb
calculada al 50% de la unin (inciso b), [Ab1(50%)] y [Ab2(50%)], para
utilizarlos en la siguiente ecuacin:

 = 1/2(2 [1(50%)] [2(50%)])

Nota: La concentracin a sustituir en la frmula anterior debe ser expresada en molaridad
(M). Para ello, considere lo siguiente:
-

1 molcula de IgG equivale a 2.490795x10-16 mg

Molaridad = moles/litro

* Beatty, J. D., Beatty, B. G. & Vlahos, W. G. (1987). Measurement of monoclonal antibody affinity by noncompetitive enzyme immunoassay. Journal of Immunological Methods 100(12): 173-179.

4. Ud. recibe una muestra de un antgeno X cuya identidad podra ser:

a. hemoglobina humana
b. GAPDH humana
c. Hemoglobina de Chimpanc
Para determinar la identidad del antgeno X decide utilizar Ochtelony, para lo
cual se hace llegar de anticuerpos dirigidos contra cada una de las protenas
probables. Si la identidad de su protena es GAPDH humana, indique cules son
los patrones de precipitacin que obtendra si hiciese la siguiente distribucin:

Explique su respuesta.