Universidad Mariano Gálvez

Facultad de Ciencias Químicas y Biológicas

Biología Celular
Instructor: Licda. Swanny Villagran
Sección: A

Nombres: Sofía Alejandra Herrera Munguía Carné:1009-19-462

Angelee Dallys Cabrera Herrera Carné:1409-19-25893
Paula Isabel Recinos Urízar Carné:1009-20-24808

Práctica No.4
Lisis Celular

I. Resumen:
En la practica No. 4 se realizaron distintos procedimientos para poder llegar a una lisis celular la
cual se lllevo acabo con una una muestra de sangre periferica con EDTA centrifugada para la
obtencion de la capa de leucocitos, la cual se traslado a un tubo conico, agregando buffer de
amonio homogenizado periodicamente en un ambiente frio prosiguiendo a una segunda
centrifugacion con el fin de crear un presipitado de leucocitos en el fondo de nuestro tubo, en este
punto se observa el rompimiento de la membrana (lisis celular) que se estaba produciendo en los
leucocitos, se agrego por segunda el procedimeinto de agregacion de buffer de amonio al
precipitado de leucocitos; posteriomente se realizaron dos lavados y centrifugaciones con solucion
salina para la resuspencion de la muestra. Finalmente se agrego RNALAter para una mejor
preservacion de la muestra y asi poder utilizarla con mayor facilidad en practicas posteriores.

II. Metodología:
La práctica se realizó en grupos de tres personas, el equipo e instrumentos utilizados fueron: buffer
de amonio, solucion salina isotonica 0.9%, computadoras, centrifuga, tubos conicos y refrigerador.
Se recopilaron y analizaron los datos de forma ordenada y limpia manteniendo el orden ya que se
trabaja con sangre. Se tomo el timepo exacto a la hora de refrigerar y centrifugar la muestra.

III. Resultados:
• Cuadro 1: características de dos prácticas.
Práctica Características de células

Práctica 1: se utilizó buffer mal preparado. Después de realizar la extracción de la capa

de leucocitos se depositó en un tubo de 15 mL
y se añadió 10 mL de buffer, se homogenizó y
se colocó en la centrifugadora. Al retirar el
tubo de la centrifugadora se pudo observar
que el sobrenadante carecía completamente
de color lo cual no era el resultado esperado,
se esperaba observar sobrenadante de color
 rojo pálido, esto ocurrió con los tres lavados
con buffer. No se obtuvo la coloración
esperada debido a que el buffer no provocó
lisis en las células.

Práctica 2: se utilizó buffer preparado Se realizaron los mismos pasos que en la

correctamente. primera práctica, pero los resultados
obtenidos fueron distintos debido a que el
buffer que se utilizó si fue preparado
correctamente. El sobrenadante que se
observó en las centrifugaciones presentó la
coloración esperada, esto fue gracias a que el
buffer logró la lisis de las células.

IV. Discusión.

En el cuadro No.1 de la comparación entre las dos prácticas, en la cual se observan las
diferencias que se obtuvieron en base a la correcta preparación del buffer o
amortiguador, ya que este es una solución que puede absorber grandes cantidades
moderadas de ácidos o bases, sin un cambio significativo en su pH, es decir, es una
disolución que contiene unas sustancias que inhiben los cambios de pH, o concentración
de ion hidrógeno de la disolución (Gal, 2007). En este caso se utilizó el cloruro de amonio
(NH 4 Cl) pues sirve para la preparación de soluciones buffer hemolisantes. El eritrocito
es permeable al amonio por lo cual, al someterlo a una solución isotónica de NH 4 Cl, la
célula se rompe fácilmente. Es el NH3 el que ingresa libremente a la célula, una vez
dentro del eritrocito, el NH3 se convierte en NH4 + y se mantienen en equilibrio según las
concentraciones de OH – y Cl - . El OH - sale de la célula e ingresa el Cl - , resultando
en un flujo neto de NH 4 Cl y seguido por la hemolisis. Al utilizar este principio, es posible
separar los leucocitos de los eritrocitos al realizar una lisis diferencial de amonio. (Castell,
2013) Esto se realiza a través de centrifugación, descarte de sobrenadante y
refrigeración; Sin embargo, el error cometido en la primera prueba fue el exceso de EDTA
pues se agregó mil veces más a la solución amortiguadora, la cual debía estar compuesta
de 83 g NH4Cl, 0.84 g NaHCO3 y 23.3 mg EDTA.
A comparación de la siguiente prueba, se obtuvieron mejores resultados pues en la
última centrifugación el sobrenadante se observó con un tono rosado, el cuál indica que
se ha realizado correctamente el procedimiento para observar los leucocitos en la
sangre.
Además, existen otros métodos, en los que se realiza la extracción del ARN es a través
de micelio homogenizado mediante maceración con nitrógeno líquido o liofilización
(Christ Alpha 1-4LD) por 48 horas, Trizol reagent (Life Technologies), protocolo CTAB
con precipitación con LiCl2 (Chang et al., 1993) y RNeasy Mini Kit.

V. Conclusión.
• Utilizar el buffer de cloruro de amonio, es posible separar los leucocitos de los
eritrocitos al realizar una lisis diferencial de amonio.
 • Los leucocitos presentan una membrana con características distintas al eritrocito,
lo que las hace más resistentes a la influencia de la solución de NH4Cl.
• Estar atentos de los cálculos y preparación de las soluciones a utilizar, para evitar
errores en la práctica.

VI. Bibliografía.
➢ Gal, B. (2007). Bases de la fisiología. Editorial Tebar. 2da Edición. España. 626
págs.
➢ Castell, AE., Leucuona, MA. Y Samperdro EA. (2013). Manual de prácticas de
laboratorio de Biología celular e histología Médica. Depto de Biología Celular
y Tisular, Faculta de Medicina, UNAM.
➢ Arif, M., & Ochoa-Corona, F.M. (2013). Comparative assessment of 5′ A/T-rich
overhang sequences with optimal and sub-optimal primers to increase PCR
yields and sensitivity. Molecular Biotechnology, 26 págs.
➢ Chang, S., Puryear, J., & Cairney, J. (1993). A simple and efficient method for
isolating RNA from pine trees. Plant Molecular Biology Reporter, 116 págs.