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Extracción de ADN y Electroforesis

Anaya Jonathan – (1004090232), Fierro Juan-(Salcedo David-(1234789404).

Universidad De Pamplona, Facultad De Ciencias Agrarias, Ingeniería Agronómica

02/06/2019

Resumen

El presente informe consta de la práctica extracción de ADN realizada en el laboratorio de

biología molecular en la Universidad de pamplona por diferentes métodos Kit, manual y
casero y con la ayuda de la prueba de electroforesis lo cual contiene un gel de agarosa a una
concentración de 0.9% que significa 0,9 g/100 ml, para determinar la cantidad y la
concentración de ADN. Para llevar a cabo se realizó el siguiente protocolo que consistió en
adicionar 3 μl Buffer de carga en el Paraflim, es decir, 3 gotas en cada esquina del papel,
posteriormente adicionamos 18 μl de cada una de las muestras de ADN en cada gota, a
continuación tomamos 20 μl de cada muestra de ADN (casera, kit y manual) y procedimos
a sembrarla en el gel de agarosa al 0,9 %.

Se observa de izquierda a derecha el pozo de marcador que sirve como referente para
comparar los métodos de extracción de ADN que determinaran la cantidad que se evidencia
en la prueba de electroforesis, se puede ver una tinción del gel agarosa en el método manual
con 5 kpb y en cuanto a marcador y casero no se evidencio la presencia de ADN en el gel.

Palabras claves: extracción, ADN, electroforesis, agarosa, buffer, lisis celular.

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Introducción
Extracción de ADN
El ADN está constituido por dos cadenas de
nucleótidos unidas entre sí formando una
doble hélice. Los nucleótidos están
integrados por un azúcar (desoxirribosa), un
grupo fosfato y una base nitrogenada
(adenina, guanina, timina o citosina). La
unión de los nucleótidos ocurre entre el grupo
fosfato y el azúcar, mediante enlaces
fosfodiéster, dando lugar al esqueleto de la
molécula. Las bases de cadenas opuestas se
unen mediante puentes de hidrógeno y
mantienen estable la estructura helicoidal (
Dellaporta. 1984)
A lo largo del tiempo se han diseñado
distintos protocolos con la finalidad de
obtener una cantidad y calidad de ADN
adecuados, así como garantizar la
eliminación de inhibidores potenciales que
dificulten el tratamiento posterior de la
molécula. Los métodos tradicionales,
desarrollados en los años 50, utilizan
solventes orgánicos para separar a las
Proteínas del ADN y, una vez suspendido en
la fase acuosa, aislarlo por precipitación con
etanol. . Estos métodos requieren preparar
soluciones y la extracción puede tomar desde
unas horas hasta varios días por los
numerosos pasos que deben realizarse. En
general, los protocolos
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Tradicionales consisten de cinco etapas
principales:
Homogeneización del tejido, lisis celular,
separación de proteínas y lípidos,
precipitación y redisolución del ADN.
(Nasón 1965, Travaglini 1973, Sambrook et
al. 1989, Sinden 1994).
Los grupos fosfato están cargados
negativamente y son polares, lo que le
confiere al ADN una carga neta negativa y lo
hace altamente polar, características que son
Aprovechadas para su extracción. Los grupos
fosfato tienen una fuerte tendencia a
repelerse, debido a su carga negativa, lo que
permite disolver al ADN en soluciones
acuosas y formar una capa hidratante
alrededor de la molécula. Pero, en presencia
de etanol, se rompe la capa hidratante y
quedan expuestos los grupos fosfato. Bajo
estas condiciones se favorece la unión con
cationes como Na+ que reducen las fuerzas
repulsivas entre las cadenas de nucleótidos y
permiten que el ADN precipite. Por otro lado,
la carga neta negativa del ADN le permite
unirse a moléculas y matrices inorgánicas
cargadas positivamente (Sambrook et al.
1989)
Durante el proceso de lisis las interacciones
entre las moléculas que conforman la pared,
la membrana celular y nuclear se modifican o
destruyen permitiendo que los ácidos
nucleicos se liberen (Figura 2). Se utilizan
soluciones básicas, detergentes o agentes
caotrópicos que permiten disolver la
membrana
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Celular, así como inhibidores para inactivar
las enzimas que degradan el ADN. Muchas
soluciones de lisis contienen también EDTA,
que forma un complejo con los iones de
Mg2+ e impide el Funcionamiento de las
DNasas (Sambrook et al. 1989).
Extracción con kit.
A partir de los años 90 se introdujeron al
mercado combos o kits de extracción que
utilizan matrices inorgánicas compactas
cargadas positivamente capaces de retener
varios microgramos de ADN y separarlos del
Resto de las biomoléculas, permitiendo
obtener un extracto libre de inhibidores. Los
combos se venden en presentación de
Membranas de sílice o perlas magnéticas, las
primeras están formadas por una resina y las
segundas consisten de un centro de hierro
recubierto por resina (Guinn 1966, Dundass
et al. 2008).
En los kits es necesario liberar al ADN de la
matriz, La membrana y el ADN se
deshidratan con soluciones de lavado y ciclos
de centrifugación, lo cual es un método para
separar ADN por densidad. después se
recomienda centrifugar nuevamente la
columna para evaporar el etanol y eliminar el
exceso de las soluciones. Posteriormente, se
adiciona agua o solución amortiguadora al
centro de la membrana, se espera a que el
ADN se hidrate, se centrifuga para
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recuperarlo de la matriz y resuspenderlo.
(Tang et al. 2005, Wang et al. 2005).
Es necesario saber que la mayoría de los kits
tienden a ser generales a la hora de su
aplicación, pero se diseñan con un propósito
Específico. Por ejemplo, un kit para extraer
ADN de sangre total, considera la presencia
de hemoglobina y eritrocitos durante el
proceso. Este método será más agresivo en
comparación con un kit diseñado para extraer
ADN de células o tejidos
animales(Invitrogen 2005).
Electroforesis
Para este método se utilizó Buffer de carga
que contiene sucrosa o glicerol, lo cual da
peso a la muestra para que el ADN se
precipite al fondo de los pozos de siembra y
los colorantes. Su función es ayudar a
conducir corriente y controlar el pH.
La agarosa es un polímero lineal de galactosa
y 3,6-anhidrogalactosa. El gel se obtiene
disolviendo la agarosa en un buffer de TAE o
TBE y se funde usando un microondas, hasta
obtener una solución homogénea y
transparente.. Cuando el ADN se deposita en
los pozos del gel debe mezclarse con un
buffer de carga eso permite
Aumentar la densidad de la muestra para
depositarse en el fondo del pozo, teñir la
muestra para facilitar su carga dentro del gel
e identificar la distancia recorrida por las
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Muestras
Alberto Checa Rojas. (2017).
La idea de utilizar la técnica de electroforesis
a través de una matriz para analizar muestras
de ADN corresponde a Vin Thorne, un
bioquímico del Instituto de Virología de
Glasgow, quien a mediados de los años 60 del
pasado siglo estaba interesado en caracterizar
las distintas formas de ADN que seo btenían
de partículas purificadas de polyomavirus. Su
razonamiento era que una combinación de
fuerzas eléctricas y de fricción permitiría el
desplazamiento y separación en función del
tamaño o topología de diferentes moléculas
de ADN.(Electroforesis de ADN Fierro,
francisco)
La electroforesis en geles de agarosa o
poliacrilamida es una de las metodologías
más utilizadas en el laboratorio en todo lo
relacionado con el trabajo con ácidos
nucleicos. Mediante la electroforesis
podemos separar fragmentos de ADN y ARN
en función de su tamaño, visualizarlos
mediante una sencilla tinción, y de esta forma
determinar el Contenido de ácidos nucleicos
de una muestra, teniendo una estimación de
su concentración y grado de entereza.
Podemos además extraer del gel los
fragmentos de ADN que sean de interés, para
Posteriormente utilizarlos en diferentes
aplicaciones. (Thorne 1966, 1967).
Éste es exactamente el principio en que se
basa la electroforesis de ácidos nucleicos.
Sometidos a un campo eléctrico
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la carga neta negativa del ADN y el ARN
hará que estos se muevan en dirección al
ánodo
Si se fuerza a los ácidos nucleicos a moverse
a través de un gel formado por una malla
tridimensional de un polímero como la
agarosa, la fricción hará que las moléculas de
mayor tamaño migren con más lentitud,
mientras las de menor tamaño avanzan más
en el gel, permitiendo que las diferentes
moléculas se separen en función de su
tamaño. Del mismo modo, moléculas de
ADN o ARN con topologías o estructuras
tridimensionales diferentes también se
comportarán de forma diferente ante la
fricción con la malla del polímero,
permitiendo su separación. (Schwartz y
cantor 1984)
Esta técnica fue descrita inicialmente por
Schwartz y Cantor (1984), quienes
construyeron un aparato de electroforesis
ortogonal en el cual dos campos eléctricos en
ángulo sobre el gel funcionaban de forma
alterna. El fundamento de esta técnica es la
reorientación de las moléculas cuando
cambia la dirección del campo eléctrico; en la
electroforesis convencional las moléculas de
ADN de gran tamaño quedan “atrapadas” en
la malla que forma la agarosa en su avance a
través del gel, pero la aplicación de dos
campos eléctricos alternantes en ángulo
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Permite una reorientación de las moléculas
que de esta forma avanzarán un tramo más,
antes de quedar de nuevo atrapadas. Cuanto
más grandes son las moléculas mayor debe
ser la duración de los campos eléctricos
alternos para permitir la reorientación y en
última instancia la separación de las mismas.
(Fierro F 2001).
El objetivo es Determinar el tamaño y la
concentración de las muestras de ADN (kit,
casero y manual y establecer cuál de las
muestras arroja mejores resultados a través de
la electroforesis)
Metodología
Método Manual
 En un tubo de 15 mL, procedimos
midiendo 8 mL de Buffer de lisis de
glóbulos rojos y sobre este
adicionamos con una pipeta de
Pasteur 2 mL de sangre total. Con la
misma pipeta y mezclamos muy bien
y con mucha suavidad hasta lograr
una completa homogenización.
 Mediante inversión procedimos a
agitar muy suavemente durante 7
minutos a temperatura ambiente.
 Luego, llevamos a centrifugar a 3000
R.P.M. durante 8 minutos.
 Después, descartamos el
sobrenadante y conservamos el pellet.
 Posteriormente, realizamos una
mezcla con una pipeta Pasteur muy
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suavemente el pellet en el líquido
residual.
 Adicionamos 2.5 ml de Buffer de lisis
celular y mezclamos varias veces,
hasta homogenizar y dejamos unos 20
minutos a temperatura ambiente.
 Siguientemente, adicionamos 800 μl
de solución precipitante de proteínas
y mezclamos fuerte, hasta poder
observar grumos de las proteínas
precipitadas.

Centrifugamos 4000 R.P.M. por 1 min
 Luego, vertimos todo el sobrenadante
sobre un tubo de 15 mL que contenga
2,4 mL de isopropanol frío (alcohol
isopropílico) y dejamos en reposo al
menos unos 5 minutos.
 Mezclamos cuidadosamente por
inversión hasta que el ADN se
precipitara.
 Finalmente, envolvimos el ADN en
una pipeta y lo pasamos rápidamente
por etanol al 70% frío, luego, lo
dejamos secar a temperatura
ambiente y re suspendendimos
finalmente en buffer TE (TrisHCL 10
mM EDTA 1mM) de 50-500 μl,
dependiendo de la cantidad de ADN
recuperado.
Método de Kit
 Tomamos 50 μl de glóbulos blancos y
los agregamos en el tubo falcon.
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Siguientemente, procedimos a Electroforesis

agregar 20 μl de proteinasa, 150 μl de
PBS (Ph 7,2) y 200 μl del Buffer Al.  Adicionamos 3 μL Buffer de carga en
 Posteriormente, realizamos 4 pulsos el Parafilm y posteriormente 18 μL de
leves en el Vortex y luego llevamos a muestra de ADN en cada gota de
centrifugación por 20 minutos. buffer.
 Luego de terminada la centrifugación,  A continuación, procedimos a
agregamos 200 μl de etanol y sembrar 20 μL de la muestra ya con el
realizamos 3 pulsos leves en el buffer y la muestra de ADN en el gel
Vortex. de Agarosa al 0.9 %.
 A continuación, suministramos los  Luego, conectamos a la corriente
620 μl totales al tubo columna esperando por un tiempo de 40
 colector. Procedimos a centrifugar minutos.
todo por un minuto.  Observamos en el cuarto oscuro con
 Descartamos lo que queda al final y le ayuda de luz ultravioleta los
agregamos 500 μl de Buffer AW1. resultados.
Llevamos a centrifugar por 1 minuto.
 Nuevamente descartamos el sobrante
y agregamos 130 μl de AW2.
Procedimos a centrifugar por 3
minutos.
 Ya descartado el sobrante,
adicionamos 130 μl de Buffer AE
(Permitir que el ADN se libere de la
membrana)
 Posteriormente, llevamos a
centrifugar a 8000 R.P.M por 1
minuto.
 Finalmente agregamos el final (ADN)
en un tubo eppendolf esperando que
sea ADN.

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Resultados
Se observa de izquierda a derecha el pozo de
marcador que sirve como referente para
comparar los métodos de extracción de ADN
que determinaran la cantidad que se
evidencia en la prueba de electroforesis, se
puede ver una tinción del gel agarosa en el
método manual con 5 kpb y en cuanto a
marcador y casero no se evidencio la
presencia de ADN en el gel.
Análisis de resultados
Se sabe que el fosforo es un componente
esencial de los organismos y forma parte de
los ácidos nucleicos como tal posee una
carga negativa y el extremo donde se
localizan los pozos posee también una carga
negativa lo que quiere decir que se repelen y
en consecuencia hay una coloración que con
ayuda del marcador se permite evidenciar la
cantidad de pares de bases presentes en el
pozo según el método de extracción.
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Entonces la no presencia de un coloreado en
los pozos que corresponden a los métodos de
casero y kit se puede inducir que el gel
agarosa no ha podido inducir a los azucares
de tipo monosacárido presentes en el gel
agarosa que no han podido interactuar con las
proteínas del ADN se puede deber a una
desnaturalización de las propiedades de la
muestra en el procedimiento. En cuanto al
método de extracción manual se hace
remarcable la densidad evidente por la
coloración lo que quiere decir que los poros
en los que se ha preparado esta muestra
poseen una mayor pureza.
Se evidencia bandeo consistente en el método
de extracción manual lo que hace asociar a
que cuanto mayor sea la cantidad de ADN
será mayor el retraso en el recorrido lo cual
se asocia a una fuerte coloración y en
consecuencia a una densidad del pozo de
extracción manual con respecto a los otros
tratamientos
El peso conferido por el buffer de carga
(sucrosa-glicerol) hace que el ADN se
precipite al fondo por la capacidad que tienen
los alcoholes de degradar lípidos, entre otras
cosas lo que permite el buffer es conducir
corriente y controlar pH que le confiere
estabilidad a la molécula a observar. Para el
método manual se favorecieron las
condiciones de peso, pH, conductividad y
densidad dentro de este buffer pues el bandeo
arrojo 5 kpb
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Conclusiones Referencias
 Es evidente, que la extracción de
ADN es un proceso muy complejo y Bergmann, D. (2011). Biotecnología.
que requiere de bastante cuidado y [Material para clase] En BIO41: 2011 Clases
dedicación al momento de realizarlo. de biología molecular sobre ADN, ARN y
Desde que iniciamos el proceso con el biotecnología.
método casero (que fue más un Muñoz, M. B. (s.f.). Informe de Prácticas
ensayo) hasta la finalización con la Biotecnología
electroforesis (que es una manera de
analizar la cantidad de ADN Aras S., A. Duran y G. Yenilmez. 2003.
encontrados por los diferentes Isolation of DNA for RAPD analysis from
métodos), hubieron pocos dry Leaf material of some Hesperis L.
inconvenientes y procuramos realizar Specimens. Plant Molecular Biology 21:
los correspondientes procedimientos 461a–461f.
al pie de la letra bajo instrucciones del
Wagner D. B., G. R. Furnier, M. A. Saghay-
docente.
Maroof, S. M. Williams, B. P. Dancik y R.W.
Allard. 1987. Chloroplast DNA
 La electroforesis en gel de polymorphisms in lodgepole and jack pines
agarosa es una de las técnicas and their hybrids. Proceedings of the
más adecuadas para la National Academy of Science USA 84: 2097-
visualización del ADN ya que
2100
además de ser de fácil
preparación, los colorantes Velazquez, L., Aragon M., Extraccion y
permiten su observación al
purificación del aDN tomado de
someterse a luz ultravioleta
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/li
 Se puede establecer que de los bros/710/extraccion.pdf
tres métodos el que permitió
revelar 5 kpb en el bandeo de
electroforesis fue el método
manual, Comparando con la
teoría de métodos de extracción
(Allard, 2007)se puede decir que
el método de kit no tuvo
efectividad en este caso con
resopecto al manual debido a una
desnaturalización del ADN

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Anexos
¿Función proteinsa k?
Es una proteasa, Sirve para purificar ácidos
nucleicos de células animales (que son ricas
en proteínas).
¿Función de Etanol?
Precipitación con etanol helado. El ADN es
soluble en alcohol, pero se torna insoluble en
presencia de sal (NaCl) porque el sodio
fosfatos, lo que hace el etanol es formar una
capa en la superficie por ser menos denso que
la solución acuosa.
¿Función de PBS?
El PBS se emplea como vehículo neutro para
células, ya que no modifica el perfil de
expresión y funcionamiento celular normal.
Esta solución es empleada comúnmente para
lavar células a través de centrifugación. El
PBS puede ser empleado como diluyente para
métodos de desecación de biomoléculas, ya
que las moléculas de agua presentes en el
PBS se adhieren alrededor de la biomoléculas
permitiendo inmovilizarla a una superficie
sólida.
¿Función de Buffer?
Un tampón o buffer es una o varias sustancias
químicas que afectan a la concentración de
los iones de hidrógeno (o hidronios) en el
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agua. Siendo que pH no significa otra cosa
que potencial de hidrogeniones (o peso de
hidrógeno), un buffer (o "amortiguador") lo
que hace es regular el pH.
¿Función de la centrifugación?
La centrifugación es un método por el cual se
pueden separar sólidos de líquidos de
diferente densidad por medio de una fuerza
giratoria.
¿Función de Buffer de carga?
Este buffer es una gran mejora al método de
lisis de lisosoma que permite extracción de
proteínas solubles y concurrente eliminación
de ácidos nucleicos (DNA y RNA) durante el
proceso de lisis de células.
Marcador de peso molecular de 1 kb
Wl 1kb ADN ladder se obtiene a apartir de
vectores de ADN dirigidos completamente
con enzimas de restricción hasta generar
bandas de 270 bp y 10 kb aptas para ser
utilizadas como marcadores de peso
molecular en geles de agarosa. Se compone
de 14 fragmentos individuales el marcador.
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Figura 1. Toma de muestra de Figura 3. Adicionando solución

sangre para la extracción de precipitante de proteínas a la
ADN muestra.

Figura 2. Papel parafilm con

el buffer de carga y Figura 4. Extracción de etanol
adicionando las respectivas
muestras de extracción de
ADN

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