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Revisiones críticas en bioquímica y biología molecular

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Replicación del ADN mitocondrial de mamíferos y mecanismos de

formación de deleciones.

María Falkenberg y Claes M. Gustafsson

Para citar este artículo: Maria Falkenberg & Claes M. Gustafsson (2020) Replicación del ADN
mitocondrial de mamíferos y mecanismos de formación de deleciones, Critical Reviews in
Biochemistry and Molecular Biology, 55:6, 509­524, DOI: 10.1080/10409238.2020.1818684
Para vincular a este artículo: https://doi.org/10.1080/10409238.2020.1818684

© 2020 El autor(es). Publicado por Informa UK Limited, que opera

como Taylor & Francis Group

Publicado en línea: 24 de septiembre de 2020.

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REVISIONES CRÍTICAS EN BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR 2020, VOL.

55, núm. 6, 509–524 https://doi.org/
10.1080/10409238.2020.1818684

ARTÍCULO DE REVISIÓN

Replicación del ADN mitocondrial de mamíferos y mecanismos de

formación de deleciones.

María Falkenberg y Claes M. Gustafsson

Departamento de Bioquímica Médica y Biología Celular, Universidad de Gotemburgo, Gotemburgo, Suecia

RESUMEN Las HISTORIA DEL ARTÍCULO

Recibido el 7 de febrero de 2020
mitocondrias de los mamíferos contienen múltiples copias de un genoma de ADN circular de doble hebra (ADNmt) que codifica subunidades de la maquinaria de
Revisado el 25 de junio de 2020
fosforilación oxidativa. Las mutaciones en el ADNmt causan una serie de trastornos humanos poco comunes y también están asociadas con afecciones más
Aceptado el 31 de agosto de 2020
comunes, como la neurodegeneración y el envejecimiento biológico. En esta revisión, analizamos nuestra comprensión actual de la replicación del ADNmt en

células de mamíferos y cómo se regula este proceso.

PALABRAS CLAVE
mitocondria; replicación del
También discutimos cómo se pueden formar deleciones durante la replicación del ADNmt. ADN; supresión; ADN helicasa;
ADN polimerasa

En las células humanas, el ADNmt es una molécula circular de
doble cadena de 16.569 pb (Figura 1). El genoma alberga 37
genes, que dan lugar a 13 componentes esenciales del sistema
de fosforilación oxidativa, así como 2 ARN ribosómicos (ARNr
12S y 16S) y 22 moléculas de ARN de transferencia necesarias
para la traducción mitocondrial. En
En total, el ADNmt contiene genes para el 1% de todas las
proteínas ubicadas en las mitocondrias (Calvo et al. 2016).
Todas las demás proteínas, incluidas las enzimas implicadas
en el mantenimiento del ADNmt, están codificadas por el
genoma nuclear, traducidas en el citoplasma y transportadas
a las mitocondrias (Gustafsson et al. 2016 ).
Debido a las diferentes composiciones de bases, las dos
hebras de ADNmt humano se pueden separar en función de la
densidad de flotación. Por lo tanto, las hebras se denominan
hebras pesadas (H) y ligeras (L), respectivamente (Figura 1;
Berk y Clayton 1974). El genoma incluye una región no
codificante (NCR) de aproximadamente 1 kb. La NCR contiene
una serie de elementos de secuencia conservados, incluidos
dos promotores, el promotor de la cadena ligera (LSP) y el
promotor de la cadena pesada (HSP), que sirven como puntos
de partida para la transcripción policistrónica del ADNmt. El
origen para la replicación del ADN de la cadena H (OriH)
también se encuentra en la NCR, mientras que un segundo
origen mitocondrial, dedicado a la replicación del ADN de la
cadena L (OriL), se encuentra dentro de un grupo de ARNt
aproximadamente 11.000 pb aguas abajo de OriH ( Gustafsson et al.2016 ). Los
ADNmt en dos partes: los arcos mayor y menor (Figura 1).
Las moléculas individuales de ADNmt se empaquetan en
complejos de núcleo­proteína, denominados nucleoides (Satoh
y Kuroiwa 1991; Alam et al. 2003; Bogenhagen DF et al.
2008; Farge y Falkenberg 2019). El principal componente
estructural de estos nucleoides es el factor de transcripción A
mitocondrial (TFAM), una proteína de caja grupal de alta
movilidad que también se requiere para el inicio de la
transcripción (Gustafsson et al. 2016 ). TFAM puede unirse,
desenrollar y doblar ADN sin especificidad de secuencia,
cubriendo y compactando toda la molécula de ADNmt (Kaufman
et al. 2007; Kukat et al. 2011; Farge et al. 2012; Kukat et al.
2015). El grado de compactación del ADNmt por TFAM regula
el acceso a los elementos de la secuencia reguladora y, por lo
tanto, puede influir en los niveles de replicación y transcripción
(Kaufman et al. 2007; Farge et al. 2014). Además de TFAM,
otras proteínas también se asocian con el nucleoide, incluidas
las enzimas metabólicas, lo que indica un posible vínculo entre
la función del nucleoide y la actividad metabólica (Wang y
Bogenhagen 2006; He et al. 2012; Han et al . 2017 ) .
Factores de replicación del ADN mitocondrial
El ADNmt de los mamíferos se replica mediante un conjunto de
factores de replicación
distintos
dos orígenes de los necesarios para el ADN.
se dividen

CONTACTO María Falkenberg maria.falkenberg@medkem.gu.se Departamento de Bioquímica Médica y Biología Celular, Universidad de Gotemburgo, PO
Box 440, Gotemburgo 405 30, Suecia

2020 El autor(es). Publicado por Informa UK Limited, que opera como Taylor & Francis Group
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4.0/ ), que permite la reutilización, distribución y reproducción no comercial en cualquier medio, siempre que la obra original esté debidamente citada y no sea alterada, transformada o
construida de ninguna manera.
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510 M. FALKENBERG Y CM FALKENBERG

Bucle D 3'
HSP Síntesis de cadena H
CSB ADN 7S hilo H POL B

32 1
hilo en L 5'
3' pablo a
500 300 1/16,569 16.400 ESO 16.300
LSP orih
POLRMT
CENTELLEO
5'
oril
HSP mtSSB
hebra L
RNC
síntesis 5'
LSP orih Figura 2. Figura esquemática de la bifurcación de replicación del ADNmt. El
(191)
i oh
norte

METRO
ar rC
a METRO
ADNmt humano
16.569 pb
j
oh
r
ar
C
Oril
(5747)
ARNt
Figura 1. El genoma mitocondrial humano. El círculo interior
representa la cadena L y el círculo exterior la cadena H. Un
La versión ampliada de la región no codificante (NCR) se muestra en
la parte superior. La región del bucle de desplazamiento (bucle D) contiene una
tercera cadena (ADN 7S), que se extiende entre OriH y TAS
regiones. Se indican los arcos menor y mayor del ADNmt.
Abreviaturas. CSB: bloque de secuencia conservada; HSP: promotor de
cadena pesada; LSP: promotor de hebras ligeras; OriH: hilo pesado
origen; OriL: origen de la hebra ligera; TAS: asociado a la terminación
secuencia.
replicación en el núcleo (Figura 2). ADN polimerasa c
(POLc) es esencial para el mantenimiento del ADNmt y el único
polimerasa responsable de las cadenas H y L del ADN.
síntesis. La enzima forma un heterotrímero con uno
subunidad catalítica (POLcA) y dos subunidades accesorias
(POLcB; Gray y Wong 1992; Hance et al. 2005; Fan
et al. 2006; Yakubovskaya et al. 2006; Humble et al.
2013). Curiosamente, la composición estructural de POLc
varía entre eucariotas. Drosophila melanogaster
POLc es un heterodímero de POLcA y POLcB, mientras que
la subunidad accesoria falta en Saccharomyces cere­visiae y
Caenorhabditis elegans (Ravichandran et al.
2004; Fan et al. 2006).
POLcA tiene una masa molecular de 140 kDa y es un
miembro de la familia A de ADN polimerasas, que también
incluye la ADN polimerasa I bacteriana y la ADN polimerasa del
bacteriófago T7 (Gustafsson et al. 2016).
POLcA alberga una actividad de exonucleasa requerida de 30 a 50
para la corrección durante la síntesis de ADN (Gray y Wong
1992) y la polimerasa es muy precisa, con una
frecuencia de error inferior a 1 106 por nucleótido
La ADN helicasa TWINKLE (azul claro) viaja en la cadena H parental en la
dirección 50 a 30 mientras se desenrolla el ADNbc. El
La proteína mtSSB (verde) se une al ssDNA y estimula POLc
(azul oscuro) síntesis dependiente de la cadena H naciente.
POLc también realiza la síntesis de ADN de la cadena L, utilizando la cadena
H parental desplazada como plantilla. POLRMT (púrpura) sintetiza el cebador
de ARN (naranja) necesario para el inicio de
Síntesis de la cadena L en OriL. Vea la versión en color de esta figura.
en www.tandfonline.com/ibmg
ARNr
ARNm
(Longley et al. 2001). La subunidad POLcB accesoria es
más pequeño, con una masa molecular de 55 kDa. La proteína es
relacionado estructuralmente con las aminoacil tRNA sintetasas de
clase IIa y muy probablemente como resultado de una duplicación genética
evento temprano en la evolución. POLcB estimula el catalizador.
actividad y procesividad de POLcA, mediante la estabilización de
interacciones con ADN molde (Carrodeguas et al. 2002).
Además de POLc, varias otras ADN polimerasas tienen
isoformas mitocondriales, incluidas
PrimPol, ADN polimerasa b, ADN polimerasa h y
DNA polymerase f (Garcia­Gomez et al. 2013; Sykora
et al. 2013; Singh et al. 2015; Wisnovsky et al. 2016).
Sin embargo, estas polimerasas adicionales no están asociadas
con la replicación del ADN per se, sino que participan en diferentes
aspectos de la reparación del ADNmt. Para una reseña sobre esto
asunto, consulte (Krasich y Copeland 2017).
POLc requiere la ayuda de la heli­case TWINKLE de ADN
replicativo para desenrollar el ADNds en la bifurcación de replicación.
(Figura 2; Korhonen et al. 2004). La helicasa forma una
hexámero con una masa molecular de 420 kDa y requiere
una estructura de horquilla para iniciar el desenrollado en la
dirección 50 a 30 (Spelbrink et al. 2001; Korhonen et al. 2003;
Korhonen et al. 2008). TWINKLE es similar en estructura
y secuencia de la proteína del gen 4 del fago T7
(Spelbrink et al. 2001), que comprende un dominio de helicasa y
primasa unidos por una región conectora flexible. En
TWINKLE, el dominio primasa no es funcional y, en cambio, los
cebadores necesarios para iniciar la síntesis de ADNmt son
sintetizada por la ARN polimerasa mitocondrial
(POLRMT; Chang y Clayton 1985; Tsurumi y
Lehman 1990; Wanrooij y otros 2008). La subunidad única
La enzima es estructuralmente similar al ARN del fago T7.
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REVISIONES CRÍTICAS EN BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR 511

orih

orih orih
orih orih
oril

orih
oril
oril oril
oril
oril
Figura 3. Replicación del ADNmt por desplazamiento de cadena. La replicación de la cadena H naciente se inicia en OriH y continúa de forma
unidireccional. En el proceso, la cadena H parental es desplazada y unida por mtSSB (verde), lo que evita la formación de cebadores inespecíficos
por POLRMT (púrpura). Cuando la maquinaria de replicación llega a OriL, la hebra H del origen se pliega formando un bucle de tallo.
estructura. POLRMT (púrpura) inicia la síntesis de ARN a partir del tramo poli­dT en la región del bucle, lo que lleva a la producción de un
Cebador corto que se utiliza para iniciar la síntesis de ADN de cadena L. La cadena L naciente se sintetiza continuamente hasta completar el círculo y
Se forman dos nuevas moléculas hijas circulares de longitud completa. Tenga en cuenta que TWINKLE (azul claro) no es necesario para la síntesis
de la cadena L ya que la cadena H parental utilizada como plantilla ya es monocatenaria. Síntesis de la molécula hija que contiene
la cadena H naciente se inicia y termina en OriH, mientras que la síntesis de la otra molécula hija se inicia y termina en OriL. Vea la versión en color de esta figura
en www.tandfonline.com/ibmg

polimerasa, pero las dos enzimas difieren en sus mecanismos de
elongación de la transcripción, y la polimerasa del fago sufre un
replegamiento estructural extenso
durante la transición al alargamiento (Gustafsson et al.
2016; Hillen et al. 2018). POLRMT muestra una baja procesividad en
plantillas de ADN monocatenario y solo sintetiza cebadores cortos de
entre 25 y 75 nt. A diferencia de,
POLRMT muestra una fuerte procesividad en plantillas de dsDNA, lo
que permite la formación de transcripciones de longitud genómica
(Wanrooij et al. 2008).
Durante la progresión de la maquinaria de replicación,
la proteína mitocondrial de unión al ADN monocatenario
(mtSSB) previene la formación de estructuras secundarias
y bloquea la síntesis de cebadores no deseados (ver a continuación;
Mignotte et al. 1985; Tiranti et al. 1993; Miralles Fuste
et al. 2014). La proteína mtSSB forma un tetrámero de
60 kDa, que estimula la síntesis de ADNmt aumentando
la actividad helicasa de TWINKLE y la estimulación de POLc
procesividad (Farr et al. 1999; Korhonen et al. 2003;
Korhonen et al. 2004). A diferencia de TWINKLE y
1972 (Robberson et al. 1972). Según su modelo,
La síntesis de ADN de las cadenas L y H se produce de forma continua y
no se producen productos de replicación similares a los fragmentos de Okazaki.
se forman (Tapper y Clayton 1981). Replicación de
El ADNmt se inicia a partir de dos orígenes de replicación dedicados,
OriH y OriL (Figura 3). La replicación comienza primero
en OriH, y en la fase inicial, síntesis de ADN de cadena H
Procede sin síntesis simultánea de la cadena L.
Durante este paso, TWINKLE se mueve sobre la cadena H parental
frente a POLc, uniéndose mtSSB y protegiendo la cadena H parental
desplazada (Fuste et al.
2010; Miralles Fuste et al. 2014). When H­strand DNA
La síntesis ha progresado durante aproximadamente 11 kb, la
maquinaria de replicación pasa por OriL. En este punto, los padres
La cadena H del origen se vuelve monocatenaria y
se pliega en una estructura de vástago­bucle (un vástago de 11 pb y un
Bucle de 12 nt). La región del bucle contiene un tramo de residuos de
dT, que sirve como punto de partida para el cebador.
síntesis por POLRMT. Después del inicio, síntesis de cebadores.
continúa durante aproximadamente 25 nt. A continuación, POLRMT se reemplaza por

POLc, mtSSB no está relacionado estructuralmente con su fago T7
contraparte, pero en cambio se parece a la unión de ssDNA
proteína (SSB) presente en Escherichia coli (Lohman y
Ferrari 1994). El modo preciso de unión de mtSSB aún está por determinar.
bajo investigación. Informes contradictorios han proporcionado
evidencia tanto para cooperativas como para no cooperativas.
binding (Wong TS et al. 2009; Miralles Fuste et al. 2014;
Qian y Johnson 2017; Kaur et al. 2018).
Mecanismos de replicación del ADNmt en
células mamíferas
El modelo de desplazamiento de cadena para la replicación del ADNmt.
fue presentado por Jarome Vinograd y sus colegas en
Puede comenzar la síntesis de POLc y ADN de cadena L
(Martens and Clayton 1979; Fuste et al. 2010).
Una vez iniciada, la síntesis naciente de las cadenas H y L
continuar hasta que los dos eventos de replicación hayan alcanzado
círculo completo. Vale la pena señalar que los mecanismos de
replicación del ADN de las cadenas H y L son claramente diferentes.
(Figura 3). La síntesis de ADN de cadena H utiliza ADNds como
plantilla y requiere TWINKLE para desenrollar dúplex
y progresión de la bifurcación. Por el contrario, la síntesis de ADN de
cadena L es independiente de TWINKLE, ya que la plantilla utilizada
es la cadena H parental monocatenaria. Sin evidencia
ha sido presentado para un vínculo físico entre el
ADN polimerasas que trabajan en las cadenas H y L.
Sin embargo, existe una conexión clara y funcional.
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512 M. FALKENBERG Y CM FALKENBERG
entre la replicación de las dos cadenas desde la cadena H
Se requiere la síntesis de ADN para la activación de OriL.
Curiosamente, la electroforesis en gel de agarosa 2D (2D­AGE)
Los análisis también han indicado que la maquinaria de replicación de
la cadena H se detiene en las proximidades de OriL (Bailey
et al. 2009). Se desconoce el motivo de este efecto, pero
es posible que la maquinaria se detenga para asegurar
activación adecuada de OriL e inicio de la cadena L de ADN
síntesis, antes de la progresión continua de la cadena H
síntesis. Los mecanismos de la pausa observada.
y qué desencadena la liberación de la replicación pausada
maquinaria, quedan por dilucidar.
POLRMT humano puede iniciar la síntesis de cebadores en ssDNA
aleatorio utilizando ATP como nucleótido iniciador
(Wanrooij et al.2008 ). Durante la replicación por desplazamiento de
hebra, esta actividad es bloqueada eficientemente por mtSSB,
que cubre la cadena H parental desplazada y previene la formación de
cebadores inespecíficos (Figura 3). cuando oril
está activado, el vástago bicatenario evita mtSSB
de encuadernación. Además, el bucle monocatenario
La región es demasiado corta para la unión de mtSSB, pero lo suficientemente
mucho tiempo para el inicio de la transcripción por POLRMT, lo que permite
Formación de cebadores y activación del origen (Fuste et al.
2010; Miralles Fuste et al. 2014). The OriL structure is
conservado en la mayoría de los vertebrados, con la posible excepción
de aves y reptiles. Mutagénesis de saturación in vivo.
ha demostrado que el origen es esencial para el ADNmt
mantenimiento en el ratón (Wanrooij S et al. 2012).
Al prevenir la formación de cebadores inespecíficos en el exterior
OriL, mtSSB restringe eficientemente el inicio de la cadena L
Síntesis de ADNmt a OriL. En apoyo de esta idea, el análisis de la
ocupación in vivo ha demostrado que fuera del bucle D, mtSSB sólo se
une a la cadena H. El
El patrón de unión de mtSSB, por lo tanto, se correlaciona con
¿Qué sería predicho por el desplazamiento de la hebra?
mode of mtDNA synthesis (Miralles Fuste et al. 2014).
Los mecanismos de reclutamiento de POLRMT a OriL durante
Se desconoce la activación. En muchos otros sistemas, se necesita
constantemente una primasa en la bifurcación de replicación, donde
inicia la síntesis de cebadores para cada fragmento de Okazaki
síntesis. En la bifurcación de replicación de E. coli, la primasa
(DnaG) interactúa y viaja junto con la helicasa replicativa (DnaB; Lewis
et al. 2016). Si POLRMT es
reclutado por separado al OriL activado, o si la proteína es un
componente del replisoma durante la cadena H
replicación, no se ha abordado.
Modos alternativos de replicación del ADNmt
Alternativas al modo de desplazamiento de hebras de
La replicación del ADNmt se ha informado en la literatura.
El modelo RITOLS (incorporación de ribonucleótidos
a lo largo de la hebra retrasada) es muy similar a la hebra
replicación por desplazamiento, pero sugiere que los procesados
Moléculas de ARN (ARNr, ARNt y ARNm con poli A
colas) cubren la hebra H parental desplazada (Figura 3),
formando una hebra retrasada provisional durante el ADNmt
replicación. El modelo RITOLS se basa principalmente en intermediarios
de replicación observados en experimentos 2D­AGE
(Yasukawa et al. 2006; Reyes et al. 2013). The authors of
Esta revisión sigue siendo escéptica sobre el modelo RITOLS.
En circunstancias normales, las moléculas de ARN procesadas
están plegados, modificados y unidos a proteínas y no
Se ha identificado maquinaria molecular que explica
cómo las transcripciones procesadas se pueden unir a la cadena H
parental desplazada durante la replicación del ADNmt. En
Además, la existencia de RNasa H1 en mamíferos
mitocondrias, una enzima que degrada activamente el ARN
moléculas hibridadas con ssDNA, argumenta en contra del uso
de ARN para estabilizar regiones de ADNss (Cerritelli et al. 2003;
Cerritelli y Crouch 2009; Holmes y cols. 2015; Al­Behadili et al. 2018;
Posse et al. 2019). Finalmente, hay
altos niveles de mtSSB en mitocondrias de mamíferos y
por lo tanto, no hay necesidad de modos alternativos de protección del
ADNss, distintos de lo que se ve en muchos otros sistemas (Miralles
Fuste et al. 2014; Yao y O'Donnell
2016). En nuestra opinión, RITOLS sigue siendo un producto no probado
hipótesis hasta que se proporcione evidencia bioquímica firme
para los pasos de reacción individuales de este modelo. Por un
Desde un punto de vista alternativo, nos referimos a una revisión escrita
por los defensores del modelo RITOLS (Holt y Jacobs 2014).
Un tercer modelo de cadena acoplada para la replicación del ADNmt
Se ha propuesto explicar las observaciones en ciertos tipos de células
y condiciones (Holt et al. 2000). Este modelo implica
que la síntesis de ADN de cadena L se inicia en múltiples lugares
en la cadena H parental y que la cadena L naciente
La síntesis se sintetiza como fragmentos más cortos que son
ligados para generar una hebra continua. El modelo
Se parece a la replicación convencional del ADN observada en muchos
otros sistemas, con la notable excepción de que existen
No hay indicios de un vínculo físico entre el trabajo de POLc.
en las hebras H y L. El modelo se basa en la observación de
intermediarios de replicación más cortos, similares a Okazaki, en
ciertos tipos de células, una observación que no necesariamente
contradicen el modelo de desplazamiento de hebras (Wanrooij et al.
2008; Miralles Fuste et al. 2014). POLRMT only requieres en
estiramiento T corto en ssDNA para iniciar la síntesis de cebadores.
En condiciones normales, mtSSB restringe la formación de cebadores
a OriL (Figura 3), pero si los niveles relativos de mtSSB
disminuir o la maquinaria de replicación se detiene, POLRMT
potencialmente podría obtener acceso a la cadena H parental y
cebar la síntesis de ADN desde sitios fuera de OriL. De hecho, ambos
2D­AGE y microscopía de fuerza atómica han proporcionado evidencia
de orígenes alternativos de la síntesis de ADNmt de cadena L
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3 2 1
LSP orih
Región del bucle R
mtSSB G4
ARNasa H1 ARNasa H1
POLγ POLγ
Iniciación de replicación
Figura 4. Un modelo esquemático para el inicio de la replicación en OriH.
POLRMT inicia la transcripción en LSP. Durante la transcripción (línea
amarilla) de la región CSB2 rica en G, se forma una estructura híbrida G­
quadruplex (G4) entre el ARN y la cadena H sin plantilla. La estructura
G4 ancla el ARN al ADN, formando un bucle R estable. La estructura G4
también provoca la terminación prematura de la transcripción
inmediatamente después de CSB2 (flecha amarilla baja). El extremo
del ARN 30 en el bucle R naciente no es accesible para POLc. Para
actuar como cebador, el bucle R debe ser procesado por la RNasa H1
(tijeras). Esto genera 30 extremos (líneas de puntos amarillos), desde
los cuales POLc puede iniciar la síntesis de ADN (flechas de puntos
negros). Tanto la formación del bucle R como el inicio de la replicación
del ADN son estimulados por mtSSB (verde). Cuadrados de color marrón
claro; CSB 1, 2 y 3. Consulte la versión en color de esta figura en
www.tandfonline.com/ibmg
(Brown TA et al. 2005; Pohjoismaki et al. 2011; Torregrosa­
Munumer et al. 2019). Si es correcto, se podría especular que la
pérdida de mtSSB estimularía la iniciación desde orígenes
alternativos. Curiosamente, recientemente se han identificado
mutaciones que causan enfermedades en el gen que codifica mtSSB.
Las proteínas mutantes se unen al ssDNA de manera menos
eficiente y el mtDNA se agota en los individuos afectados (Gustafson et al.
2019; Piro­Megy et al. 2019; Del Dotto et al. 2020) Un análisis en
profundidad de los intermediarios de replicación en líneas celulares
derivadas de pacientes puede proporcionar información importante
sobre un posible cebado fuera de la región OriL.
Inicio de la replicación del ADNmt en el origen de
Replicación del ADN de la cadena H
La transcripción iniciada a partir de LSP no solo produce
transcripciones de longitud genómica, sino también moléculas de ARN. y los 30 extremos formados se pueden utilizar para cebar
REVISIONES CRÍTICAS EN BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR 513
utilizados como cebadores para el inicio de la síntesis de ADN de
cadena H (Figura 4; Gillum y Clayton 1979; Chang y Clayton 1985;
Chang et al. 1985). La formación de cebadores y los mecanismos
que regulan el cambio a la transcripción de longitud genómica aún
están bajo intensa investigación (Agaronyan et al. 2015; Posse et
al. 2015; Jiang et al.
2019; Posse et al. 2019).
Los primeros estudios de iniciación dependiente de OriH en
extractos mitocondriales identificaron un bucle R (una estructura de
triple hebra con ARN naciente que forma un híbrido estable con
ADN molde) en la región inmediatamente aguas abajo de LSP (Xu
y Clayton 1995) . La estructura estaba vinculada a la formación de
cebadores necesarios para el inicio de la replicación y se propuso
que una nucleasa escindiera el bucle R para crear el extremo 30
­OH libre necesario para el inicio de la replicación en OriH.
Inicialmente, se identificó a la RNasa MRP como la nucleasa
responsable (Chang y Clayton 1987; Topper et al. 1992; Lee y
Clayton 1997, 1998), pero estudios posteriores refutaron esta idea,
basándose en la falta de RNasa MRP dentro de las mitocondrias.
matriz seca (Kiss y Filipowicz 1992; Kiss et al. 1992)
La formación del bucle R se puede reconstituir in vitro. En una
plantilla superenrollada negativamente, la mayoría de todos los
eventos de transcripción de LSP finalizan prematuramente después
de 120 nucleótidos y la transcripción producida permanece unida
de manera estable a la plantilla de ADN (Posse et al. 2019) . La
región inmediatamente aguas abajo de LSP alberga tres elementos
de secuencia conservados (CSB1­3) y al menos uno de ellos, CSB2,
es necesario para la formación del bucle R. CSB2 es rico en guanina
y durante su transcripción, el ARN se pliega en una estructura
cuádruplex G junto con el ADN que no es plantilla. El híbrido G­
quadru­plex formado de esta manera ancla de manera estable la
transcripción naciente al ADNmt (Wong y Clayton 1985; Wanrooij
PH et al. 2012). CSB2 también promueve la terminación prematura
de la transcripción, ya que la formación del cuádruplex G en CSB2
coincide con la transcripción de una secuencia de poliuracilo. En
combinación, la estructura G­quadruplex y los débiles enlaces
adenina­uracilo en el ARN­ADN
El dúplex conduce a la disociación del POLRMT alargado y a la
terminación prematura de la transcripción justo después de la
secuencia CSB2 (Pham et al. 2006). La base estructural de este
efecto se ha explicado en un estudio estructural (Hillen et al. 2017).
En su forma nativa, el bucle R mitocondrial no puede cebar la
síntesis de ADNmt, ya que el extremo 30 de la molécula de ARN es
inaccesible (Posse et al. 2019). Esta observación revivió la idea de
una nucleasa procesadora de bucle R y condujo a la identificación
de la RNasa H1 como un componente esencial del proceso de
formación de cebadores.
La RNasa H1 puede escindir el bucle R tanto in vitro como in vivo,
Machine Translated by Google
514 M. FALKENBERG Y CM FALKENBERG
Síntesis de ADNmt dependiente de POLc in vitro (Figura 4; Posse
et al. 2019). En el sistema reconstituido, las transiciones del ARN
cebador a la síntesis de ADN se agrupan alrededor de CSB2 y
CSB3, similar a lo que se ha observado previamente en las
células (Xu y Clayton 1995; Kang et al. 1997; Pham et al . 2006 ) .
El proceso de iniciación se ve estimulado aún más por mtSSB.
Se desconoce la base molecular de la estimulación, pero las
proteínas de unión al ADN monocatenario pueden estabilizar los
bucles R uniéndose a la parte monocatenaria de la estructura,
reduciendo así la probabilidad de reasociación de secuencias de
ADN complementarias (Sun et al.2013 ).
¿Por qué las mitocondrias han desarrollado un complicado
proceso de maduración de cebadores, que involucra un bucle R,
que requiere el procesamiento de la RNasa H1 antes del inicio de
la síntesis de ADNmt? Para responder a esta pregunta, debemos
considerar que el inicio de la replicación es un proceso
cuidadosamente regulado que tiene lugar a partir de elementos
de secuencia específicos, los orígenes de la replicación. Las ADN
polimerasas pueden iniciar la síntesis de ADN a partir de cualquier
extremo 30 ­OH libre ubicado en una plantilla de ADN ss y, para
garantizar el inicio específico del origen de la replicación del ADN,
es esencial tener una actividad de ARNasa H que elimine las
moléculas de ARN no específicas hibridadas con el ADN. Este
punto ha sido demostrado en E. coli (Kogoma y von Meyenburg
1983; Ogawa et al. 1984). La replicación de los cromosomas
bacterianos normalmente se inicia en oriC. En ausencia de RNasa
H activa, esta especificidad se pierde y la iniciación se produce
desde muchos otros sitios, en todo el cromosoma.
La iniciación en estos orígenes alternativos no requiere la proteína
de unión al origen, dnaA, que es necesaria para la activación
adecuada de oriC. De hecho, en un entorno mutante rnh (el gen
que codifica la RNasa H), E. coli puede tolerar la eliminación de
oriC y la inactivación completa del gen dnaA. Por lo tanto, la
función de la RNasa H es reprimir el inicio de los cebadores
ubicados fuera de la región oriC, lo que lleva al inicio de la síntesis
de ADN de origen específico.
El papel de la RNasa H de E. coli como factor de especificidad
para el inicio de la síntesis de ADN también se ha reconstituido in
vitro (Ogawa et al. 1984).
De manera similar a la situación en E. coli, la ARNasa H1
mitocondrial reprime el inicio de la síntesis de ADNmt desde
ubicaciones fuera de la región OriH (Posse et al.
2019). La enzima elimina eficazmente el ARN hibridado con el
ADN en todo el genoma mitocondrial. Sin embargo, en OriH, la
estructura híbrida G­quadruplex formada hace que parte del
bucle R sea resistente a la escisión de la RNasa H1.
Por lo tanto, el bucle R no se elimina por completo, pero la
escisión parcial conduce a la formación de extremos 30 del ARN
que pueden usarse para iniciar la síntesis de ADNmt. De esta
manera, la RNasa H1 puede reprimir el inicio no específico y
promover el inicio específico del origen del ADNmt.
síntesis. El modelo recibe el apoyo de observaciones en células
de pacientes con actividad reducida de la RNasa H1. En estas
células, el inicio de la replicación del ADNmt no se limita a OriH.
En cambio, las transiciones de ARN a ADN tienen lugar en
múltiples sitios fuera de la región CSB, algo que no se observa
en células normales de tipo salvaje (Reyes et al. 2015; Posse et
al. 2019).
La formación de bucles R y la terminación prematura de la
transcripción pueden reducirse fuertemente mediante el factor de
elongación de la transcripción mitocondrial (TEFM), lo que llevó a
la sugerencia de que este factor podría regular la formación de
cebadores (Agaronyan et al. 2015; Posse et al . 2015 ).
Según este modelo, la presencia de TEFM estimularía la
transcripción completa, mientras que la ausencia de TEFM
conduciría a la terminación de la transcripción y la formación de
cebadores en CSB2. Estudios posteriores han complicado este
panorama. Como se analizó anteriormente, las transcripciones
formadas por terminación prematura en CSB2 no se pueden usar
directamente para cebar la replicación del ADNmt; primero deben
procesarse mediante RNasa HI (Posse et al. 2019).
Además, en el ratón, la pérdida de TEFM provoca un aumento
espectacular de las transcripciones proximales de LSP, que
terminan antes de la región donde se produce el cambio de la
transcripción a la replicación. Como resultado, la replicación de
novo disminuye, exactamente lo contrario de lo que se predeciría
a partir del modelo propuesto (Jiang et al. 2019).
Finalmente, cuando se monitoreó in vitro el TEFM para detectar
efectos sobre el inicio de la replicación del ADNmt en presencia
de RNasa H1, las consecuencias fueron menos dramáticas.
Los niveles equimolares de TEFM a POLRMT redujeron el inicio
de la replicación del ADNmt pero no abolieron la reacción (Posse
et al. 2019). Se necesitan más estudios para determinar si los
niveles de TEFM activo realmente varían en respuesta a los
requisitos fisiológicos y si los cambios leves en las concentraciones
de TEFM, a su vez, influyen en los niveles relativos de replicación
del ADNmt in vivo.
Formación de bucles de desplazamiento
Una vez que se ha iniciado la síntesis de ADN en OriH, solo una
pequeña fracción de todos los eventos de replicación continúa
hasta convertirse en ADNmt de longitud completa (Figura 1, panel
superior). En cambio, alrededor del 95% de todos los eventos de
replicación terminan después de aproximadamente 650 nt,
formando lo que se conoce como ADN 7S (no debe confundirse
con ARN 7S, ver más abajo; Nicholls y Minczuk 2014) . El extremo
30 del ADN 7S está ubicado en una región con elementos
secundarios conservados, conocida como secuencias asociadas
a la terminación (TAS; Bogenhagen y Clayton 1978; Doda et al.
1981). Una vez formada, la molécula de ADN 7S puede
permanecer hibridada con la NCR, formando un bucle de
desplazamiento de triple hebra (bucle D).
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REVISIONES CRÍTICAS EN BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR 515

(A) (B) ARNasa H1

5'

ARNasa H1 ADN naciente

oril 5'
32 1
LSP
orih

MGME1
Nucleasa
tipo Fen1
Pol

oril orih

ADN ligasa 3 ADN ligasa 3

Pol POL MGME1

oril orih
Figura 5. Eliminación del cebador en OriH y OriL. (A) En OriL, la RNasa H1 elimina el cebador de ARN (25 nt, línea naranja discontinua)
dejando 1 o 2 ribonucleótidos unidos al extremo 50 de la cadena L naciente. La POLc replicante desplaza el extremo 50 durante la finalización
de la síntesis de ADN de la cadena L, y los últimos ribonucleótidos se eliminan mediante una actividad similar a FEN1. Una vez que se produce
una mella ligable, se sella con la Ligasa 3. (B) En OriH, el extremo 50 de la hebra H naciente se procesa y se desplaza de CSB3/CSB2 a OriH
en la posición 191. En el proceso, el cebador de ARN y se elimina un tramo de ADN naciente (100 nts). El proceso de maduración del extremo
50 es independiente de la síntesis del ADNmt de la longitud del genoma, ya que también se procesa el extremo 50 del ADN 7S corto. Durante
la eliminación del cebador, la RNasa H1 elimina el cebador (línea discontinua de color naranja), dejando 1 o 2 ribonucleótidos unidos al extremo
50 de la hebra H naciente. En el siguiente paso, MGME1 elimina estos ribonucleótidos restantes junto con un tramo de ADN de cadena H
naciente (línea roja discontinua). MGME1 funciona en un colgajo de ADN monocatenario, pero se desconoce cómo se forma la estructura del colgajo.
Vea la versión en color de esta figura en www.tandfonline.com/ibmg

No se comprende el papel preciso del bucle D en el
mantenimiento del ADNmt, pero hay evidencia que sugiere
que la terminación en TAS puede controlar los niveles relativos
de replicación abortiva versus completa del ADNmt (Brown
GG et al. 1986 ; Pereira y otros 2008; Jemt y otros.
2015). Una pista sobre los mecanismos que gobiernan la
formación del bucle D surgió con la identificación de dos
motivos de secuencia palindrómica de 15 nt estrechamente
relacionados (ATGN9CAT), que se encuentran en los bordes
50 y 30 de la región de triple hebra. Los motivos se conservan
evolutivamente y el que coincide con el extremo 30 del ADN
7S se denomina núcleo­TAS, ya que está ubicado dentro de
la región TAS (Figura 1, panel superior; Jemt et al. 2015). El
elemento en el borde 50 corresponde a CSB1. Se desconoce
el papel de los motivos ATGN9CAT , pero es posible que
funcionen como motivos de unión para algún tipo de actividad
de unión al ADN específica de secuencia. Se han informado
huellas en orgánulos en la región central­TAS (Roberti et al.
1998), pero a pesar de esfuerzos considerables, no hemos
logrado aislar una proteína que se una a la región central.
Elemento ATGN9CAT. Quizás vincularse a estos sitios sea un
evento regulado y se requieran señales o condiciones
específicas. Alternativamente, las dos secuencias palindrómicas
pueden participar en la formación de algún tipo de estructura
secundaria, que a su vez influye en la formación del ADN 7S.
Se requiere más trabajo para dilucidar la importancia de los
motivos ATGN9CAT .
Terminación de la replicación del ADNmt.
Una vez que se ha completado la replicación del ADNmt, las
dos moléculas hijas deben ligarse y separarse adecuadamente.
Antes de la ligación, los cebadores de ARN utilizados durante
el inicio de la síntesis de ADNmt se eliminan y POLc llena
cualquier espacio vacío en la cadena de ADN naciente. La
eliminación del imprimador se ha estudiado tanto en OriH
como en OriL. Curiosamente, los mecanismos y factores
necesarios para este proceso difieren entre los dos orígenes
(Figura 5; Bailey et al. 2009; Holmes et al. 2015; Uhler et al.
2016; Al­Behadili et al. 2018).
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516 M. FALKENBERG Y CM FALKENBERG
Los cebadores utilizados para iniciar la síntesis de ADN en
OriL son procesados por la RNasa H1. La enzima escinde el
cebador de ARN, eliminando casi todo el tramo de ARN desde el
tramo poli­dT en la región del bucle hasta el punto de transición
entre el ARN y el ADN en la base del tallo (Figura 5(A)) . En
consecuencia, la maduración del cebador en OriL se ve afectada
en los fibroblastos embrionarios de ratón knockout condicionales
para Rnaseh1 (Holmes et al. 2015). Por sí sola, la RNasa H1 no
es suficiente para la eliminación completa del cebador, ya que la
enzima deja de 1 a 3 ribonucleótidos en la unión del ARN al ADN
(Lima et al. 2007). Estos últimos ribonucleótidos restantes son
problemáticos ya que bloquean la ligadura mediante la Ligasa 3
mitocondrial y, por lo tanto, se requiere una actividad nucleasa
adicional (Al­Behadili et al. 2018). La nucleasa faltante podría ser
potencialmente una endonucleasa de colgajo, ya que POLc
normalmente sintetiza unos pocos nucleótidos en regiones dúplex,
provocando la formación de un sustrato de colgajo. En apoyo de
esta idea, la endonucleasa 1 del colgajo nuclear (FEN1) puede
ayudar a la RNasa H1 a producir extremos ligables en OriL en un
sistema de replicación de ADNmt in vitro reconstituido. Sin
embargo, es poco probable que FEN1 sea responsable de esta
actividad in vivo, ya que los estudios publicados argumentan en
contra de la existencia de FEN1 activo en las mitocondrias (Uhler
y Falkenberg 2015) y tampoco han observado efectos del
agotamiento de FEN1 en la ligadura de OriL. en células (Al­
Behadili et al. 2018). En cambio, recientemente se sugirió que una
nucleasa alternativa desempeña un papel en la maduración del
cebador, EXOG. Esta proteína tiene una localización mitocondrial
clara y puede eliminar de manera eficiente los últimos
ribonucleótidos del cebador OriL in vitro (Wu et al. 2019). Sin
embargo, aún falta evidencia in vivo del papel de EXOG en OriL y
en experimentos no publicados, no hemos podido observar la
formación de productos ligables cuando se combinan RNasa H1
y EXOG in vitro. Por lo tanto, es necesario seguir trabajando y el
procesamiento de imprimaciones en OriL aún no es un problema resuelto.
La eliminación del cebador en OriH es un proceso aún más
complicado (Figura 5(B)). Como se mencionó, la transición de
ARN a ADN en OriH tiene lugar en la región CSB2/CSB3 (Figura
4). Sin embargo, el extremo 50 libre de la cadena H naciente del
ADN se encuentra a más de 100 nt más abajo (Clayton 1991). Un
extremo libre principal de 50 se encuentra en la posición 191.
También hay varios extremos libres adicionales de 50 .
termina más abajo (incluidas las posiciones 168, 151 y 110). Esta
discrepancia sugiere que el procesamiento del cebador no sólo
elimina la parte del ARN, sino también una porción considerable
de la cadena H naciente del ADN (Kang et al. 1997; Fish et al.
2004; Yasukawa et al. 2005 ; Pham et al . 2006) .
Se han identificado dos nucleasas como necesarias para la
eliminación del cebador y el procesamiento de la cadena H
naciente en OriH­RNase H1 y MGME1. Se ha propuesto que la
RNasa H1 procesa la parte inicial del cebador, abarcando desde
LSP hasta la región CSB2, mientras que MGME1
la nucleasa elimina la parte restante, incluido un tramo de ADN de
cadena H naciente (Kornblum et al. 2013; Uhler et al. 2016).
MGME1 es miembro de la familia RecB y la enzima muestra una
fuerte preferencia por el ssDNA, escindiendo 50 y 30 solapas.
MGME1 también puede procesar solapas quiméricas de ARN­
ADN, pero solo si la solapa es lo suficientemente larga para que
MGME1 inicie la degradación del ADN en una posición de 2 a 5 nt
aguas abajo de la unión entre el ARN y el ADN (Kornblum et al.
2013; Uhler et al . 2016). Este requisito de sustrato ayuda a
explicar por qué MGME1 no es adecuado para ayudar a la RNasa
H1 en el procesamiento en OriL. Las mutaciones con pérdida de
función en el gen MGME1 causan enfermedades mitocondriales.
En apoyo de la función propuesta de MGME1, los extremos 50 del
ADN 7S se mueven más arriba, hacia CSB2, en líneas celulares
derivadas de estos pacientes (Kornblum et al. 2013; Szczesny et
al. 2013; Nicholls et al. 2014) .
Para funcionar, MGME1 necesita un sustrato monocatenario y,
por lo tanto, la cadena H naciente debe desplazarse de la cadena
plantilla para poder escindirse (Figura 5 (B)). Se desconoce cómo
se produce el desplazamiento de la cadena, pero hay varias
helicasas en la matriz mitocondrial que son posibles candidatas
para esta reacción (Calvo et al. 2016). TWINKLE no es uno de
estos candidatos, ya que requiere un sustrato distinto con un
tramo de 10 nt de ssDNA en el lado 50 de un dúplex para iniciar
el desenrollado (Korhonen et al. 2003). La maquinaria de
transcripción mitocondrial también podría desplazar parte de la
cadena H naciente. Normalmente, la región aguas arriba de la
burbuja de transcripción se vuelve a hibridar una vez que POLRMT
ha pasado, pero cuando se transcribe una región de triple hebra,
este no es necesariamente el caso. Por lo tanto, a medida que
POLRMT se mueve desde LSP hacia OriH durante la transcripción
activa, la región 50 de la cadena H naciente puede desplazarse
y las dos cadenas parentales se vuelven a hibridar detrás de la
maquinaria de transcripción. En apoyo de esta idea, se produce
un transcrito abundante y no codificante denominado ARN 7S
mediante la transcripción de LSP a CSB1 y la síntesis de este
transcrito podría potencialmente causar el desplazamiento de la
cadena H y la formación de un sustrato adecuado para el proceso
de MGME1. essing (Amalric et al. 1978; Jemt et al. 2015).
Una vez que se ha eliminado un tramo más largo de la cadena
H naciente, es necesario ligar la columna vertebral del ADN.
MGME1 genera un conjunto de productos cortados de manera
imprecisa, que a menudo deja aletas o espacios cortos en la
cadena H, que no pueden sellarse directamente con la Ligasa 3
mitocondrial. Para crear una mella perfectamente alineada que
pueda ligarse de manera eficiente, POLc debe usar su ADN
polimerasa y 30 –50 actividades exonucleasas para extender o acortar el extremo 3
de cadena H. Durante este proceso, POLc trabaja en conjunto con
MGME1, con la polimerasa desplazando a corto
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replicación del ADN terminación del ADN
orih
orih
oril
Moléculas entrelazadas
Figura 6. El papel de TOP3A en la resolución de moléculas de ADNmt. La replicación del ADNmt circular genera moléculas hijas unidas
entre sí por una estructura de hemicatenano en la región OriH. Las moléculas hijas interconectadas se resuelven mediante TOP3A (panel
superior). La falta de actividad TOP3A provoca la formación de moléculas catenadas que no pueden segregarse correctamente.
aletas en aletas más largas que pueden usarse para nuevas rondas
de escisión de MGME1 (Uhler et al. 2016).
Las toposiomerasas son necesarias para la separación
del ADNmt y la progresión de la horquilla de replicación
Una vez completada la replicación del ADNmt, las dos moléculas
hijas deben separarse y distribuirse dentro de la red mitocondrial
(Figura 6). Las moléculas de ADNmt recién replicadas se resuelven
mediante la formación de un intermedio de hemicatenano en la
región OriH (Hudson y Vinograd 1967; Nicholls et al. 2018). Esta
estructura consta de dos moléculas de ADN bicatenario asociadas
con un enlace monocatenario, que en algunos sistemas puede
formarse a partir de horquillas de replicación convergentes. Queda
por establecer cómo se producen las estructuras de hemicatenano
durante la replicación del ADNmt.
Las moléculas de ADNmt recién replicadas son decatenadas por
la topoisomerasa 3A (TOP3A), una topoisomerasa de la familia tipo
IA (Nicholls et al. 2018). Las mutaciones que causan enfermedades
en el gen TOP3A provocan la formación de conjuntos masivos de
ADNmt catenados, múltiples deleciones de ADNmt y síntomas de
oftalmoplejía externa progresiva crónica, un trastorno mitocondrial
también asociado con mutaciones en otros genes que codifican
factores de replicación mitocondriales. La isoforma nuclear de TOP3A
es un componente del complejo BTR, que actúa para resolver las
uniones dobles de Holliday (Sarbajna y West 2014). Las otras
subunidades del complejo BTR (BLM, RMI1 y RMI2) no están
presentes en las mitocondrias y no afectan la decatenación del
ADNmt (Nicholls et al. 2018).
Además de TOP3A, las mitocondrias también contienen
topoisomerasa 1 mitocondrial (TOP1mt; Zhang et al. 2001), una
topoisomerasa de tipo IB que actúa para contrarrestar
REVISIONES CRÍTICAS EN BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR 517
Separación de ADN
3 primeros
orih
Sin Top3
superenrollamientos positivos producidos durante la transcripción o
replicación (Dalla Rosa et al. 2017). Los ratones que carecen del gen
TOP1mt siguen siendo viables (Douarre et al. 2012), pero han
cambiado los niveles de superenrollamiento del ADNmt y síntomas
de disfunción mitocondrial (Kao et al. 1983; Zhang et al. 2014). El
agotamiento de TOP1mt y TOP3A en combinación provoca un
fenotipo grave con una disminución pronunciada en los niveles de
ADNmt (Nicholls et al. 2018).
Formación de deleciones en el ADN mitocondrial.
Las formas eliminadas de ADNmt están asociadas con un número
de diferentes enfermedades humanas y también se forman en
Tejidos posmitóticos durante el envejecimiento humano normal
(Rahman y Copeland 2019). En algunas enfermedades, por ejemplo,
el síndrome de Kearns­Sayre y la oftalmoplejía externa progresiva
crónica, las deleciones se forman esporádicamente. En otras
situaciones, las eliminaciones pueden ser secundarias a mutaciones
en genes que codifican proteínas necesarias para la replicación del
ADNmt, por ejemplo, POLG, POLG2, TWNK, DNA2, TOP3A y
MGME1. Los síntomas clínicos asociados con las deleciones del
ADNmt pueden variar desde manifestaciones graves en la infancia
hasta síntomas leves en tejidos individuales en etapas posteriores
de la vida (Viscomi y Zeviani 2017 ). Las células contienen múltiples
copias de ADNmt, y cada célula contiene de cientos a miles de
moléculas individuales y todas las eliminaciones de ADNmt son
heterogéneas.
oplasmáticos, es decir, coexisten con copias de tipo salvaje. A
menudo se puede tolerar un nivel sorprendentemente alto de
deleciones, pero una vez que las moléculas patógenas de ADNmt
superan un cierto umbral, se desarrolla una deficiencia de la cadena
respiratoria y fenotipos de enfermedad (Hayashi et al. 1991) .
La deleción circular más frecuente en células humanas provoca
la pérdida de una región de 5,0 kb entre la posición
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518 M. FALKENBERG Y CM FALKENBERG
1ra ronda 2da ronda
(A)

i oh
norte
r
ORTEM
arC
orih

METRO
aj oh
oril
rarC

1ra ronda 2da ronda

(B)

Elección de copia
recombinación
3' repetir

orih

Supresión

oril 5' repetir Hetero­

dúplex

(C) 1ra ronda 2da ronda

solapa de 5'

ligadura
Mella
bloque
5'­flap

OSD
orih
orih

Arco mayor
fragmento
oril

oril

Figura 7. Un modelo de cómo la recombinación por elección de copia puede conducir a la formación de moléculas de ADNmt eliminadas. (A) Desplazamiento de hebras
de replicación del ADN. (B) Formación de deleciones circulares. Durante la replicación del ADN por desplazamiento de cadena, se repiten secuencias
en la cadena H parental están expuestos. Si POLc se disocia de la plantilla durante la replicación de la primera repetición, el extremo 30 de
el ADN recién sintetizado puede desemparejarse de la cadena H modelo y desaparearse con una segunda repetición, ubicada más abajo en la misma cadena. Cuando
POLc reanuda la síntesis de ADN a partir del extremo 30 desapareado , se pierde la repetición que se cierra a OriH.
junto con la secuencia intermedia. De esta forma se forma una molécula heterodúplex, que cuando se utiliza como plantilla para
La segunda ronda de síntesis de ADNmt genera una molécula de ADNmt de longitud completa y otra que contiene deleciones. Elección de copia
la recombinación sólo requiere de la maquinaria de replicación mitocondrial y es independiente de los mecanismos de reparación. El proceso
puede ser estimulado por elementos de la estructura secundaria en la cadena H o por mutaciones que causan enfermedades y que conducen a una replicación reducida
Machine Translated by Google
REVISIONES CRÍTICAS EN BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR 519

8470 y posición 13,447 en ADNmt. Esta "deleción común" se localiza la supresión común y otras supresiones circulares

entre dos repeticiones directas de 13 pb (ACCTCCCTCACCA), una de
las cuales se retiene, mientras que la otra se pierde durante la
formación de la deleción (Schon et al. 1989 ). La deleción común
conduce a un agotamiento de genes mitocondriales esenciales, que
codifican tanto para ARNm como para ARNt. La deleción se observa
en pacientes con miopatía mitocondrial, pero también se acumula en
tejidos posmitóticos durante el envejecimiento normal (Cortopassi y
Arnheim 1990).
observado en humanos. En apoyo del modelo, el análisis bioinformático
de las eliminaciones formadas entre repeticiones imperfectas en
pacientes ha demostrado la retención preferencial de la repetición más
cercana a OriL, que es lo que se esperaría si se trata de la repetición
50 del evento de recombinación de elección de copia ( Samuels et al.
2004; Persson et al. 2019). Además, la recombinación por elección de
copia se puede reconstituir in vitro utilizando únicamente proteínas
mitocondriales purificadas y una plantilla de ADN.

Se ha debatido cómo se forman las eliminaciones del ADNmt, pero
el proceso requiere una replicación activa del ADNmt (Phillips et al.
2017). Los primeros trabajos sugirieron un modelo de cadena
deslizada, según el cual las deleciones se forman durante la síntesis
de ADN de la cadena H a lo largo del arco principal (Shoffner et al.
1989). Un segundo modelo propuso que las roturas de doble cadena
seguidas de la reparación del ADN podrían explicar la formación de
deleciones. El segundo modelo recibe apoyo de la observación de que
la expresión transitoria de una endonucleasa de restricción dirigida a
las mitocondrias puede causar roturas de doble cadena, lo que
eventualmente da como resultado especies eliminadas que se
asemejan a eliminaciones naturales del ADNmt (Srivastava y Moraes
2005) . Para que el modelo sea correcto, se requiere algún tipo de
sistema de reparación de roturas de doble hilo, que aún está por
identificar. Para una discusión detallada sobre doble
roturas de cadenas y su papel en la formación de deleción del ADNmt
ción, nos remitimos a una revisión reciente (Nissanka et al. 2019).
Más recientemente, hemos sugerido que las eliminaciones de
ADNmt se forman mediante recombinación de elección de copia
durante la síntesis de ADN de cadena L (Figura 7(A,B)), un modelo
similar a lo que se ha observado en otros sistemas, por ejemplo, E.
coli (Persson et al.2019 ). Durante la síntesis de ADN de cadena
retrasada en bacterias, la cadena plantilla puede formar estructuras
secundarias que ralentizan o bloquean la síntesis de ADN, lo que a su
vez puede causar la disociación de la ADN polimerasa. Cuando esto
sucede, el extremo 30 libre de la hebra rezagada naciente puede
disociarse de la hebra plantilla y volver a hibridarse con una región
aguas abajo, de secuencia similar o idéntica en la misma hebra
plantilla. Cuando se reanuda la síntesis de ADN a partir del extremo
30 reasociado , la región intermedia se pierde y se forma una deleción.
La recombinación por elección de copia se puede utilizar para explicar
la formación de
La recombinación por elección de copia explica por qué las
deleciones circulares se forman preferentemente en el arco mayor.
Durante la replicación del ADNmt por desplazamiento de cadena, un
largo tramo de la cadena H parental está presente en una conformación
monocatenaria (Figura 7 (A)). Esto constituye un riesgo, ya que si
POLc se detiene y se disocia durante la síntesis de ADN de la cadena
L, existen muchas oportunidades para la recombinación por elección
de copia con regiones posteriores en la cadena H expuesta (Figura 7
(B)). La recombinación por elección de copia se estimula mediante
secuencias repetidas más largas, pero también puede funcionar entre
repeticiones cortas o incluso secuencias no repetidas (Persson et al.
2019).
Dado que la recombinación por elección de copia es una
consecuencia de la liberación temporal de POLc del molde, es fácil
entender por qué el proceso es estimulado por cualquier cosa que
perjudique la procesividad de replicación del ADN, por ejemplo, por
mutaciones en las proteínas necesarias para la replicación del ADNmt
o para mantener la correcta reservas de nucleótidos mitocondriales.
Los grupos de nucleótidos más bajos conducirán a una menor
procesividad y a un mayor riesgo de disociación. El modelo explica por
qué las mutaciones patógenas en varios factores de replicación, como
POLc, TWINKLE, TOP3A y el transportador de nucleótidos, ANT1,
pueden mejorar la formación de deleción del ADNmt en pacientes
afectados (Kaukonen et al. 2000; Spelbrink et al. 2001 ; Van Goethem
et al. 2001; Nicholls et al. 2018).
Formación de fragmentos lineales
en el ADN mitocondrial.
Además de las deleciones circulares, también se han observado
deleciones lineales de ADNmt. Las mutaciones en el gen que codifica
la nucleasa MGME1 conducen a la formación de una

procesividad. (C) Formación de fragmentos lineales durante la síntesis de ADNmt. Las mutaciones que causan enfermedades en MGME1 o la
pérdida de la actividad exonucleasa POLc 30 a 50 pueden afectar la formación de extremos ligables en OriH, dejando una mella en la cadena
H (primera ronda). Durante la siguiente ronda de replicación del ADNmt (segunda ronda), la fase inicial de síntesis de la cadena H puede
continuar sin perturbaciones, ya que la cadena L modelo está intacta. Sin embargo, la síntesis de ADN iniciada en OriL utilizará la cadena H
mellada como plantilla y, por lo tanto, la replicación terminará prematuramente cerca de OriH. Como resultado, se formará un fragmento
eliminado lineal. La región ssDNA del fragmento se degradará, dejando un producto bicatenario lineal que cubre todo el arco principal (panel
inferior derecho). Por lo tanto, si no se liga en OriH, se formarán dos productos de replicación diferentes. Un fragmento lineal de doble cadena
y una molécula circular de ADNmt con una mella en OriH. Si la molécula mellada se utiliza para una nueva ronda de replicación del ADNmt, es
posible que se formen nuevamente los mismos dos productos. Abreviaturas: DSB, rotura de doble hebra.
Machine Translated by Google
520 M. FALKENBERG Y CM FALKENBERG
fragmento lineal de ADNmt, que corresponde a la región entre OriH y
OriL (Figura 7 (C), fragmento de arco principal; Nicholls et al. 2014;
Matic et al. 2018). Como el fragmento es lineal y carece de orígenes,
no puede replicarse y debe producirse constantemente de novo.
También se produce un tipo similar de fragmento lineal en un ratón
que expresa una forma mutante de POLc, que carece de actividad
exonucleasa de 30 a 50 (Trifunovic et al. 2004; Macao et al. 2015).
La formación de la forma lineal y eliminada del ADNmt también
puede explicarse por el modo de desplazamiento de la cadena de
replicación del ADNmt. Como se analizó anteriormente, la actividad
nucleasa MGME1 y la actividad exonucleasa de POLc trabajan juntas
para producir mellas ligables durante la terminación de la replicación
del ADN de la cadena H (Uhler et al. 2016 ).
Por lo tanto, la pérdida de cualquiera de las actividades corre el riesgo
de perjudicar la ligadura de la cadena H cerca de OriH. Una mella en
la cadena H no presenta un problema para nuevas rondas de síntesis
de la cadena H, ya que la cadena L modelo no se ve afectada. Sin
embargo, el nick será un problema para la replicación iniciada en OriL.
Una vez que la síntesis de ADN de cadena L iniciada en OriL llega a
la mella en el ADN de cadena H, se formará una rotura de doble
cadena. La ruptura provocará la formación de un fragmento de ADNmt
lineal, que se extiende desde OriH y OriL. Este modelo, basado en el
modo de desplazamiento de cadena de replicación del ADNmt, puede
explicar por qué las mutaciones que afectan la actividad de la
exonucleasa MGME1 o POLc 30 a 50 generan un fragmento de
ADNmt lineal similar in vivo.
Conclusiones
En esta revisión, hemos tratado de transmitir nuestro conocimiento
actual de la maquinaria de replicación del ADNmt, tanto de su función
normal como de su papel durante la formación de deleciones
asociadas con enfermedades humanas. Como se indicó, todavía hay
una serie de preguntas abiertas en el campo y muchos de los modelos
discutidos aquí requieren apoyo adicional de experimentos tanto in
vivo como in vitro para establecerse firmemente. Un aspecto fascinante
de la replicación del ADNmt es su estrecha relación con los procesos
de replicación previamente estudiados en bacterias y bacteriófagos.
En muchos aspectos, el campo se guía por el trabajo realizado por
los primeros pioneros de la replicación y recombinación del ADN. Otra
fuente importante de información e inspiración ha sido la identificación
de un gran número de mutaciones causantes de enfermedades en
genes que codifican proteínas necesarias para el mantenimiento del
ADNmt. Muchos factores de replicación se identificaron por primera
vez de esta manera y los fenotipos mitocondriales observados en los
pacientes afectados en muchos casos han guiado el trabajo
bioquímico posterior, con el objetivo de comprender la base
mecanística de, por ejemplo, la formación de deleciones. Estamos
convencidos de que una comprensión detallada
Estos procesos sentarán las bases para el desarrollo de nuevas
terapias que puedan mejorar los fenotipos de enfermedades
asociados con mutaciones en la maquinaria de replicación del ADNmt.
Expresiones de gratitud
Agradecemos al Dr. Jay P. Uhler quien preparó las ilustraciones y al
Dr. Bradley Peter por comentar el manuscrito.
Declaración de divulgación
Los autores no informaron ningún posible conflicto de intereses.
Fondos
El trabajo descrito aquí fue apoyado por el Consejo Sueco de
Investigación a través de subvenciones [2018­02439] y [2017­01257] a
MF y CMG, respectivamente, la Fundación Sueca contra el Cáncer a
través de subvenciones [2019­816] y [2017­631] a MF y CMG,
respectivamente, la Fundación Knut y Alice Wallenberg a través de
subvenciones [KAW 2017.0080 y Scholar position] a MF, el Consejo
Europeo de Investigación a través de una subvención [683191] a MF y
subvenciones del estado sueco en virtud del acuerdo entre el gobierno
sueco y las Diputaciones Provinciales, el acuerdo ALF a través de
subvenciones [ALFGBG­727491] y [ALFGBG­728151] a MF y CMG,
respectivamente.
ORCIDO
María Falkenberg http://orcid.org/0000­0001­8713­173X
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