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El ADN mitocondrial en Medicina Forense
Fabiola Peiró Codina, Amparo Prades Sanchís, Begoña
Martínez Jarreta
Laboratorio de Genética Forense.
Universidad de Zaragoza (España)

INDICE

1. Introducción 1
2. Técnicas de análisis del ADN mitocondrial 3
3. SNPs de ADN mitocondrial 5
Bibliografía 6

1. INTRODUCCIÓN

La mitocondria es una organela intracitoplasmática delimitada por una doble membrana

con plegamientos en la más interna y cuya misión primordial es producir, transformar y
almacenar energía en la célula.
En el año 1954 Casperson demostró en la mitocondria la presencia de ADN de estructura
y propiedades diferentes al ADN nuclear. Barrell y cols. en 1979 y Young y Anderson en
1980, también describieron un código genético diferente en las mitocondrias (1).
La cifra media de mitocondrias en una célula varía entre 250 y 1.000, pese a que es muy
difícil de determinar por variar según la especie, tipo celular, necesidades metabólicas y
momento funcional (1 y 2).
El genoma mitocondrial es un fragmento circular de ADN compuesto por 16,5 kilobases
con tres características especialmente significativas que lo han convertido en objetivo de
estudio del estudio de muchas especialidades de la Biología y de la Medicina, dichas
características son:
1. Herencia estrictamente materna (2 y 3).
2. Relación con diversas enfermedades y procesos degenerativos generalizados (4 y 5).
3. Se conoce con exactitud la secuencia de todos sus nucleótidos (6), lo que es de gran
utilidad para el análisis de sus polimorfismos y posterior aplicación en genética
forense (7 y 8)

Los 16.569 pb que componen el ADNmt se disponen de forma circular y cerrada, en dos
cadenas complementarias y antiparalelas, que se encuentran en múltiples copias dentro de
la mitocondria, en total entre 1.000 y 10.000 moléculas de ADNmt por célula (9 y 10).
Por su composición bioquímica, las dos cadenas son diferentes, ya que en la secuencia
nucleotídica de una prevalecen las bases púricas (adenina y guanina), por lo que es más
pesada que su complementaria donde, para respetar la complementariedad, han de
predominar las bases pirimidínicas (timina y citosina); en consecuencia, a la primera de
las cadenas se la denomina H (Heavy o pesada), y a la otra cadena L (Light o ligera) (4).

2.4. El ADN mitocondrial en Medicina Forense

Curso on line de Genetica Forense. Universidad de Zaragoza 1
El ADNmt se localiza en la matriz de la mitocondria, aunque ocasionalmente se
encuentra unido a la membrana mitocondrial interna. En la mitocondria se produce la
fosforilación oxidativa, generándose casi todo el adenosin-trifosfato (ATP), molécula
básica de intercambio de energía, que la célula necesita. Contiene su propio sistema
genético y exhibe una herencia citoplasmática (1).
El ADNmt no tiene nada especial que lo diferencie del ADN nuclear en su composición
química, sin embargo posee un código genético propio (1). Por otro lado, su organización
es tremendamente económica ya que tan sólo un 10% de su totalidad es ADN no
codificante y no contiene intrones (6 y 11), por lo que posee una relativa simplicidad en
su genoma.
En los mamíferos, el espermatozoide aporta poco o nada de citoplasma al zigoto, y la
mayor parte, si no todas, de las mitocondrias del embrión deben derivar de las del óvulo y
no del espermatozoide. Su genoma, por tanto, es haploide debido a que su herencia es
estrictamente materna (2, 3, 12 y 13), y no se encuentra sometido a procesos de
recombinación, al contrario que el ADN nuclear (3).
El ADNmt se autoperpetúa por la replicación de sus cadenas, proceso que se inicia con la
separación de la cadena H de la L en el nucleótido número 191 de la zona denominada
asa de desdoblamiento o d-loop (displacement loop), una región de 1,1 Kb situada entre
los genes de la tARNPro y tARNPhe y de la que no se conoce función codificadora
alguna; tomando como molde una cadena L se forma una cadena H de unas 680 bases,
conocida como 7S ADN (14, 15 y 16), continuando después la síntesis del resto de la
cadena pesada.
La replicación de la cadena ligera sólo se produce cuando su lugar de origen replicativo
queda expuesto como una cadena simple al elongarse la cadena pesada; para ello es
necesario que transcurra cierto tiempo, ya que el punto de origen de la cadena ligera no se
encuentra en el asa de desdoblamiento, sino incluido en el interior de una batería de
5 genes de tARN, aproximadamente a unos 5,7 Kb del origen de la cadena pesada (17).
Por otro lado, ambas hebras del ADNmt, H y L, se transcriben completamente a partir de
promotores PL y PH1, situados en la región d-loop del genoma mitocondrial (18 y 19).
La mayor variabilidad interpersonal se acumula en la denominada asa de desdoblamiento
o d-loop (displacement loop), que es un fragmento de 1.112 pares de bases que no se
encuentra involucrado en la codificación de ningún producto proteico, por lo que las
mutaciones se acumulan con una frecuencia de 5 a 10 veces mayor que en el resto del
genoma mitocondrial (20 y 21). A este fragmento también se le denomina región control
y es la zona más polimórfica de todo el genoma del ADNmt humano (21, 22, 23 y 24).
Esta región se subdivide a su vez en dos subregiones de aproximadamente el mismo
tamaño cada una (400 pb): la región hipervariable I (HVI) y la región hipervariable II
(HVII). La mayor parte de las variaciones no están distribuidas al azar, sino que se
concentran en estos dos segmentos hipervariables (3 y 25).
Con el transcurso del tiempo, las mutaciones se van produciendo, acumulando y
perpetuando en las diversas personas, por lo que incluso individuos que proceden de una
misma línea materna (y por lo tanto deberían tener exactamente el mismo ADNmt)
aparecerán diferentes con el transcurso del tiempo, en este caso, miles de años (26).
La región control es la menos conservada entre las distintas especies (27), y más del 96%
de los cambios de base son transiciones (28).

2.4. El ADN mitocondrial en Medicina Forense

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 Figura 1:
Representación esquemática del ADN mitocondrial.

Región Control
~ 1100pb
342pb 268pb
HV1 HV2

16024 16365 1 73 340

HV HV

Cadena 16.569 Cadena

ligera L pesada H

El avance de las técnicas de análisis molecular ha permitido conocer y asociar diversos

tipos de patologías del ser humano con las variaciones (mutaciones, delecciones o
inserciones) del ADN mitocondrial (29 y 30). Una vez superados los estudios iniciales
basados en técnicas potentes, pero no lo suficientemente discriminativas, ni informativas
(como la detección de variaciones por medio de alteración en los puntos de corte de
enzimas de restricción), y gracias a la introducción de sistemas de secuenciación
automáticos o semiautomáticos, se ha facilitado el conocimiento exacto de la estructura
íntima de cada fragmento de ADNmt, así como las repercusiones que muchas de sus
variaciones producen en el ser humano en forma de patología y procesos degenerativos
(31).
Se ha podido demostrar que en el ADNmt se acumula un número de mutaciones superior
a las que lo hacen en el ADN genómico (29 y 32). Este hecho se explica por diferentes
mecanismos que intervienen paralelamente (4, 21, 23, 33 y 34):
1. El material genético mitocondrial está especialmente expuesto a la acción de
moléculas reactivas en general (procesos de oxidorreducción en su interior), por lo
que es muy sensible al daño oxidativo, principalmente causado por la existencia de
un mayor número de radicales libres.
2. El ADNmt carece del efecto protector que las histonas otorgan al ADN nuclear.
3. Los mecanismos reparadores del ADNmt son menos efectivos que los del ADN
nuclear.
La ADNmt polimerasa posee una pobre actividad proof reading si la comparamos con la
polimerasa del ADN nuclear.

2. TÉCNICAS DE ANÁLISIS DEL ADN MITOCONDRIAL

El abordaje técnico del ADNmt en Genética Forense suele realizarse por secuenciación
directa tras la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), técnica que facilita el análisis
al amplificar la región control del ADNmt que deseamos estudiar.
La introducción de la técnica de PCR supuso un avance sin precedentes en la Medicina
Forense ya que se podían analizar regiones lo bastante pequeñas como para que la
degradación del ADN genómico no tuviera tanta importancia. Como aplicación inmediata

2.4. El ADN mitocondrial en Medicina Forense

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se usó en la identificación de restos humanos (35) ya que hasta entonces se estudiaban los
polimorfismos de ADN con métodos convencionales (RFLP) que no daban buenos
resultados con muestras degradadas.
Entre las primeras aportaciones al análisis de ADN mitocondrial en Medicina Forense
destaca la de Hopgood y cols. (36).
De esta manera obtenemos la información deseada en términos de variaciones
individuales en forma de mutaciones puntuales, inserciones o delecciones (37).
Antes de ser aceptados para la práctica forense el conjunto de los polimorfismos
analizables por PCR deben cumplir una serie de requisitos y pasar sucesivos controles de
validación (38 y 39).
Esta región de 1112 pb puede ser amplificada de varias maneras, sin embargo los
métodos más utilizados en la actualidad son: Nested-PCR (PCR anidada) y Seminested-
PCR (PCR semianidada) para amplificar la región hipervariable I (HVI) (25) y la PCR
simple usada en la amplificación de la región hipervariable II (HVII) (26 y 40), con la
utilización de primers que acotan las zonas de la región que se va a amplificar.
La Nested PCR se realiza en dos fases, y es útil en casos en los que se dispone de poca
cantidad de ADN problema, este método favorece el mayor rendimiento y la obtención de
mayor cantidad de producto final amplificado. Sin embargo posee la desventaja de que es
más sensible a la contaminación lo que puede llevar a la obtención de resultados
falsamente positivos. El uso de PCR simples disminuye el riesgo de estar amplificando
ADN ajeno a la muestra problema, pero en contraposición, genera menos cantidad del
producto de PCR final lo que en ocasiones nos imposibilita la obtención de resultados
(41).
Una vez amplificado el ADN mitocondrial, hay diversas formas de poner de manifiesto
los polimorfismos que presente la secuencia en estudio.
Cuando analizamos una secuencia, lo que pretendemos es conocer la disposición u orden
en que se encuentran los nucleótidos que componen un fragmento de ADN determinado.
En los últimos años y gracias al avance de la tecnología, las posibilidades en cuanto a
métodos y procedimientos de secuenciación se han incrementado de forma beneficiosa
para la comunidad científica. El uso de secuenciadores automáticos (42) y de
fluorocromos ha venido a facilitar el análisis de la secuencia del ADN, que ahora es
posible siguiendo estrategias muy distintas:
- Secuenciación cíclica (36, 43 y 44).
- Secuenciación en fase sólida (36 y 45).
Pero además de los métodos de secuenciación existen otras alternativas a la hora de poner
de manifiesto las diferencias mutacionales (existencia de variaciones nucleotídicas
puntuales), que no exigen el análisis de la secuencia completa, y que pueden ser un
primer método de screening o despistaje en identificación forense:
-La técnica de SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) (46, 47 y 48) como
método de screening.
-RE-SSCP (Restriction Enzyme-SSCP) (49 y 50)
-LSSP-PCR (Low Stringency Single Specific Primer) (51)
-Heteroduplex (52)
-Dot-blot con sondas ASO/SSO (Sequence Specific Oligonucleotide) (8)
-IR (Infrared Fluorescence) (53)
-Minisecuenciación (54)
-RT-PCR (55)

2.4. El ADN mitocondrial en Medicina Forense

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3. SNPS DE ADN MITOCONDRIAL

Las mutaciones pueden tener efectos deletéreos y causar enfermedades y también, en

ocasiones, pueden ser neutras o incluso beneficiosas. Sea cual sea su efecto en términos
de salud, lo que sí inducen es el polimorfismo, es decir, la variación alélica entre
individuos de la misma especie. Un polimorfismo es considerado como tal cuando su
frecuencia en la población es superior al 1%. Hay varios tipos de polimorfismos
(inserciones, delecciones, variaciones en el número de secuencias repetidas en tandem),
pero los más frecuentes (el 80%) son los denominados SNPs (Single Nucleotide
Polymorphisms) (56).
Los SNPs están distribuidos a lo largo de todo el genoma con un promedio de densidad
de 1 cada 1,9 Kb (57).
El estudio de los SNPs, fundamentalmente a través del empleo de chips genéticos (58), ha
adquirido un notable auge por su posible contribución a la definición de las bases
moleculares de las enfermedades complejas o multigénicas, que incluyen las más
frecuentes, como son el cáncer, la artritis, la diabetes, las enfermedades autoinmunes o las
cardiovasculares (59).
Además de su uso como marcadores genéticos en Medicina Clínica también tienen una
gran utilidad en Medicina Forense, pues pueden constituir una eficiente herramienta de
identificación genética en casos criminales. Así, podríamos encontrar cuatro variedades
de tipado por individuo para cada SNP según la base que estuviera mutada (A, C, G, T) y
si se estudian un número suficiente de SNPs para cada muestra, tendríamos un buen perfil
de discriminación e identificación.
El estudio de los SNPs ha pasado por sucesivas fases y técnicas:
- Sondas específicas de alelo (ASO: Allele Specific Oligonucleotide) (60) y dot-blot
alelo-específico (61). Más recientemente se han usado sondas marcadas
fluorescentes (TaqMan probes) en termocicladores de PCR a tiempo real que
además permiten la cuantificación de la muestra (62)
- SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism).
- Secuenciación directa de los fragmentos de interés.
- Detección de SNPs usando microarrays de oligonucleótidos (63). Se usan primers
con sitios polimórficos y con el extremo 3’ covalentemente unido al soporte. Las
dianas de ADN conteniendo SNPs se generan con una PCR asimétrica. El
rendimiento de los productos elongados aumenta por repetición de ciclos.

En el caso del ADN mitocondrial, la región diana para la aparición de mutaciones es la

región hipervariable con un porcentaje entre 5-10 veces mayor que el ADN nuclear.
Usualmente varían entre el 1-2% de las secuencias de ADN mitocondrial de individuos
no relacionados en esa región hipervariable (64).
En un contexto filogenético, el análisis de SNPs, se usa para estandarizar haplogrupos del
mismo modo que se hace con las variaciones que se encuentran en la región control del
ADN mitocondrial (65 y 66).

2.4. El ADN mitocondrial en Medicina Forense

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 Figura 2:
Contribución de los SNPs a la generación de haplotipos. Un cambio (T-C, A-G) en el primer
par de bases crea un SNP y un segundo haplotipo. Un segundo cambio (A-G, T-C) crea otro
SNP y un tercer haplotipo (59).

Los datos que se almacenan en el SWGDAM (Scientific Working Group on DNA

Analysis Methods) sirven para inferir la rareza de los perfiles del ADN mitocondrial
(haplotipos). Habría polimorfismos población-específicos que darían los perfiles de los
distintos haplogrupos (67). Muchos de los polimorfismos que determinan los haplogrupos
son continente-específicos (68). Se nombran con letras mayúsculas. Así, el 76% de los
africanos pertenecerían al haplogrupo L (69), el 77% de los asiáticos al D (70), los
nativos americanos tendrían cuatro haplogrupos (A-D) (67), mientras que los europeos se
encuadrarían en alguno de los siguientes diez haplogrupos: H, I, J, K, M, T, U, V, W ó X
(71). Seis de estos haplogrupos (H, I, J, K, T y W) quedan confinados a la población
estrictamente europea y probablemente se originaron de los ancestros caucasoides
genéticamente separados de los ancestros de las modernas Asia y Africa (72).
Dado que el estudio del ADN mitocondrial es preferencial en muestras degradadas o
escasas, el avance en la investigación sobre SNPs también va a redundar en su beneficio
creando bases de datos que permitan mayores y mejores identificaciones. Esto es
especialmente útil en el caso de la Genética Forense donde no siempre las muestras se
encuentran en las mejores condiciones ni están en la suficiente cantidad como para poder
caracterizarlas con marcadores nucleares y redundaría en una mejor aportación a las
principales aplicaciones medico-legales de los polimorfismos del ADN mitocondrial:
- investigación biológica de la maternidad tanto en casos rutinarios como en casos
especiales como que se cuente solamente con un único progenitor vivo (73).
- criminalística: el rendimiento del estudio de ADN mitocondrial frente al nuclear en
el caso de muestras difíciles es manifiestamente superior debido a su mayor
cantidad y a la más elevada posibilidad de que alguna copia esté conservada.
- identificación de restos humanos (74).
- identificación de razas (75).
Los SNPs son detectados comparando la secuencia de la Región Control que interesa con
la Secuencia de Referencia de Anderson (6).
Además del interés que tiene el estudio de la Región control del ADN mitocondrial para
la identificación humana y la estimación de divergencias, el resto del genoma
mitocondrial, es decir, la región codificante, también puede presentar SNPs que van a dar
lugar a la aparición de distintas patologías (76).
Del avance en su estudio y caracterización va a depender el éxito de la terapia génica.

2.4. El ADN mitocondrial en Medicina Forense

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