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Separacin en gel por electroforesis como primer paso para identificar la presencia de determinadas molculas dentro de una muestra.

Edward Southern en 1975 crea la tcnica para ADN Tcnica que se realiza mediante la HIBRIDACION de cidos nuclecos para deteccin de las molculas buscadas. Consiste pues en una electroforesis de los fragmentos resultantes tras el corte gracias a la enzima de restriccin, seguida de transferencia empleando secuencias especificas (sondas) complementarias a la molcula de acido ribonucleico a identificar.

SOUTHERN BLOT

RFLP
POLIMORFISMO en la longitud de los fragmentos de restriccin. TECNICA que muestra la relacin gentica entre individuos. Secuencia especifica de NUCLEOTIDOS en el ADN reconocidas y cortadas por enzimas de restriccin tambin llamadas ENDONUCLEASAS.

EXTRACCION DE ADN Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano y en este caso ADN bacteriano.

CORTE DE ADN CON UNA ENDONUCLEASA DE RESTRICCION

El ADN extrado de la muestra se trata con una endonucleasa de restriccin, enzima que corta el ADN en donde tenga una secuencia caracterstica ejemplo: ECOR1

los fragmentos de ADN resultantes se separan segn su tamao mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis, las molculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Las molculas menores se mueven ms deprisa a travs de los poros del gel que las de mayor tamao. Como resultado, se produce una separacin continua de los fragmentos de ADN de acuerdo con su tamao

las molculas de ADN separadas se desnaturalizan mientras permanecen en el gel de agarosa, impregnando ste con una disolucin alcalina. Tras la neutralizacin de sta, el DNA resultante se transfiere a la superficie de una membrana de nylonn, realizando as una copia o "calco. Este proceso de desnaturalizacin y transferencia se conoce como mtodo de Southern en recuerdo de quien lo invent. Al igual que la aplicacin de un secante a un papel con la tinta hmeda transfiere una rplica de la imagen del papel al secante, el "calco" del ADN en el gel a la membrana de nailon conserva la distribucin espacial de los fragmentos de ADN conseguida en el gel como resultado de la electroforesis.

Una sonda de locus nico es una molcula pequea de ADN o ARN capaz de hibridar (es decir, de formar un dplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el ADN de un fragmento de restriccin concreto en el ensayo de Southern. La formacin de la molcula de ADN (dplex) depende del emparejamiento de bases complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en el "calco". El ensayo de Southern resultante de la etapa 4 se incuba en una disolucin que contiene una sonda radiactiva de locus nico, bajo condiciones de temperatura y concentracin de sales que favorezcan la hibridacin. Tras producirse sta, se lava el exceso de sonda no unido, de modo que la nica radiactividad que quede en la membrana de nailon sea la asociada al ADN del locus diana.

Las posiciones de hibridacin de la sonda radiactiva sobre la membrana del ensayo de Southern se detectan mediante autorradiografa. En esta tcnica, la membrana de nylon se coloca, una vez lavada, junto a una pelcula de rayos X dentro de una caja que las asle de la luz. La pelcula registra las posiciones donde hay desintegracin radiactiva. Tras su exposicin y el revelado fotogrfico, el registro resultante de la hibridacin de Southern se conoce como autorradiografa

En un anlisis de DNA se suele caracterizar polimorfismos de ADN en varios cromosomas diferentes. Tras el revelado de una autorradiografa para la primera sonda, se puede lavar la radiactividad con una disolucin a elevada temperatura, que deja el ADN en su sitio, e hibridarlo con una segunda sonda radiactiva que se una a un locus diferente. Se repiten as las etapas 5-7, detectando cada vez un locus diferente. El grupo de autorradiografa de una misma transferencia de Southern se conoce como un "perfil de ADN".

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