TEMA 1.

5: Técnicas de Hibridación de Ácidos Nucleicos

Southern y Northern blot: esquema general

Realmente no existen grandes diferencias en el protocolo a seguir en el Southern y en el

Northern, simplemente que efectúan la hibridación de ADN y ARN respectivamente.

Ambos requieren de un gel de agarosa que en caso del Southern se lleva a cabo una
electroforesis estándar pero en el caso del Northern se lleva a cabo una electroforesis
desnaturalizante, pues el debemos evitar que el ARN tenga estructura segundaria para que su
migración refleje solo su tamaño.

Una vez que el ácido nucleico corre en el gel de agarosa y lo transferimos a una membrana,
hacemos un buffer que contiene una sonda radiactiva y colocamos la membrana inmersa en el
mismo. De esta manera, la sonda va a detectar un fragmento con el cual hibrida debido a su alta
afinidad por el mismo. Finalmente, exponemos la membrana a una película de auto-radiografía
para localizar la sonda, aunque también existen aparatos capaces de medir la radiactividad.

Sistema de transferencia por capilaridad:

La transferencia del ácido nucleico a la membrana se efectúa por capilaridad, pues el mecanismo
es muy económico y muy rápido. Para ello, sobre una bandeja con un buffer colocamos el gel, por
encima la membrana, luego el papel Whatman que hace un puente con un cristal y finalmente
arriba queda un peso adecuado. Tras hacer el montaje del sistema de transferencia y esperar
varias horas, el líquido asciende por capilaridad empapando todo el papel Whatman que queda
humedecido, y el ácido nucleico es arrastrado desde el gel hacia la membrana donde se queda
adherido.

Otros sistemas de transferencia:

- Vacío: el arrastre ocurre por succión.

- Electroblotters (semi-dry blotting): es como una caja con dos electrodos que empleamos
con geles de poliacrilamida, en la que a través de la aplicación de un campo eléctrico
arrastramos el ácido nucleico desde el gel hasta que choca con la membrana.

Tipos de membrana:

Principalmente existen dos tipos de membranas, las de nitrocelulosa y las de nylon cargado,
pues las de nylon neutro son menos usadas. Estas membranas difieren en:

- En la capacidad de captar ácidos nucleicos en cantidades por cm 2, pues en el nylon

cargado es mayor.

- En la capacidad de unión del ácido nucleico a la membrana. Por ejemplo, los fragmentos
pequeños no se unen muy bien a nitrocelulosa y por ello es mejor usar nylon cargado.

- En los procedimientos necesarios para fijar las uniones lábiles del ácido nucleico a la
membrana (inmovilización). En el caso de la nitrocelulosa se hornea a 80ºC bajo condiciones
de vacío durante dos horas, pues de no aplicarse el vacío la nitrocelulosa ardería a esa
temperatura. Por su parte el nylon cargado se puede hornear a 70ºC sin aplicar el vacío, pues
no arde a esa temperatura; también se puede conseguir mediante radiación UV a 254nm. La
única desventaja es que el nylon cargado es más caro que la nitrocelulosa.

Sondas: marcaje radiactivo

1
El marcaje de la sonda es radiactivo y a pesar de estar cayendo en desuso, proporcionan una
sensibilidad carente en otros sistemas, por lo que siguen siendo útiles. La complejidad de su uso
radica en que hay que tener muchos permisos para emplearla, además de muchas precauciones
dependiendo del isótopo usado (algunos como el fósforo son más peligrosos, mientras que en
cuanto al carbono-14 no hay problema).

Podemos llevar a cabo dos tipos de marcajes: en las regiones terminales 3’ o 5’, y a lo largo de
toda la sonda para métodos de traducción aleatoria y de PCR. En ocasiones, el marcaje se realiza
en el interior de un tubo de vidrio cerrado que rota en un horno giratorio. Para ello se introduce la
membrana en el tubo junto con un buffer que contiene las sondas marcadas, de tal forma que
cuando el tubo gira baña la membrana. Luego de hacer los lavados pertinentes para eliminar el
exceso de radiactividad, se toma la membrana y se le aplica una película radiográfica para la
observación de bandas en el lugar de hibridación de la sonda.

Southern blot: ejemplo

En este caso se ha empleado un Southern blot para discernir cuáles son las células correctas para
generar un ratón Kcnok out, en este caso para el gen SCAMP1.

Northern blot: ejemplo

Se suele emplear para medir la expresión de un determinado gen en diferentes condiciones: en

presencia de amonio, en presencia de nitrato o en ausencia de nitrógeno. Como podemos observar
el gen se expresa más en ausencia de nitrógeno. Hoy en día, su uso es menor por el hecho de la
existencia de la técnica de RT-PCR, que nos permite estudiar también la expresión de genes de
manera más cómoda. Si bien es cierto todo lo dicho, también es verdad que a veces se emplea el
Northern blot para corroborar resultados, es decir, usar varios métodos distintos para llegar a las
mismas conclusiones es bueno.

Dot blot y slot blot:

Esta técnica es empleada si lo que nos interesa conocer es únicamente el nivel de expresión de un
gen sin tener en cuenta su tamaño (pues las manchas obtenidas no son exactamente
proporcionales a la cantidad de ARN). Para ello no es necesario realizar una separación por
electroforesis, sino que directamente se lleva a cabo la transferencia de una gota sobre una
membrana con el uso de una pipeta. Posteriormente la membrana se incuba con un buffer que
contiene sondas marcadas radiactivamente, para que así hibriden con el ARN transferido a la
membrana. El nombre de este método procede de la forma de punto (dot) o ranura alargada
(slot) que tienen las manchas tras pasar la membrana por una película autoradiográfica

Sondas: marcaje no radiactivo

Existen otros tipos de marcajes no radiactivos como el marcaje con biotina, digoxigenína y
fluorisceína. Se trata de nucleótidos modificados que fluorecen o que tienen cualquier alteración
que podemos detectar por métodos colorimétricos. Con estos tipos de marcajes es fácil la
detección indirecta con anticuerpo.

Proceso: En la membrana tenemos el ADN complementario con la sonda no radiactiva, sonda

que a su vez es reconocida por la fracción Fab del anticuerpo. A su vez este anticuerpo se
encuentra acoplado a la actividad metabólica de una enzima, que al aportarle los sustratos
necesarios se activa generando una señal luminosa que puede ser visualizada a simple vista o
mediante algún aparato.

*NOTA: Se trata de algo parecido a lo que hacíamos para visualizar las proteínas en un Western
blot, pues a la proteína de la membrana se unía un anticuerpo primario y a este uno segundario
capaz de emitir una señal luminosa.

2
*NOTA: Si la propia sonda ya está marcada con un compuesto fluorescente evitamos estos pasos.

Estos métodos suelen ser muy útiles y aunque suelen dar mucho background, si los niveles de
expresión son buenos no es necesario recurrir a un método tan sensible como el marcaje
radiactivo.