Reacciones Inmunes

SEROLOGIA DE LA REACCIN
ANTIGENO-ANTICUERPO

Ttulo original: Serologa de la Reaccin Antgeno-Anticuerpo
Autor: Jorge Cabrera Muoz
Especialidad: T.S.S. de Laboratorio de Diagnstico Clnico
Edita e imprime: FESITESS ANDALUCA
C/ Armengual de la Mota 37
Oficina 1
29007 Mlaga
Telfono/fax 952 61 54 61
www.fesitessandaluca.es
Diseo y maquetacin: Alfonso Cid Illescas
Edicin Noviembre 2011

NDICE

UNIDAD DIDCTICA I
PRESENTACIN Y METODOLOGA DEL CURSO ............................................................................................................... 5
1.1 SISTENA BE C0RS0S A BISTANCIA ............................................................................................................................................... 7
1.2 0RIENTACI0NES PARA EL EST0BI0 ............................................................................................................................................ 8
1.S ESTR0CT0RA BEL C0RS0 ................................................................................................................................................................. 9

UNIDAD DIDCTICA II
INTRODUCCIN AL SISTEMA INMUNE ........................................................................................................................... 13
2.1 Intiouuccion .......................................................................................................................................................................................... 1S
2.2 El sistema inmune ............................................................................................................................................................................... 1S
2.S Antigenos ................................................................................................................................................................................................ 17
2.4 Clulas uel sistema inmune ............................................................................................................................................................ 2u
2.S Anticueipos ............................................................................................................................................................................................ 22
2.6 Respuesta inmune ............................................................................................................................................................................... 2S

UNIDAD DIDCTICA III
LA REACCIN ANTGENO-ANTICUERPO ........................................................................................................................ 27
S.1. Concepto............................................................................................................................................................................................... 29
S.2. Caiacteiisticas geneiales ue la ieaccion antigeno-anticueipo ...................................................................................... 29

UNIDAD DIDCTICA IV
CONCEPTOS PREVIOS AL ESTUDIO DE LA REACCIN INMUNOLGICA ............................................................... 31
4.1 Intiouuccion .......................................................................................................................................................................................... SS
4.2 Biluciones ............................................................................................................................................................................................... SS
4.S Concepto ue seioconveision. Consiueiaciones pievias a la iealizacion ue una piueba seiologica ............... S4
4.4 Titulo ue anticueipos ....................................................................................................................................................................... SS
4.S El mtouo seiologico ......................................................................................................................................................................... S8
4.6 0bjetivos en el estuuio ue la ieaccion inmunologica .......................................................................................................... S8
4.7 Piincipales mtouos analiticos basauos en la ieaccion antigeno-anticueipo ........................................................ S8

UNIDAD DIDCTICA V
TCNICAS BASADAS EN LA REACCIN DE AGLUTINACIN ...................................................................................... 41
S.1 Intiouuccion a la ieaccion ue aglutinacion .............................................................................................................................. 4S
S.2 Tipos ue aglutinacion ........................................................................................................................................................................ 44
S.S Foimas paia iealizai y valoiai una piueba ue aglutinacion ue foima coiiecta ............................................... 47

UNIDAD DIDCTICA VI
TCNICAS BASADAS EN LA REACCIN DE PRECIPITACIN ..................................................................................... 53
6.1 Intiouuccion a la ieaccion ue piecipitacion ............................................................................................................................ SS
6.2 Tipos ue ieacciones ue piecipitacion ......................................................................................................................................... SS

UNIDAD DIDCTICA VII
TCNICAS BASADAS EN LA REACCIN DE FLUORESCENCIA .................................................................................... 85
7.1 Conceptos pievios al estuuio ue la ieaccion ue fluoiescencia ........................................................................................ 87
7.2 Inmunofluoiescencia ......................................................................................................................................................................... 87
7.S. 0tias tcnicas ue fluoiescencia ................................................................................................................................................... 94
7.4 Piincipales tcnicas ue inmunofluoiescencia ....................................................................................................................... 97

UNIDAD DIDCTICA VIII
TCNICAS BASADAS EN REACCIONES MARCADAS CON RADIOISOTOPOS .......................................................... 99
8.1 Intiouuccion a la ieaccion ue iauioinmunoensayo ............................................................................................................ 1u1
8.2 Tipos ue iauioinmunoensayos (RIA) ....................................................................................................................................... 1u2
8.S. Lectuia ue los iesultauos ............................................................................................................................................................. 1uS

CAPITULO IX
TCNICAS BASADAS EN LA REACCIN ENZIMTICA ................................................................................................ 107
9.1 Intiouuccion a la ieaccion ue enzimoinmunoanlisis ...................................................................................................... 1u9
9.2 Tipos ue enzimoinmunoanlisis (EIA) ..................................................................................................................................... 1u9
9.S Nuestias y ieactivos necesaiios ................................................................................................................................................. 114
9.4 Cuantificacion ue anticueipos y antigenos meuiante ELISA .......................................................................................... 11S
9.S. Piincipales tcnicas ue enzimoinmunoanlisis ................................................................................................................ 12u

CAPITULO X
TCNICAS BASADAS EN LA REACCIN DE INMUNOTRANSFERENCIA ................................................................ 121
1u.1 Intiouuccion a la ieaccion ue inmunotiansfeiencia ....................................................................................................... 12S
1u.2 Inmunoelectiotiansfeiencia (Westein blotting).............................................................................................................. 12S

CAPITULO XI
TCNICAS BASADAS EN LA REACCIN DE CROMATROGRAFA DE AFINIDAD ................................................ 131
11.1 Intiouuccion a la ieaccion ue ciomatogiafia ue afiniuau ............................................................................................. 1SS
11.2 Acople ue pioteinas a Sephaiose activaua con CNBi ..................................................................................................... 1SS

CUESTIONARIO .................................................................................................................................................................... 139

UNIDAD DIDCTICA I
PRESENTACIN Y METODOLOGA DEL CURSO

Serologa de la reaccin antgeno-anticuerpo
7

Presentacin, normas y procedimientos de trabajo.
Introduccin
Antes de comenzar el Curso, es interesante conocer su estructura y el mtodo que se ha de seguir. Este es
el sentido de la presente introduccin.
Si usted no conoce la tcnica empleada en los Cursos a Distancia, le recomendamos que lea atentamente
los epgrafes siguientes, los cuales le ayudarn a realizar el Curso en las mejores condiciones. En caso contrario,
slo tiene que seguir los pasos que se indican en el siguiente ndice:
Presentacin
1. Sistema de Cursos a Distancia
En este apartado aprender una serie de aspectos generales sobre las tcnicas de formacin que se van a
seguir para el estudio.
2. Orientaciones para el estudio.
Se dan una serie de recomendaciones generales para el estudio y las fases del proceso de aprendizaje
propuesto por el equipo docente.
3. Estructura del Curso
Mostramos cmo es el Curso, las Unidades Temticas de las que se compone, el sistema de evaluacin y
cmo enfrentarse al tipo test.

1.1 SISTEMA DE CURSOS A DISTANCIA

1.1.1 RGIMEN DE ENSEANZA

La metodologa de Enseanza a Distancia, por su estructura y concepcin, ofrece un mbito de
aprendizaje donde pueden acceder, de forma flexible en cuanto a ritmo individual de dedicacin, estudio y
aprendizaje, a los conocimientos que profesional y personalmente le interesen. Tiene la ventaja de estar diseada
para adaptarse a las disponibilidades de tiempo y/o situacin geogrfica de cada alumno. Adems, es
participativa y centrada en el desarrollo individual y orientado a la solucin de problemas clnicos.

La Formacin a Distancia facilita el acceso a la enseanza a todos los Tcnicos Especialistas/Superiores
Sanitarios.
1.1.2 CARACTERSTICAS DEL CURSO Y DEL ALUMNADO AL QUE VA DIRIGIDO
Todo Curso que pretenda ser eficaz, efectivo y eficiente en alcanzar sus objetivos, debe adaptarse a los
conocimientos previos de las personas que lo estudiarn (lo que saben y lo que an no han aprendido). Por tanto,
la dificultad de los temas presentados se ajustar a sus intereses y capacidades.

Un buen Curso producir resultados deficientes si lo estudian personas muy diferentes de las inicialmente
previstas.
Los Cursos se disean ajustndose a las caractersticas del alumno al que se dirige.
Tcnico Superior Sanitario de Laboratorio de Diagnstico Clnico
8

1.1.3 ORIENTACIN DE LOS TUTORES
Para cada Curso habr, al menos, un tutor al que los alumnos podrn dirigir todas sus consultas y plantear
las dificultades.
Las tutoras estn pensadas partiendo de la base de que el aprendizaje que se realiza en esta formacin es
totalmente individual y personalizado.
El tutor responder en un plazo mnimo las dudas planteadas a travs de correo electrnico
exclusivamente.
Diferenciamos para nuestros Cursos dos tipos de tutores:
Acadmicos. Sern aquellos que resuelvan las dudas del contenido del Curso, planteamientos sobre
cuestiones test y casos clnicos. El tutor resuelve las dudas que se plantean por correo electrnico.
Orientadores y de apoyo metodolgico. Su labor se centrar fundamentalmente en cuestiones de
carcter psicopedaggicas, ayudando al alumno en horarios, mtodos de trabajo o cuestiones ms
particulares que puedan alterar el desarrollo normal del Curso. El tutor resuelve las dudas que se
plantean por correo electrnico.

1.2 ORIENTACIONES PARA EL ESTUDIO
Los resultados que un estudiante obtiene no estn exclusivamente en funcin de las aptitudes que posee
y del inters que pone en prctica, sino tambin de las tcnicas de estudio que utiliza. Aunque resulta difcil
establecer unas normas que sean aplicables de forma general, es ms conveniente que cada alumno se marque
su propio mtodo de trabajo, les recomendamos las siguientes que pueden ser de mayor aprovechamiento.
Por tanto, an dando por supuestas la vocacin y preparacin de los alumnos y respetando su propia
iniciativa y forma de plantear el estudio, parece conveniente exponer algunos patrones con los que se podr guiar
ms fcilmente el desarrollo acadmico, aunque va a depender de la situacin particular de cada alumno y de los
conocimientos de la materia del Curso:
Decidir una estrategia de trabajo, un calendario de estudio y mantenerlo con regularidad. Es
recomendable tener al menos dos sesiones de trabajo por semana.
Elegir el horario ms favorable para cada alumno. Una sesin debe durar mnimo una hora y mximo
tres. Menos de una hora es poco, debido al tiempo que se necesita de preparacin, mientras que ms
de tres horas, incluidos los descansos, puede resultar demasiado y descendera el rendimiento.
Utilizar un sitio tranquilo a horas silenciosas, con iluminacin adecuada, espacio suficiente para
extender apuntes, etc.
Estudiar con atencin, sin distraerse. Nada de radio, televisin o msica de fondo. Tambin es muy
prctico subrayar los puntos ms interesantes a modo de resumen o esquema.
a) Fase receptiva.
Observar en primer lugar el esquema general del Curso.
Hacer una composicin de lo que se cree ms interesante o importante.
9

Leer atentamente todos los conceptos desarrollados. No pasar de uno a otro sin haberlo entendido.
Recordar que en los Cursos nunca se incluyen cuestiones no tiles.
Anotar las palabras o prrafos considerados ms relevantes empleando un lpiz o rotulador
transparente. No abusar de las anotaciones para que sean claras y significativas.
Esquematizar en la medida de lo posible sin mirar el texto el contenido de la Unidad.
Completar el esquema con el texto.
Estudiar ajustndose al horario, pero sin imbuirse prisas o impacientarse. Deben aclararse las ideas y
fijarse los conceptos.
Resumir los puntos considerados primordiales de cada tema.
Marcar los conceptos sobre los que se tengan dudas tras leerlos detenidamente. No insistir de
momento ms sobre ellos.
b) Fase reflexiva.
Reflexionar sobre los conocimientos adquiridos y sobre las dudas que hayan podido surgir, una vez
finalizado el estudio del texto. Pensar que siempre se puede acudir al tutor y a la bibliografa
recomendada y la utilizada en la elaboracin del tema que puede ser de gran ayuda.
Seguir paso a paso el desarrollo de los temas.
Anotar los puntos que no se comprenden.
Repasar los conceptos contenidos en el texto segn va siguiendo la solucin de los casos resueltos.
c) Fase creativa.
En esta fase se aplican los conocimientos adquiridos a la resolucin de pruebas de autoevaluacin y a los
casos concretos de su vivencia profesional.
Repasar despacio el enunciado y fijarse en lo que se pide antes de empezar a solucionarla.
Consultar la exposicin de conceptos del texto que hagan referencia a cada cuestin de la prueba.
Solucionar la prueba de cada Unidad Temtica utilizando el propio cuestionario del manual.

1.3 ESTRUCTURA DEL CURSO
1.3.1 CONTENIDOS DEL CURSO
Gua del alumno.
Temario del curso en PDF, con un cuestionario tipo test.
FORMULARIO, para devolver las respuestas al cuestionario.
ENCUESTA de satisfaccin del Curso.
1.3.2 LOS CURSOS
Los cursos se presentan en un archivo PDF cuidadosamente diseado en Unidades Didcticas.
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1.3.3 LAS UNIDADES TEMTICAS
Son unidades bsicas de estos Cursos a distancia. Contienen diferentes tipos de material educativo
distinto:
Texto propiamente dicho, dividido en temas.
Cuestionario tipo test.
Bibliografa utilizada y recomendada.
Los temas comienzan con un ndice con las materias contenidas en ellos. Contina con el texto propiamente
dicho, donde se desarrollan las cuestiones del programa. En la redaccin del mismo se evita todo aquello que no
sea de utilidad prctica.
El apartado de preguntas test sern con los que se trabajen, y con los que posteriormente se rellenar el
FORMULARIO de respuestas a remitir. Los ejercicios de tipo test se adjuntan al final del temario.
Cuando estn presentes los ejercicios de autoevaluacin, la realizacin de stos resulta muy til para el
alumno, ya que:
Tienen una funcin recapituladora, insistiendo en los conceptos y trminos bsicos del tema.
Hacen participar al alumno de una manera ms activa en el aprendizaje del tema.
Sirven para que el alumno valore el estado de su aprendizaje, al comprobar posteriormente el
resultado de las respuestas.
Son garanta de que ha estudiado el tema, cuando el alumno los ha superado positivamente. En caso
contrario se recomienda que lo estudie de nuevo.
Dentro de las unidades hay distintos epgrafes, que son conjuntos homogneos de conceptos que
guardan relacin entre s. El tamao y nmero de epgrafes depender de cada caso.
1.3.4 SISTEMA DE EVALUACIN
Cada Curso contiene una serie de pruebas de evaluacin a distancia que se encuentran al final del
temario. Deben ser realizadas por el alumno al finalizar el estudio del Curso, y enviada al tutor de la asignatura,
con un plazo mximo de entrega para que pueda quedar incluido en la edicin del Curso en la que se matricul y
siempre disponiendo de 15 das adicionales para su envo. Los tutores la corregirn y devolvern al alumno.
Si no se supera el cuestionario con un mnimo del 80% correcto, se tendr la posibilidad de recuperacin.
La elaboracin y posterior correccin de los test ha sido diseada por el personal docente seleccionado
para el Curso con la intencin de acercar el contenido de las preguntas al temario asimilado.
Es IMPRESCINDIBLE haber rellenado el FORMULARIO y envo de las respuestas para recibir el certificado o
Diploma de aptitud del Curso.
1.3.5 FECHAS
El plazo de entrega de las evaluaciones ser de un mes y medio a partir de la recepcin del material del
curso, una vez pasado este plazo conllevar una serie de gestiones administrativas que el alumno tendr que
abonar.
11

La entrega de los certificados del Curso estar en relacin con la fecha de entrega de las evaluaciones y
NUNCA antes de la fecha de finalizacin del Curso.
1.3.6 APRENDIENDO A ENFRENTARSE A PREGUNTAS TIPO TEST
La primera utilidad que se deriva de la resolucin de preguntas tipo test es aprender cmo enfrentarnos a las
mismas y evitar esa sensacin que algunos alumnos tienen de se me dan los exmenes tipo test.
Cuando se trata de preguntas con respuesta tipo verdadero / falso, la resolucin de las mismas est ms
dirigida y el planteamiento es ms especfico.
Las preguntas tipo test con varias posibles respuestas hacen referencia a conocimientos muy concretos y
exigen un mtodo de estudio diferente al que muchas personas han empleado hasta ahora.
Bsicamente todas las preguntas test tienen una caracterstica comn: exigen identificar una opcin que
se diferencia de las otras por uno o ms datos de los recogidos en el enunciado. Las dos palabras en cursiva son
expresin de dos hechos fundamentales con respecto a las preguntas tipo test:
Como se trata de identificar algo que va a encontrar escrito, no va a ser necesario memorizar
conocimientos hasta el punto de reproducir con exactitud lo que uno estudia. Por lo tanto, no debe
agobiarse cuando no consiga recordad de memoria una serie de datos que aprendi hace tiempo;
seguro que muchos de ellos los recordar al leerlos formando parte del enunciado o las opciones de
una pregunta de test.
El hecho de que haya que distinguir una opcin de otras se traduce en muchas ocasiones en que hay
que estudiar diferencias o similitudes. Habitualmente se les pide recordar un dato que se diferencia
de otros por ser el ms frecuente, el ms caracterstico, etc. Por lo tanto, este tipo de datos o
situaciones son los que hay que estudiar.
Debe tenerse siempre en cuenta que las preguntas test hay que leerlas de forma completa y fijndose en
determinadas palabras que puedan resultar clave para la resolucin de la pregunta.
La utilidad de las preguntas test es varia:
Acostumbrarse a percibir errores de conceptos.
Adaptarse a los exmenes de seleccin de personal.
Ser capaces de aprender sobre la marcha nuevos conceptos que pueden ser planteados en estas
preguntas, conceptos que se retienen con facilidad.
1.3.7 ENVO
Una vez estudiado el material docente, se contestar la encuesta de satisfaccin, la cual nos ayudar para
evaluar el Curso, corregir y mejorar posibles errores. Cuando haya cumplimentado la evaluacin, enve las
respuestas a la direccin indicada.

UNIDAD DIDCTICA II
INTRODUCCIN AL SISTEMA INMUNE

15

2.1 Introduccin

Inmunologa ciencia biolgica encargada del estudio de todos los mecanismos fisiolgicos de defensa
de la integridad biolgica del organismo o lo que es lo mismo del estudio de inmunidad. Dicho mecanismo
fisiolgico consiste en la identificacin de lo extrao al organismo y su propia destruccin. Esta ciencia tambin se
encarga del estudio de los factores inespecficos que ayudan a los anteriores a conseguir sus efectos finales que
sern destruccin e identificacin de lo extrao al organismo.

Inmunidad conjunto de mecanismos fisiolgicos de defensa que todos los seres vivos tienen frente a
agentes extraos, lo que le permite a estos reconocer sustancias extraas a sus propios organismos y
neutralizarlas o eliminarlas con o sin lesin para los tejidos. En el ser humano se adquiere al nacer y va
madurando y consolidndose durante los primeros aos de vida.
Tambin podemos definirla como el estado de resistencia que presenta un organismo frete a una
enfermedad infecciosa.

Inmunologa clnica ciencia que se encarga del estudio del sistema inmune.
Sistema inmune conjunto de clulas y factores solubles desarrollados por los seres vivos para
defenderse de todo lo que les es extrao, principalmente frente a infecciones por microorganismos patgenos
tales como virus y bacterias etc.

2.2 El sistema inmune

Los seres humanos al igual que el resto de los seres vivos disponemos de un mecanismo de defensa frente
a microorganismos y sustancias extraas al organismo (consideradas como patgenos), esto es lo que se conoce
como Sistema Inmune. Cuando una sustancia extraa entra en contacto con el organismo, este el sistema inmune
pone en marcha la respuesta inmune tambin conocida como el mecanismo mediante el cual el cuerpo se
defiende de patgenos, clulas tumorales sustancias toxicas.

2.2.1 El sistema inmune
El sistema Inmune est formado por rganos, tejidos y clulas del propio sistema. En los rganos del
sistema inmune es donde tiene lugar la formacin, maduracin y diferenciacin de las distintas clulas que lo
componen, las cuales son conocidas como leucocitos, que pueden ser de distintos tipos siendo los que se conocen
como linfocitos los ms abundantes y por tanto los de mayor importancia, que pueden ser a su vez de distintos
tipos. Por este motivo a los rganos encargados de la formacin de clulas se les conoce con el nombre de
rganos linfoides. A parte de los leucocitos el sistema inmune consta de otro tipo de clulas llamadas plaquetas.
El proceso de formacin de las clulas por parte de los rganos del sistema inmune ms conocidos como
rganos linfoides se denomina hematopoyesis. La hematopoyesis se define como aquel proceso que consiste en
la formacin y diferenciacin de clulas sanguneas a partir de la clula madre pluripotencial, tambin conocida
como stem cell. Estas clulas sanguneas son las mismas que las del sistema inmune solo que el sistema inmune
no presenta eritrocitos, clulas sanguneas ms abundantes en la sangre, encargadas de dar el color rojo
caracterstico a la misma por encontrarse dentro de estas clulas una sustancia llamada hemoglobina encargada
de dar ese color rojo caracterstico a la sangre.
Las clulas del sistema inmune se dividen en dos grandes grupos o lneas procedentes todas de la ya
citada clula madre, dichas lneas son:
Serie mieloide monocitos y macrfagos; neutrlos y polimorfo nucleares; eosinlos;
bsofilos y mstocitos (todos pertenecientes a los linfocitos); plaquetas, que son todas las
clulas del sistema inmune restantes que no son linfocitos.
Serie linfoide todos los pos de linfocitos T y B; linfocitos no T y no B donde tenemos los NK
(natural Killer) y las ADCC (clulas efectoras de citotoxicidad o dependientes de anticuerpos).
16

ESQUEMA CLULAS DEL SISTEMA INMUNE

Fig. 2.1. Clulas del sistema inmune
El tejido linfoide es aquel que est formado por los rganos linfoides tanto primarios como secundarios, que son los
dos grandes grupos en los que se dividen los rganos linfoides. Estos son:
rganos linfoides primarios mdula sea y timo que es el lugar donde se encuentra la formacin y
maduracin de las clulas del sistema inmune.
rganos linfoides secundarios ganglio linfco, bazo, diversas zonas del tejido digesvo adems del
sistema mononuclear fagoctico donde tiene lugar la respuesta inmune mediante interaccin con los
rganos, de las clulas inmunes, con las sustancias extraas al organismo que generalmente son
microorganismos antgenos.
Toda esta formacin de clulas del sistema inmune as como la respuesta de las mismas frente a lo extrao depende
de la edad y desarrollo fetal, constituido de la siguiente manera:
En las primeras semanas embrionarias en el saco vitelino.

Desde el tercero al sptimo mes de gestacin del embarazo estas sufren una migracin al hgado fetal en
primero y despus al bazo fetal.

En el sptimo mes se produce una disminucin de la hematopoyesis en el hgado y bazo fetal hasta su
desaparicin con el nacimiento, momento en el que va adquiriendo dicho papel la mdula sea hasta
convertirse en el rgano productor de clulas hematopoyticas fundamental de los seres vivos adultos.

17

DISTRIBUCIN DE LOS ORGANOS LINFOIDES POR TODO EL ORGANISMO

Fig. 2.2. rganos linfoides tanto primarios como secundarios

2.3 Antgenos
2.3.1. Concepto
Antgeno (Ag) es una sustancia extraa al organismo que puesta en contacto con un sistema
inmunocompetente maduro es capaz de provocar respuesta inmunitaria y reaccionar especficamente con los
productos desarrollados por dicha respuesta (humoral o celular), es decir es capaz de inducir una respuesta
inmune, pudiendo reaccionar con los anticuerpos formados por esta sustancia formando lo que se conoce como
complejo antgeno (Ag) anticuerpo (Ac) (Ag-Ac). Tambin conocido como inmungeno.
Los antgenos se caracterizan por:
Inmunogenicidad o poder inmunogeno es la capacidad que tiene una sustancia para provocar
respuesta inmunitaria. La sustancia dotada de esta capacidad se conoce con el nombre de
inmungeno.
Antigenicidad o especificidad antignica cualidad de unirse y reaccionar solo con el anticuerpo
(Ac) producido la clula sensibilizada. La sustancia dotada de esta propiedad se llama antgeno en
sentido estricto.
Lo inmungeno est dotado siempre de de antigenicidad, pero hay sustancias dotadas de especificidad
antignica que no son inmungenas.
18

2.3.2. Haptenos y alrgenos
Los haptenos son sustancias de bajo peso molecular por norma general, que son capaces de reaccionar
con un anticuerpo (Ac), pero no son capaces de desarrollar su produccin por si solos. Los haptenos no son
inmungenos pero si tienen especificidad antignica lo que quiere decir que estas sustancias si tienen la
capacidad de unirse y reaccionar con un solo anticuerpo pero no tienen la capacidad de provocar respuesta
inmunitaria.
Los alrgenos son ciertos antgenos (sustancias extraas al organismo) que inducen reacciones de
hipersensibilidad, es decir reacciones alrgicas y se comportan como inmungenos o como haptenos.
En esto podemos decir que los trminos inmungeno y antgenos son sinnimos.
Existen muchas sustancias inmungenas en la naturaleza que constituyen los antgenos naturales. Lo
mismo ocurre con algunas sustancias de origen sinttico que pueden comportarse como inmungenos.
2.3.3. Eptopes y determinantes antignicos
La antigenicidad de una sustancia no depende de toda la molcula del antgeno, sino de una pequea
zona de ella llamada eptope, grupo determinante determinante antignico que es simplemente una
conformacin molecular de la superficie del antgeno que es capaz de combinarse especficamente con una zona
complementaria existente en la molcula del anticuerpo producido denominado zona combinante (formando lo
que se conoce como llave-cerradura).
2.3.4. Inmunogenicidad
Las sustancias inmungenas solo se comportan como tales si penetran en un organismo capaz de
responder por tener un sistema inmunitario maduro.
2.3.5. Antigenicidad
Los anticuerpos slo reaccionan con el antgeno que estimulo su formacin o con antgenos muy
relacionados, parecidos.
Esta antigenicidad deriva de la existencia de los determinantes antignicos o epitopes que podrn unirse
a las zonas combinantes del anticuerpo que necesariamente deber ser complementario de aquellos.
2.3.5.1. Factores determinantes de antigenicidad
Nmero es muy raro que una molcula antignica posea un solo grupo determinante, lo ms
frecuente es que su nmero sea mltiple y se producirn, tantos anticuerpos especficos como grupos
determinantes tenga el antgeno de manera que a mayor nmero de eptopes mayor antigenicidad.
Valencia antignica es el nmero de molculas igual al de anticuerpos con los que puede
combinarse el antgeno, lo que es igual al nmero de grupos determinantes idnticos (eptopes), aunque no
siempre es as, pues la unin de un anticuerpo con su eptope correspondiente dificulta la unin del siguiente
eptope. A este fenmeno se le llama dificultad espacial inhibicin estrica.
Existes eptopes para las distintas clulas del sistema inmune, siendo debido a su frecuencia los ms
importantes los de los linfocitos T y B.

19

2.3.6. Clasificacin de los antgenos
Los antgenos se encuentran ampliamente distribuidos por la naturaleza. Los podemos encontrar
clasificados en dos grandes grupos fundamentales aunque existe otro tercer grupo.
2.3.6.1. Antgenos de clulas y tejidos
Se clasifican atendiendo a dos criterios:

Segn procedencia:

Xenoantigenos son antgenos que proceden de distinta especie animal.

Isoantigenos son tambin llamado aloantigenos y son aquellos antgenos que proceden de
misma especie animal pero distinta constitucin gentica.

Autoantigenos molculas propias del organismo reconocidas como extraas por el propio sistema
inmune.

Segn especificidad:
Antgenos heterogenticos sustancias antignicas presentes en organismos de especie no relacionadas
entre s, es decir sustancias distintas relacionadas entre s por un hapteno comn.

Antgenos especficos de especie antgenos reconocidos en todos los individuos de una misma especie
animal.

Antgenos especficos de rganos o tejidos dentro de un mismo organismo las protenas que forman
un rgano o tejido son distintas del resto de rganos o tejidos de dicho organismo (cual sea).

Fig. 2.3. Clasificacin de antgenos segn estructura
20

2.3.6.2. Antgenos bacteriano
Antgenos constitutivos son aquellos antgenos que forman parte de la propia estructura de la
bacteria y son antgenos capsulares, flagelares y somticos o de la pared.

Antgenos secretores son los antgenos que se encuentran en los productos de secrecin de las
bacterias por lo que pueden ser antgenos de exotoxinas y antgenos de endotoxinas.
2.3.6.3. Antgenos virales
En l nos encontramos con las protenas de la cspside del virus, las subunidades de la envoltura cuando
existe y los cidos nuclicos asociados a nucleoprotenas tambin del virus.

2.4 Clulas del sistema inmune

Como ya se comento las clulas del sistema inmune se dividen en 2 grupos que son la serie mieloide,
compuestas por todas aquellas clulas del sistema inmune no pertenecientes a linfocitos y la serie linfoide, la ms
importante formada por como su nombre indica los linfocitos.

De esta serie la linfoide, diremos que es una serie formada por linfocitos, clulas del sistema inmune con
papel fundamental en la respuesta inmune ya que permite el reconocimiento de antgenos y su destruccin.

Se producen en medula sea, llegando hasta los tejidos a travs de la circulacin sangunea y la linfa.

Con morfologa aproximada de entre 6-10 micras de dimetro, con ncleo de aspecto uniforme debido a
la presencia de una densa cromatina y citoplasma con escases de grnulos, lo que da un aspecto plido a dichas
clulas.

Existen tres tipos de poblaciones diferentes:

1. Linfocitos T
2. Linfocitos B
3. Linfocitos no T no B

Presenta los linfocitos una caracterstica fundamental que los distingue del resto de clulas
hematopoyticas, ya que la maduracin y diferenciacin de los distintos tipos de linfocitos no se produce de
manera simultnea, sino en dos etapas, una primera en donde se producen los cambios celulares que dan lugar a
la diferenciacin de clulas T y B y una segunda etapa de diferenciacin producida tras la estimulacin antignica
y que dar lugar a la formacin de clulas plasmticas a partir de linfocitos B o clulas T citotxicas/ supresoras o
auxiliares procedentes de los linfocitos T.

2.4.1 Linfocitos T

Los linfocitos T comienzan a formarse en la mdula sea, y terminan de madurar en el timo de ah su
nombre. Para reconocerlos una de las formas ms fiables es mediante la recurrencia a los antgenos de
diferenciacin leucocitaria, que son un conjunto de molculas presentes en la membrana plasmtica de dichas
clulas, segn estado de maduracin de las mismas y que confiere caractersticas fundamentales bien definidas.
Estas molcula se han estudiado en el empleo de anticuerpos monoclonales, las cuales reciben una nomenclatura
internacional llamada siglas de Cluster of Differenciation CD (grupo de diferenciacin con un numero). De estas
molculas las ms importantes en superficie de linfocitos T son CD3, CD4, CD8, estando solo las CD3 presente en
21

todos los linfocitos T. Las molculas CD4 y CD8 no estn presentes en todos los linfocitos T, lo que da lugar a la
formacin de dos subpoblaciones de este tipo de linfocitos tanto funcional como fenotpicamente diferentes.

Los linfocitos T que presentan molculas CD4 son los conocidos como linfocitos T Helper (auxiliares o
cooperadores), cuya funcin se encarga de inducir la interaccin de clulas T y B con macrfagos (otro tipo
clulas), tambin necesarias para inducir la proliferacin de linfocitos B as como la diferenciacin de clulas
plasmticas productoras de inmunoglobulinas (Ig). Tambin produce sustancias de naturaleza proteica que
permite la actuacin sobre algunas clulas del sistema inmune, llamado linfoquinas y un interfern que contiene
actividad antivrica.

Por otro lado los linfocitos T que presentan molculas CD8, se conocen como linfocitos T
supresores/citotxicos, cumpliendo la funcin de frenado de respuesta inmune, adems de lisar clulas diana e
inactivar clulas inductoras para suprimir la produccin de inmunoglobulinas por los linfocitos B.

El complejo molecular proteico comn en todos los linfocitos T, el CD3 tiene un papel meramente
estructural y funcional esencial, siendo responsable de la traduccin de la seal al interaccionar el receptor TCR
del linfocito T (otra molcula en superficie de dicho tipo de linfocitos, presente en todos los linfocitos T) para
activar as a los linfocitos T, dando funcin de reconocimiento de antgenos y de dirigir al antgeno cuando este se
encuentra asociado al complejo mayor de histocompatibilidad (MHC).

Existen otro tipo de molculas receptoras presentes en los linfocitos T, pero que son de menor
importancia que las anteriores.

2.4.2 Linfocitos B
Comienzan a formarse en el hgado fetal hacia las 8-9 semanas de gestacin, para desaparecer y aparecer
con posterioridad en mdula sea durante toda la vida.
En el transcurso de maduracin se suceden una serie de etapas, que llevan a estas clulas a dar lugar a la
produccin de los distintos tipos de inmunoglobulinas, cuando el linfocito B es capaz de agregar cualquier tipo de
inmunoglobulina en la superficie de la membrana celular se dice que el linfocito B a alcanzado la madurez para
poder contactar con los antgenos.
Una vez tiene lugar este proceso podemos encontrar dos tipos de linfocitos:
Linfocitos B de memoria, que no se dividen.
Linfocitos B efectores, clulas efectoras capaces de sintetizar anticuerpos, por lo tanto tiene
capacidad de divisin y no presentan memoria.

2.4.3 Linfocitos no T no B
Clulas que no presentan los marcadores de los linfocitos T y B.
Su estructura es granular y grande por presentar un gran citoplasma con grnulos electrodensos y ncleo
con cromatina menos densa que el resto de linfocitos. La mayora de ellos tienen en su superficie receptores para
el factor de complemento de las inmunoglobulinas G (IgG).
Son en su mayora conocidas como clulas NK (Natural Killer o agresoras naturales) encargadas de la lisis
(destruccin) de clulas tumorales, adems de actuar en clulas atacadas por virus y Clulas ADCC (efectoras de
citotoxicidad o dependientes de anticuerpos) que se encargan de la lisis de clulas a travs de la unin de
anticuerpos a clulas dianas.
22

2.5 Anticuerpos

2.5.1. Conceptos
Los anticuerpos (Ac) son glucoprotenas que se forman en el organismo como respuesta al contacto con
un antgeno (Ag) y que reacciona especficamente contra l, tambin se puede definir como una sustancia
producida por el organismo, de naturaleza proteica, inducida por otras sustancias con las que puede reaccionar
de forma especfica.
Debido al papel desempeado en el sistema inmunitario y a que, en la electroforesis, migran junto a otras
globulinas, tambin se les llama inmunoglobulinas (Ig), estas en la electroforesis tienen la capacidad de separarse
en la fraccin gamma y por ello tambin son las inmunoglobulinas conocidas con el nombre de
gammaglobulinas.
Las inmunoglobulinas no son ms que globulinas plasmticas que por su actividad de anticuerpos reciben
el nombre este, por lo tanto los trminos inmunoglobulinas (Igs) y anticuerpos (Ac) son sinnimos.
Las inmunoglobulinas son sintetizadas a partir de clulas plasmticas que proceden de la diferenciacin
de los linfocitos B.
Las inmunoglobulinas constituyen un grupo heterogneo de protenas que constituyen el 10% de las
protenas del plasma.
Estos anticuerpos, las inmunoglobulinas se encuentran: en plasma, lquidos extravasculares, secreciones
orgnicas y tambin en la superficie de la membrana de los linfocitos B, incluso en el interior del citoplasma de
dichas clulas.
En el ser humano existen varios tipos de inmunoglobulinas que se hacen llamar de la siguiente forma: A,
D, E, G y M las cuales se diferencian entre s por su s propiedades fsico-qumicas, antignicas y funciones
biolgicas, estos sern los tipos de inmunoglobulinas.
2.5.2. Caractersticas generales de las inmunoglobulinas (Igs)
Como ya se ha dicho anteriormente las inmunoglobulinas son glucoprotenas compuestas por protenas
en un 98% y el resto de hidratos de carbono, un 2%.
Cada molcula de inmunoglobulina est constituida por una unidad estructural bsica o monmero,
formada a su vez por cuatro cadenas polipeptdicas unidas entre s por puentes de disulfuro y otras uniones no
covalentes.
Las cadenas polipeptdicas formadas las podemos dividir y diferenciar en dos grupos que son:
Cadenas ligeras (L) estas son las dos cadenas ms pequeas de las cuatro existentes por
monmero, cuyo peso molecular aproximado es de 22000 g las cuales estn constituidas por la
unin de 214 aminocidos aproximadamente. Estos pueden ser de dos tipos que se diferencian
por la secuenciacin de los mismos y son la cadena kappa () y la cadena lambda ().

Estas cadenas son expresadas por genes que las codifican los cuales se encuentran en el cromosoma 2
para el caso de la cadena kappa () y en el cromosoma 22 para el caso de la cadena lambda () en cada uno de los
cuales se encuentran distintos diversos segmentos gnicos que codifican dichos genes.
23

En el ser humano se pueden dar una u otra cadena pero no ambas en una misma inmunoglobulina, de
esta forma se encuentran 65% de k y 35% de de las inmunoglobulinas. Esto quiere decir que en las cadenas
ligeras (L), las dos son k , pero no una de un tipo y la otra de otro.

Cadenas pesadas (H) estas son las dos cadenas ms grandes de las cuatro existentes por
monmero cuyo peso molecular es del orden de 50000-70000 g y 450 aminocidos, dicha
secuenciacin de aminocidos de esta la cadena pesada (H) es lo que determina que la
inmunoglobulinas sean de un tipo u otro as como las subclases dentro de cada tipo, esto es lo
que hace que haiga tantas clases de inmunoglobulinas (Igs) como clases de cadenas pesadas
existentes.

Cada tipo de cadena pesada (H) existente se designa con una letra minscula griega lo que corresponde a
la letra mayscula latina de la inmunoglobulina, estas cadenas pesadas son: cadenas alfa (A), delta (D), exiln
(E), gamma (G) y mu (M).

Adems todos estos tipos de cadenas pesadas H son expresados por una serie de genes que codifican
dichas cadenas, genes que se encuentran en el brazo corto del cromosoma 14 en el cul se encuentran los
distintos diversos segmentos gnicos que codifican dichos genes.

Tanto las cadenas ligeras (L) como las cadenas pesadas (H) al ser cadenas polipeptdicas poseen dos
extremos que son:

Extremo aminoterminal NH
3
.

Extremo carboxiterminal COOH.

Tambin el monmero de las inmunoglobulinas posee puentes intercatenarios que unen dos cadenas
polipeptdicas y puentes intracatenarios que unen fragmentos polipeptdicos de una cadena.

En toda cadena polipeptdica tanto ligera como pesada existen dos zonas que son:

Zona constante que corresponde con el extremo carboxi-terminal, conocido como C
H
y C
L
(constantes pesadas y ligeras).

Zona variable que se corresponde con el extremo amino-terminal, conocido como V
H
y V
L
(variables pesadas y ligeras).
La parte constante de las distintas cadenas pesadas H de cada inmunoglobulina (Igs) es diferente segn el
tipo de inmunoglobulina, dado que de la parte constante de las cadenas pesadas H de las inmunoglobulinas es de
lo que depende la existencia de una u otro tipo de inmunoglobulinas de los cinco existentes.

La parte variable de las inmunoglobulinas es la que une a las inmunoglobulinas con su antgeno
correspondiente.

Dentro de la zona o regin variable de las inmunoglobulinas (Igs) se encuentran las regiones
hipervariables, tanto de las cadenas ligeras L como de las cadenas pesadas H.

Estas las regiones variables constan de tres regiones en las que se concentra fundamentalmente la
variabilidad y que se denominan como ya se ha mencionado anteriormente regiones hipervariables, estas se
designan con las letras CDR de la siguiente forma: CDR1, CDR2, CDR3, adems de estas regiones existen otras
cuatro regiones con secuencias de aminocidos relativamente conservada denominada zona de entramado y que
se designa con la letra FR de la siguiente forma: FR1, FR2, FR3, FR4.

Con ello podramos decir que tanto la regin hipervariable como la de entramado dentro de la regin
variable se colocan de la siguiente forma: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-CDR4.
24

En los CDR se encuentran las zonas de la regin variable donde se determinan la forma del centro activo
que permite el reconocimiento y la unin con el antgeno, cada una de estas regiones que son tres y que ya han
sido mencionadas anteriormente estn compuestas por entre 17 y 20 aminocidos de forma que pequeas
variaciones en la secuencia de estos implica la existencia de distinto anticuerpo.

Estas cuatro cadenas se organizan entre s constituyendo una estructura en forma de i griega llamada
Regin Bisagra que es la zona de unin de las dos partes que conforman el monmero, es decir la unin de una
cadena ligera y una pesada con la otra cadena ligera y pesada, unidas quedando la estructura tpica de las
inmunoglobulinas que es en forma de Y.

Esta tpica molcula con estructura en forma de Y mediante una enzima proteoltica llamada papana,
hace que esta se rompa en tres partes:

Dos de ellos son idnticos y constan, cada uno, de una cadena ligera (llamada L) y la porcin
aminoterminal (N-terminal) de 1 cadena pesada (llamada H). Estos reciben el nombre de
fragmento Fab (fragmento capaz de combinarse con el Ag).

El tercero est constituido por las porciones carboxiterminales (C-terminales) de las cadenas
pesadas (aproximadamente la segunda mitad de las cadenas pesadas H) y se denomina
fragmento Fc (fragmento que puede obtenerse en forma cristalina), esta es la fraccin que no
est dotada de capacidad de unin con el antgeno.
La misma molcula, con misma estructura pero esta vez mediante otra enzima proteoltica llamada
pepsina, hace que esta molcula de inmunoglobulina (Igs) se rompa en los siguientes fragmentos:
Un fragmento F (ab)
2,
precipitante y que corresponde a dos fragmentos Fab unidos entre s por
conservacin de puentes de disulfuro entre ambas cadenas.

Varios fragmentos polipeptdicos correspondientes a la fragmentacin del fragmento Fc.

Todo esto se observa en la siguiente figura a modo de resumen.

UNIDAD EXTRUCTURAL BSICA DE LA IGS O MONMERO

Fig. 2.4. Estructura bsica de las inmunoglobulinas (monmero)
25

A parte de esta estructura bsica las inmunoglobulinas presentan molculas adicionales de glucoprotenas
las cuales se conocen como cadena J y pieza de cola o secrecin.

Estas molculas adicionales junto a la estructura bsica de las inmunoglobulinas, conocida como
monmero y a la unin de varios monmeros, formaran los distintos tipos de inmunoglobulinas conocidos, ya
mencionados, as como los distintas clases de inmunoglobulinas dentro de cada tipo dado que no todas las
inmunoglobulinas de cada tipo son estructuralmente iguales, lo que vendran a ser las subclases dentro de cada
tipo de inmunoglobulinas.
2.6 Respuesta inmune

La respuesta inmune puede ser de 2 tipos:

Respuesta humoral.
Respuesta celular.

2.6.1. Respuesta humoral
Depende de la interaccin antgeno-anticuerpo (Ag-Ac) protegiendo al organismo en la mayora de los
casos. Los anticuerpos tienen capacidad de renacimiento de antgeno siempre que tengan acceso a l en
cualquier forma o circunstancia, es decir tanto solubles como en superficie slida como pueden ser un
microorganismo o una clula entre otras sustancias.

Los anticuerpos activan sistemas muy eficaces de defensa frente a lo que le es extrao.

Aunque se llame humoral requiere clulas puesto que necesitan:

- Activacin de linfocitos B (tipos de clulas del sistema inmune) para que estos se transformen en clulas
plasmticas (tipo de clulas del sistema inmune) y puedan producir anticuerpos.

- La activacin de linfocitos T que han de producir factores solubles que activen los linfocitos B.

- Atraer y dirigir clulas fagocticas (clulas destructoras de sustancia de desechos) al lugar necesario
para que estas puedan actuar.

Por lo tanto y en base a lo comentado, para que se lleve acab la respuesta inmune humoral se necesitan
tanto la activacin de linfocitos B como la de los linfticos T, dado que sin esta activacin no se llevara a cabo la
respuesta inmune humoral.

2.6.2. Respuesta celular
Se inicia tras la activacin de los linfocitos T nicamente.
No intervienen ni anticuerpos ni linfocitos B sino nicamente linfocitos T.
Se desarrolla para hacer frente:
- A microorganismos en el interior de clulas fagocticas que escapen a mecanismos lticos tales
como: bacterias intracelulares, hongos y determinados parsitos.
- Microorganismos en el interior de clulas sin capacidad para destruirlas y que utilizan la maquinaria de
la propia clula para reproducirse (virus).
Dicha respuesta la celular da lugar a factores solubles que activan clulas fagocticas.

UNIDAD DIDCTICA III
LA REACCIN ANTGENO-ANTICUERPO

29

3.1. Concepto
La reaccin antgeno-anticuerpo (Ag-Ac) es aquella reaccin llevada a cabo cuando entra en contacto un
antgeno con un anticuerpo frente al que va dirigido. Tambin es conocida con el nombre de complejo inmune o
inmunocomplejo.

Esta unin entre el antgeno y el anticuerpo es reversible y su permanencia depende del grado de
adaptacin entre ambas molculas as como de la fuerza y estabilidad de los enlaces que las une (enlaces que
estudiares a continuacin).

3.2. Caractersticas generales de la reaccin antgeno-anticuerpo
3.2.1. Unin antgeno-anticuerpo
La unin entre un antgeno y un anticuerpo es llevada a cabo en la regin combinante de las
inmunoglobulinas (estudiada en captulos anteriores), localizada en la regin variable de la misma.

Pese a que la unin es llevada acab en la regin combinante, la otra parte de las inmunoglobulinas
llamada fraccin constante tambin interviene en dicha unin principalmente a travs de la regin conocida
como bisagra, lo que le proporciona a la molcula la flexibilidad adecuada para combinarse con eptopos
separados.

Las regiones hipervariables localizadas en las regiones variables de dichas inmunoglobulinas son las
regiones encargandas de contactar con el antgeno y el resto de las regiones variables tienen la capacidad de
mantener la integridad, unin con la regin combinante.

La unin antgeno-anticuerpo se lleva a cabo gracias a la formacin de enlaces covalentes entre eptopos
del antgeno cul sea y la zona combinante o paratopo de anticuerpo. Estos enlaces pueden:

Fuerza de atraccin electrocttica Son aquellas fuerzas que se deben a la atraccin existente entre
grupos inicos con cargas polares (opuestas) ubicados en los aminocidos de distintas protenas, como el caso de
los enlaces entre grupos ionizados (-NH
3
) y un grupo carboxilo ionizado (-COO
) de aminocidos situados en
diferentes protenas.

Estos son los enlaces ms intensos que intervienen en la unin antgeno-anticuerpo.

Puentes de hidrgeno Son aquellos enlaces que se forman entre los grupos polares hidroflicos (-OH, -
NH
2
, -COOH) de aminocidos.

Estos son los enlaces ms dbiles que actan en la unin antgeno-anticuerpo.

Fuerzas van der waals Dicha fuerza se deben a interacciones entre nubes electrostticas externas de
las molculas.

Son los enlaces ms dbiles que actan en la unin antgeno-anticuerpo.

Interaciones hidrofbicas Son aquellos enlaces basados en el hecho de que los grupos no polares
hidrfobos, (cadenas laterales de valina, leucina, fenilalanina, etc.) que tienden a asociarse en medio acuoso.

Constituyen tambin en gran medida a la fuerza total de la unin antgeno-anticuerpo.

Todas estas fuerzas combinadas producen una energa de unin comparable a los enlaces covalentes,
aunque sean no covalentes.

30

Estos enlaces no covalentes dependen de la distancia existente entre ellos por lo que necesitan que dicha
distancia sea prxima. Para que esto se lleve a cabo es necesario que eptopes y zona combinantes sean
complementarias, es decir encajen, con lo cual la suma de dichas uniones no covalentes harn esa unin mucho
ms fuerte.

En relacin a esto se puede decir que el complejo antgeno-anticuerpo se comporta como sistema de
equilibrio dando el siguiente resultado:
Ag-Ac (antgeno anticuerpo) Ag-Ac (antgeno-anticuerpo)
Los enlaces no covalentes producidos entre en antgeno y anticuerpo no presentan enlaces disociables
por lo que la combinacin es reversible, debido a esto es aplicable la ley de accin de masas con la que se
determina la constante de equilibrio o afinidad del antgeno por el anticuerpo en situacin de equilibrio.

3.2.2. Caractersticas de unin antgeno-anticuerpo
Las caractersticas de unin antgeno-anticuerpo se llevan a cabo debido a lo siguiente:

Afinidad esta es la fuerza de unin individual existente entre el eptope de un antgeno y la
zona combinante de un anticuerpo. Como ya se ha visto depende de la complementariedad entre
eptope y zona combinante, puesto que cuanto ms complementarias sean ms cercas estarn y
ms numerosas sern las fuerzas de interaccin intermolecular ya comentadas.

Avidez esta es la fuerza de unin de un anticuerpo multivalente a un antgeno multivalente (es
decir con ms de un lugar de unin). Por lo tanto dicho concepto depende la suma de las de las
afinidades individuales, por lo que se puede decir, que dicho concepto es la suma de varias
afinidades.
En esto en condiciones fisiolgicas, la avidez es ms relevante que la afinidad, debido a la presencia de
multivalencia en mayora de antgenos naturales.

Especificidad esto es lo que puede mostrar la reaccin antgeno-anticuerpo pero en un alto nivel. Esto
significa que los sitios combinantes de los anticuerpos dirigidos contra determinantes de un antgeno no
sern complementarios para determinantes de otro antgeno.

En esto, se puede decir que dicho trmino en un antisuero es el resultado de la interaccin de distintos
anticuerpos con diferentes partes de la molcula del antgeno, en donde los anticuerpos son capaces de
expresar una especificad exquisita y as ser capaces de distinguir pequeas diferencias en la estructura del
antgeno, en la carga, as como configuracin ptica y estrica.

Reactividad cruzada esto es lo que se lleva a cabo cuando dos antgenos distintos llamados A y B
comparten un mismo determinante antignico, o dos de similar configuracin, con lo que habr una
proporcin de anticuerpos de A que reaccionarn con B.

UNIDAD DIDCTICA IV
CONCEPTOS PREVIOS AL ESTUDIO DE LA REACCIN INMUNOLGICA

33

4.1 Introduccin
La mayora de las determinaciones inmunolgicas son mtodos y tcnicas que determinarn en suero
tanto antgenos como anticuerpos de manera indirecta, esto se lleva a cabo cuando no se puede determinar
microorganismos de forma directa. En estos casos se determinan de forma indirecta, determinando bien la
presencia del antgeno del microorganismo o bien la presencia de anticuerpos en forma de inmunoglobulinas
formadas en respuesta a esos antgenos.
Las distintas tcnicas utilizadas lo que harn es determinar el complejo de la reaccin antgeno-
anticuerpo.
Tambin existen otras determinaciones inmunolgicas que aunque pueden hacerse del suero, no solo se
hacen del suero y que no se basan en la determinacin de microorganismos mediante la determinacin de
antgenos o anticuerpos producidos por ellos, estas determinaciones se realizan adems de manera seriada
usando el suero de una muestra de sangre, con la propia sangre total, los hemates de la sangre en donde no
determinamos nada relacionado con un microorganismo sino el grupo sanguneo del propio hemate as como el
Rh del mismo.
Por todo previo al estudio de los mtodos serolgicos basados en la reaccin Ag-Ac, es necesario conocer
las diluciones, tanto directas como seriadas, dado que de las diluciones de las muestras con sus respectivos
reactivos, obtendremos la sustancia final que analizaremos por los distintos mtodos, que se irn viendo.
4.2 Diluciones
4.2.1. Introduccin
El concepto de dilucin puede definirse como la disminucin de la concentracin de una sustancia en una
solucin.

La preparacin de diluciones es una tarea cotidiana en el trabajo de laboratorio, fundamental en gran
variedad de tcnicas, por lo que la comprensin de sus aspectos bsicos y prcticos es de suma importancia.

En base a ello la dilucin puede ser:

Directa
Seriada

4.2.2. Tipos de diluciones
4.2.2.1. Diluciones directas
Estas son las diluciones realizadas en un solo paso, desde la
solucin original hasta la solucin final. En donde mezclaremos el soluto,
en estos casos la muestra a analizar, con el solvente, obteniendo un
volumen fina (VF), disminuyendo con ello la concentracin del soluto
tantas veces como cantidad de solvente mezclemos en relacin al soluto,
obteniendo lo que se conoce como factor de dilucin (FD).
Para entenderlo mejor lo explicaremos con 1 ejemplo. En este
ejemplo tomaremos para la dilucin 1ml de la solucin original con una
pipeta y lo verteremos con la misma en un tubo que contenga 9 ml de
solvente, o a la inversa, a un tubo de 1ml de soluto le aadiremos 9ml de
solvente, obteniendo un volumen final (VF) de 10ml, en donde 1ml ser
de soluto y 9 de disolvente, con lo que obtendremos un factor de dilucin
(FD) de 10, al disminuir la concentracin de soluto 10 veces. Fig.1.1. Ejemplo de dilucin directa
34

4.2.2.1. Diluciones seriadas
Esta se prepara igual que las diluciones directas, solo que de la que se obtiene se preparan un conjunto de
diluciones que cada una depender de la anterior, es decir de una sacamos otro y de esa otra, otra nueva ms
diluida y as sucesiva.

Fig. 1.2. Ejemplo dilucin seriada
En este caso, el de la fig. 1.2. diluimos 10 veces la solucin del tubo precedente, por lo que el factor de
dilucin (FD) es 10. Conociendo dicho FD podemos calcular cual es la dilucin de la sustancia original que hay en
cada tubo (concentracin relativa), por ello en el tubo 1 de la fig. 1.2. tendremos una dilucin 1/10, 1/100; 1/1000
en los sucesivos tubos.
En serologa se utiliza con frecuencia el proceso de dilucin seriada para realizar diversas pruebas de
rutina clnica y de investigacin. Pero antes de describir los detalles prcticos del montaje de las diluciones
seriadas, es necesario sealar unas de las caractersticas importantes, que las diferencia de las diluciones directa:
Las diluciones directas permiten obtener resultados cuantitativos.
Las diluciones seriadas solo permiten obtener resultados semi-cuantitativos.
Esto puede conllevar cierto grado de error o incertidumbre, dado que a mayor nmero de pasos en un
proceso, mayor incertidumbre acumulada, por ello en las diluciones seriadas, el error se propaga y se amplifica,
aumentando la incertidumbre en proporcin al nmero de pasos de dilucin.
Por esta causa la exactitud de las diluciones directas es superior a la obtenida con diluciones seriadas.
Pero las seriadas son ms utilizadas y frecuentes debido a que pueden abarcar un mbito muy amplio e
concentraciones (diluciones), utilizando mediciones sencillas y repetitivas.

4.3 Concepto de seroconversin. Consideraciones previas a la realizacin de
una prueba serolgica
La seroconversin es cuando al cabo de 2 semanas en un individuo se cuadruplica o lo que sera lo mismo
se multiplica por 4 el nmero (titulo de anticuerpos) de anticuerpos.
En serologa cuando aplicamos una tcnica hay que tener en cuenta entre otros factores los siguientes
para ver la buena o mala evaluacin de una prueba serolgica. Dichos factores son:
Sensibilidad
Especificidad
valor predictivo
35

4.3.1 Sensibilidad
La sensibilidad, es porcentaje de verdaderos positivos que son detectados en individuos con una
determinada enfermedad.

En otros trminos la sensibilidad se define como la menor cantidad de anticuerpos detectables por un
antgeno. Lo deseable es que todo esto sea del 100% para la obtencin de excelentes resultados pero eso no
siempre ocurre as.

4.3.2 Especificidad
La especificidad se puede definir como el porcentaje de verdaderos positivos detectados por un individuo
sano sin ninguna enfermedad.
Esto quiere decir que el porcentaje de verdaderos positivos en individuos sanos tiene que dar negativo.
Tambin podemos definir la especificidad como la capacidad de un anticuerpo de unirse a un
determinado antgeno el cul provoco su formacin y no a otro distinto.
4.3.3 Valor predictivo

El valor predictivo es aquel valor que se calcula aplicando una tcnica, cul sea. en una poblacin sana y
la misma tcnica en otra enferma.

Esto vara en cada laboratorio y depende de la prevaleca de la enfermedad, dado por frmula
matemtica.

4.4 Titulo de anticuerpos
4.4.1 Introduccin

Podemos decir que el titulo de anticuerpos es la inversa de la ltima dilucin que da una reaccin como
positiva. En el caso del ttulo de anticuerpos esta dilucin ultima que da como positiva se expresa en cantidad de
anticuerpos aunque hay otras formas de expresar el titulo tales como la expresin en unidades internacionales,
arbitrarias, en estas, lo que se hace es comparar una muestra problema con el de un patrn calibrado
anteriormente.

4.4.2. Pruebas serolgicas de titulacin de anticuerpos

Muchas pruebas serolgicas consisten en estimar, de modo semicuantitativo, la cantidad relativa de
anticuerpos sricos contra un determinado antgeno, en un individuo. Para esto se realiza una serie de diluciones
de su suero (u otro tipo de muestras) con un solvente apropiado para la prueba, luego se enfrenta cada dilucin
contra el antgeno de inters, mediante algn tipo de reaccin inmunolgica.
36

Fig. 1.3. Ejemplo de prueba serolgica de titulacin de anticuerpos
En el caso de la fig. 1.3. podemos observar como el suero 2 posee mayor cantidad de anticuerpos contra
el antgeno que se prob, en relacin al suero 1, ya que aun diluyndolo al 1/128 fue capaz de dar una reaccin
positiva, mientras que el suero 1 alcanz a dar positivo hasta una dilucin mxima de 1/16. Los resultados
obtenidos se pueden expresar con el termino titulo de una muestra, que se define como el inverso de la mxima
dilucin que da una reaccin francamente positiva en una prueba determinada. En el caso de la fig. 1.3. diremos
que el titulo del suero 1 es de 16 mientras el del suero 2 es de 128, expresando en forma 1/16 1:16, de 16
diluciones, etc. Teniendo todas estas maneras de expresin el mismo significado, anotando el suero 3 como 1/8,
dado que es la dilucin mayor francamente positiva (dado que la 1/16 fue dudosa).
Aunque en los ejemplos anteriores descritos se estim la cantidad de anticuerpos contra un antgeno
dado, los mismos principios podran ser aplicables a situaciones inversas, es decir la estimacin semicuantitativa
de un antgeno en las muestras, utilizando sus respectivos anticuerpos.
4.4.3 Preparacin de diluciones seriadas
La primera decisin al disear una dilucin seriada es cul va a ser el volumen final (VF) que queremos
que quede en los tubos. Para algunas pruebas, que veremos ms adelante es conveniente que el VF sea el
volumen requerido para la tcnica a realizar. De esta forma una vez terminadas las diluciones, podemos adicionar
los reactivos necesarios a cada tubo (u hoyo) y ahorrar tiempo y material. En otros casos, por el contrario, se
necesita que el volumen final sea ligeramente superior al requerido en la tcnica.
Una vez determinado el VF, se adiciona a cada tubo de la serie un volumen de solvente igual la VF
deseado. El volumen de transferencia (VT) es el volumen de solucin original (muestra) que agregamos al primer
tubo, y que seguimos transvasando a cada tubo hasta completar la serie. El VT se puede calcular con la siguiente
frmala:
IF(F 1)VT =

37

Para el montaje de la disolucin seriada en base a todo esto anterior:
1. Preparar y rotular los tubos necesarios.
2. Adicionar a cada tubo un volumen de solvente igual al VF.
3. Calcular el VT.
4. Transferir el VT de la muestra al primer tubo.
5. Homogeneizar.
6. Transferir el VT del primer tubo diluido al segundo.
7. Homogeneizar.
8. Continuar transvasando y homogeneizando hasta el final.
Ejemplo: Cmo preparar una serie de diluciones (5 tubos) para una prueba de aglutinacin que utiliza
0,4ml de muestra y 0,1ml de antgeno, con FD=3 y utilizando NaCl 0,15 M como solvente?
En primer lugar, paramos los 5 tubos que usa dicha tcnica, los rotulamos y colocamos en cada uno un
volumen de solvente igual a VF que deseamos obtener, o sea 0,4ml. luego calculamos el VT:
VT =
vP
P-1
=
0,4 mI
3-1
=0,2ml
Esto nos indica que debemos transvasar en cada paso un volumen de 0,2ml. Al llegar al ltimo tubo de la
serie descartamos 0,2ml (el VT), para as obtener el mismo VF en todos los tubos. Algunas veces, principalmente
cuando se sospecha que un suero posee un ttulo muy alto para la prueba que estamos realizando, este sobrante
del ltimo tubo se conserva aparte, con el fin de seguir diluyndolo en el caso de que todas las diluciones
preparadas den positiva la prueba.
4.4.4. Principales cuidados en las diluciones seriadas
La homogenizacin minuciosa de cada tubo, despus de pipetear, es un cuidado fundamental para la
correcta preparacin de una serie de diluciones., Para esto mezclamos bien el liquido agregado y el solvente,
utilizando la misma pipeta con que vamos trasvasando, mediante su llenado y vaciado por un mnimo de 5 veces.
Dado que la pipeta se est utilizando simultneamente para la medicin y homogenizacin, es posible utilizar una
misma pipeta o puntilla desechable en todo el proceso, para una misma serie. Los agitadores mecnicos para
tubos sustituyen eficazmente la homogeneizacin por pipeteo repetido, agilizando el trabajo.
El uso correcto de las pipetas es fundamental para la obtencin de resultados confiables. Las pipetas
automticas agilizan el trabajo de diluciones, y es importante tener claros los detalles de su manejo antes de su
empleo. Asimismo, es importante mantener su calibracin peridicamente.
Al realizar diluciones seriadas con todos los cuidados y recomendaciones, se logra una precisin de 1
tubo, por las mismas razones que explican la semicuantitatividad del mtodo. Este es el nivel de incertidumbre
aceptado en las titulaciones. Ello implica, por ejemplo una diferencia de solo un tubo (un paso de dilucin) entre
dos muestras, no es significativa. Este concepto tiene relevancia en el trabajo clnico, en especial cuando se
realiza la titulacin serolgica de dos muestras de un suero de un mismo paciente, tomadas con 10-15 das de
diferencia, con el fin de determinar si en ese lapso a ocurrido una elevacin significativa del nivel de anticuerpos
contra un antgeno dado (ej. un agente infeccioso). Este es el concepto de seroconversin descrito anteriormente.
Cuando el aumento que se observa en el titulo es de al menos 2 pasos de dilucin, se puede tener certeza de que
ha ocurrido una seroconversin. Un aumento de solo 1 paso quedara en la zona de incertidumbre.
Finalmente, debe recalcarse que los procedimientos incorrectos o poco cuidadosos durante la
preparacin de diluciones seriadas, invalidan cualquier resultado obtenido por este mtodo, y con ello, la
confiabilidad de las pruebas.
38

4.5 El mtodo serolgico

En los mtodos o tcnicas serolgicas se van a ver dos tipos de mtodos que son:
Cualitativos
Cuantitativos

4.5.1 Mtodos cualitativos
En estos casos, lo que se va a hacer es buscar la concentracin o cantidad de anticuerpos, cantidad que se
puede expresar de varias formas de las cuales la forma ms comn de expresin de los resultados positivos, es el
ttulo.

4.5.2 Mtodos cuantitativos
Estos mtodos tambin se van a hacer mediante la cuantificacin del ttulo de anticuerpos el cul si da
positivo se hace el mtodo cualitativo mencionado anteriormente.

4.6 Objetivos en el estudio de la reaccin inmunolgica
El objetivo del estudio de la reaccin inmunolgica se fundamenta en la determinacin srica, en su
mayor parte, determinando bien la presencia de antgenos de una determinada enfermedad para ver si el
individuo, cual sea, presenta o no esa enfermedad o bien determinando la presencia de anticuerpos para ver si el
individuo, cul sea, ha padecido dicha enfermedad cul sea o al menos a estado en contacto con dicha
enfermedad y por lo tanto a producido anticuerpos contra dicha enfermedad.

4.7. Principales mtodos analticos basados en la reaccin antgeno-
anticuerpo

Existen diversos mtodos basados en distintos procedimientos para visualizar la unin antgeno-
anticuerpo (Ag-Ac), mediante pruebas serolgicas. Los principales mtodos que los veremos en sucesivos
captulos son:

Principales mtodos analticos basados en la unin Ag-Ac
Trazador Denominacin
Complejo Ag-Ac Tcnicas de inmunoprecipitacin
Aglutinado Tcnicas de inmunoaglutinacin
Fluorocromo Tcnicas inmunofluorimtricas
Radioistopos Tcnicas inmunorradiolgicas
Enzimas Tcnicas inmunoenzimaticas

As tenemos:
1. Tcnicas de aglutinacin cuando el antgeno se encuentra unido o formando parte de clulas,
bacterias o partculas, la reaccin Ag-Ac se puede detectar y cuantificar por el aglutinado celular o
bacteriano formado.
39

2. Tcnicas de fluorescencia y citometra de flujo para la realizacin de estas tcnicas el
anticuerpo se marca con un fluorocromo detectndose la formacin del complejo Ag-Ac por la
fluorescencia emitida.
3. Tcnicas de radioinmunoensayo en estas tcnicas al anticuerpo se une un istopo radiactivo
siendo posible la cuantificacin del complejo Ag-Ac a travs de la radiactividad emitida.
4. Cromatografa de afinidad la especificidad de la unin Ag-Ac puede utilizarse para obtener
anticuerpos y antgenos puros.

UNIDAD DIDCTICA V
TCNICAS BASADAS EN LA REACCIN DE AGLUTINACIN

43

5.1 Introduccin a la reaccin de aglutinacin
La reaccin de aglutinacin consiste en el agrupamiento de una suspensin de partculas debida a la
reaccin producida entre un antgeno presente en las partculas (aglutingeno) y un anticuerpo especfico de l
(aglutinina), formando un complejo antgeno-anticuerpo con un aglutingeno y una aglutinina, lo que da lugar a la
formacin del complejo aglutingeno-aglutinina, visto de manera macroscpica.
Las partculas pueden ser vitales o inertes. Entre las partculas vitales se suelen utilizar hemates y
bacterias, mientras que las partculas inertes pueden ser partculas de carbn vegetal, ltex, arcilla, gelatina, etc.
Si la partcula utilizada en la aglutinacin es un hemate, se dice que es una reaccin de hemaglutinacin.
El aglutingeno ha de estar presente en la partcula de una forma apreciable y situarse en la superficie.
Adems, debe poseer mltiples eptopos, como los ya comentados.
Las aglutininas pueden ser de dos tipos:
Las aglutininas completas, que son aquellas sustancias que siempre producen aglutinacin.
Estas son debidas a su tamao y a su multivalencia. Un ejemplo de aglutininas completas son
las inmunoglobulinas M.
Las aglutininas incompletas, son las que a pesar de reaccionar con el antgeno, no producen
aglutinacin cuando estn en una situacin desfavorable para ellas, estas son las
inmunoglobulinas G dado que estas son solo bivalentes, y no multivalentes como el caso
anterior.
Para que la reaccin de aglutinacin pueda darse de forma correcta es preciso que la concentracin de
aglutingeno no sea excesiva con respecto a la de aglutinina y viceversa. En caso contrario se verificar el
fenmeno de zona y se obtendrn resultados falsamente negativos.
En el fenmeno de zona se dan tres zonas que son las siguientes:
Zona 1 esta es la zona de la reaccin de aglutinacin que se conoce con el nombre de
prozona, en donde se produce un exceso de anticuerpos y por lo tanto la reaccin de
aglutinacin obtenida no es del todo correcta.
Zona 2 esta es la zona de la reaccin de aglutinacin conocida como zona de equilibrio, en
dado hay la misma cantidad de de aglutingeno que de aglutinina, es decir la misma cantidad
de antgenos que de anticuerpos y por lo tanto es donde se lleva a cabo la reaccin de
aglutinacin con mayor satisfaccin y resultado. Esto es lo que debe de ocurrir para que se
lleve a cabo una correcta reaccin de aglutinacin.
Zona 3 esta es la zona de la reaccin de aglutinacin conocida con el nombre de postzona,
en la cual lo que ocurre es que se produce un exceso de antgenos y por lo tanto la reaccin
de aglutinacin obtenida no es del todo correcta.
Con esto la zona 2 llamada zona de equilibrio es la zona idnea para que se lleve a cabo la reaccin de
aglutinacin por lo ya comentado antes.

44

Fig. 5.1. Representacin grfica del fenmeno zona

Otro factor que influye en la aglutinacin es la temperatura. Aunque la mayora de estas reacciones se
efectan correctamente a temperatura ambiente de 20C, los aglutingenos bacterianos suelen reaccionar mejor
con su aglutinina correspondiente a 37C, e incluso algunas aglutininas reaccionan de forma ptima con su
aglutingeno a 4C, estas son las llamadas aglutininas fras o crioaglutininas.

5.2 Tipos de aglutinacin
5.2.1 Introduccin
En base a lo descrito en el apartado anterior en una aglutinacin, los anticuerpos pueden estar dirigidos
contra componentes propios de las partculas, como eritrocitos, bacterias, otras clulas, etc. En este caso y en
base a ello clasificaremos las aglutinaciones en:
Directa o activa
Indirecta o pasiva
Inversa o reversa
Figa. 5.1. Representacin esquemtica de las
tcnicas de aglutinacin. A. Aglutinacin activa,
para la deteccin de anticuerpos; B. Aglutinacin
pasiva, para la deteccin de anticuerpos; C.
Aglutinacin inversa, reversa, para la deteccin de
antgeno.
5.2.2 Aglutinacin directa o activa
La aglutinacin directa o activa es aquella reaccin
en donde la aglutinina (anticuerpo especifico de un
antgeno presente en la suspensin de la agrupacin de
partculas) reacciona con un aglutingeno (antgeno
presente en la agrupacin de la suspensin de partculas)

Fig. 5.2. Aglutinacin directa
45

Puede ocurrir en este tipo de aglutinacin, la directa que la aglutinina sea un anticuerpo incompleto en
estos casos lo que se hace es facilitar la aglutinacin de la siguiente forma:
Forma 1 de facilitar la aglutinacin esta forma consiste en aumentar la viscosidad del
medio en el que se encuentran las clulas. Esto se consigue aadindole a este medio
sustancias tales como, la serolbumina bovina al 30%, el dextrano o la ficina.
Forma 2 de facilitar la aglutinacin esta forma consiste en la eliminacin de los residuos
negativos de cido silico de la membrana celular. Esto se alcanza exponiendo las clulas a la
accin de enzimas tales como la tripsina, la papana, la bromelina o la ficina.
Forma 3 de facilitar la aglutinacin esta forma consiste en la disminucin de la fuerza
inica del medio en donde circundan los hemates, haciendo que este contenga alguna
sustancia cuya solucin sea de baja fuerza inica, tal como el glicinato sdico en solucin
salina llamado liss.
5.2.3 Aglutinacin indirecta o pasiva
La aglutinacin indirecta o pasiva es aquella reaccin en la que la aglutinina reacciona con un
aglutingeno que se ha transferido pasivamente a la superficie de una partcula vital o inerte, en esto el antgeno
(aglutingeno) no ha reaccionado directamente con el anticuerpo especifico (aglutinina) para dicho antgeno, sino
que se ha unido previamente a una partcula provocando con ello una partcula sensibilizada aglutinina para
formar el complejo antgeno (en este caso unido a una partcula sensibilizada) anticuerpo.
En base a ello podemos decir que se denomina sensibilizacin al proceso mediante el cual una partcula
es recubierta con antgenos conocidos como aglutingenos, no propios de dicha partcula.
Si el antgeno conocido como aglutingeno en estas reacciones se transfiere a una superficie de una
partcula vital, no inerte, es decir clulas, estas pueden ser fijadas mediante sustancias tales como la formalina,
para su almacenamiento durante largo perodo de tiempo. Adems existen varios sistemas que facilitan la
sensibilizacin de las clulas tales como:
Forma 1 de facilitar la sensibilizacin para provocar aglutinacin (en partculas vitales)
en este caso lo que haremos es exponer las clulas a la accin de algunas sustancias, tales
como cido tnico, para facilitar la absorcin del antgeno aglutingeno cul sea a la
superficie celular.

Fig. 5.3. Aglutinacin indirecta
46

Forma 2 de facilitar la sensibilizacin para provocar aglucitancin (en partculas vitales)
en este caso lo que haremos ser emplear molculas bifuncionales (que realizan dos
funciones), tales como la bencidina binitrogenada, que primeramente se fija a la superficie
celular y seguidamente fija el antgeno aglutingeno mediante una unin covalente.

5.2.4 Aglutinacin inversa o reversa
La aglutinacin inversa o reversa es aquella reaccin en donde se produce aglutinacin inversa a las
partculas vitales (clulas) o inertes (tales como las partculas de ltex) por lo que no se les adhieren antgenos
aglutinogenos sino anticuerpos quedando en este caso una partcula inerte tal como la partcula de ltex
recubierta por anticuerpos como en el caso de la hepatitis B.

5.2.5 Inhibicin de la aglutinacin
Como ya se comentado en este captulo la reaccin de aglutinacin est basada en la presencia de una
partcula, bien viva o bien inerte, que absorbe en su superficie a la molcula antignica (que lleva antgenos)
conocida aglutingeno. De este modo solo se permite detectar a los antgenos presentes en una suspensin de
dichas partculas.
Esto es lo que ocurra de distinta manera en la reaccin de aglutinacin, mientras que en la reaccin
basada en la inhibicin de la aglutinacin lo que ocurra es que en esta se produce una modificacin de la
tcnica de la reaccin de aglutinacin ya citada, que se encarga de permitir detectar antgenos solubles, es decir
detectar aquellos antgenos que no van unidos a ninguna partcula de modo directo o indirecto (cono en caso de
reaccin de aglutinacin).
En base a ello podemos decir que reaccin de inhibicin de la aglutinacin consiste en una incubacin
previa del antgeno estudiado con su anticuerpo correspondiente quedando de esta manera cubiertos los sitios
de unin al anticuerpo. Seguidamente aadir el mismo antgeno pero en este caso sobre la superficie de una
partcula.
Si el anticuerpo est saturado con el antgeno soluble presente en la muestra, no se produce aglutinacin,
producindose en este caso la inhibicin de la aglutinacin.
Por otra parte, por el contrario, si el antgeno (Ag) soluble no est en concentracin suficiente como para
saturar todo el anticuerpo, quedan sitios de unin libres y se produce aglutinacin con el antgeno particulado.
Se puede cuantificar el antgeno soluble mediante la reaccin de soluciones seriadas del suero problema
y tambin mediante la valoracin del grado de inhibicin de la aglutinacin.
Estas la tcnicas basadas en la reaccin de aglutinacin ya comentada, precisan un cuidadoso control de
las concentraciones de anticuerpos para evitar un exceso que invalide los resultados obtenidos. En donde
debemos anotar que una aglutinacin positiva indica la ausencia de antgeno, mientras una aglutinacin negativa
indica la presencia de este en la muestra.
Entre las tcnicas basadas en la reaccin de aglutinacin tenemos el tests de embarazo, como unos de
los principales test basados en la inhibicin de la aglutinacin que se basa en la detencin, generalmente en orina,
de una hormona llamada Gonadotropina Corinica Humana (GCH o hCG) mediante una serie de procesos
determinados especficos y usando para ello una serie de reactivos especficos que contienen sustancias que
detectan la presencia de dicha hormona y con ello la presencia o ausencia de embarazo en dicha mujer.

47

Fig. 5.4. Inhibicin de la aglutinacin
Fig. 5.5. Inhibicin de la aglutinacin para gonadotropina corinica (hGC), test embarazo.

5.3 Formas para realizar y valorar una prueba de aglutinacin de forma
correcta

5.3.1 Realizacin de prueba de aglutinacin
La reaccin de aglutinacin puede llevarse a cabo sobre:
Portaobjetos de vidrio.
Superficie de tarjetas visualizadoras.
Placas de microtitulacin.
Tubos de ensayo (interior de los mismos).
Las tarjetas visualizadoras suelen ser de material de plstico con crculos coloreados impresos en ellas
cuyo color est directamente relacionado con el de las partculas empleadas, con lo que si la partcula es blanca el
color de dichos crculos sern negro y si la partcula es de color oscuro, el circula ser blanco.
48

Fig. 5.6. Aglutinacin en lmina utilizando ltex.
Las placas de microtitulacin tambin son de plstico como las tarjetas visualizadoras, las cuales constas
de una serie de pocillos cuyo fondo es cnico en forma de V o redondeado en forma de U. Estas placas son
utilizadas entre otras tcnicas para las tcnicas de hemoaglutinacin realizadas de forma automtica con aparatos
electrnicos mecanizados conectados a un programa informtico a travs del cual realizan las funciones para las
cuales dichos aparatos estn programados. Entre las tcnicas automatizadas de hemoaglutinacin que utilizan
este tipo de placas tenemos la de la determinacin de grupos sanguneos de forma automatizada.
Fig. 5.7. Patrones de hemaglutinacin en placas de fondo en U
En base a ello las tres principales tcnicas llevadas a cabo mediante aglutinacin son:
1. Acople de antgenos a eritrocitos.
2. Hemaglutinacin en tubo (titulacin de un suero anti-eritrocitos de carnero).
3. Microhemaglutinacin en placa (titulacin de un suero anti-eritrocitos de carnero).
5.3.1.1 Acople de antgenos a eritrocitos
Una serie de antgenos pueden ser acoplados a eritrocitos, para desarrollar tcnicas de aglutinacin. La
unin puede ser espontnea, por simple adsorcin. Alternativamente, se puede utilizar acople s con eritrocitos
modificados qumicamente. El siguiente procedimiento se utiliza para el acople de antgenos proteicos a
eritrocitos de carnero, utilizando el mtodo del cido tnico. Tambin existen otros mtodos que se basan en
bencidina bisdiazotizada, glutaraldehdo o cloruro de cromo.
Para dicha tcnica realizaremos los siguientes pasos:
1. Obtener eritrocitos de carnero y lavarlos 3 veces con PBS (solucin salina fisiolgica),
centrifugando durante 10 minutos a 300 revoluciones x sg. Ajustar la suspensin de
eritrocitos al 4% (v/v (volumen/volumen)) en PBS, pH 7,2.
2. Agregar 2,5mg de cido tnico a 50ml de PBS y mezclar suavemente con 50ml de eritrocitos al
4%. Incubar a 37C por 15 minutos.
49

3. Centrifugar a baja velocidad (20 minutos a 1000 revoluciones x sg.). Si utilizamos mayor fuerza
centrfuga, las clulas tienden a aglutinar.
4. Dividir las clulas en dos alcuotas (partes que tomamos de un volumen determinado)
iguales, lavar cada una con 50ml de PBS, por 20 minutos a 100 revoluciones por sg. Una se
recubrir con el antgeno y la otra servir como control.
5. Resuspende la alcuota a recubrir con antgeno, en 50ml de PBS, y agregar 50ml de una
solucin de antgeno a 2mg/ml (como concentracin inicial). Incubar durante 30 minutos a
37C.
6. Lavar con PBS (centrifugando a baja velocidad) y resuspender ambas alcuotas en 100ml de
amortiguador borato-succinato.
7. Agregar 10ml de formaledido al 40% tanto a las clulas con antgeno, como a las clulas
control, con agitacin constante. En esto la formalina debe agregarse gota a gota, durante
unos 20-30 minutos.
8. Dejar en reposo hasta el da siguiente a 4C. Luego agregar otros 10ml de formaldehido a
ambas preparaciones. Dejar sedimentar durante 24 horas y descartar el sobrenadante.
9. Agregar volmenes grandes de amortiguador borato-succinato y resuspender mediante
agitacin vigorosa. Dejar sedimentar durante 24 horas. Lavar de nuevo con borato-succinato,
por sedimentacin.
10. Ajustar ambas suspensiones al 1% (v/v) y agregar 0,2% de formaldehido (concentracin final)
como preservante. Las clulas pueden almacenarse a 4C durante 2 aos.
5.3.1.2 Hemaglutinacin en tubo (titulacin de un suero anti-eritrocitos de carnero)
Para la realizacin de la presente tcnica realizamos los siguientes pasos:
1. Obtener sangre del conejo inmunizados con los eritrocitos de carnero. Una sangra de 1ml,
tomada de la arteria central de la oreja es suficiente. Dejar coagular durante 20 minutos y
separar el suero mediante centrifugacin durante 5 minutos.
2. Inactivar el complemento del suero, calentndolo en bao a 56C durante 30 minutos.
3. Preparar una serie de diluciones dobles (es decir con FD=2) del suero con PBS, en tubos de
10x75 mm, con VF=0,2ml. Emplear 8 tubos, claramente rotulados.
4. Dejar un tubo de 0,2ml de salina como control negativo de la prueba (permite verificar que los
eritrocitos de carnero no muestren una autoaglutinacin espontnea).
5. Agregar 0,1ml de suspensin al 2% v/v de eritrocitos de carnero en PBS (previamente lavado 4
veces), a cada tubo, incluyendo la tubo control negativo (PBS). Incubar a temperatura ambiente
durante 3 minutos.
6. Centrifugar los tubos durante 30 sg. en centrifugas de velocidad fija para aglutinaciones
(recuerde balancear correctamente el rotor).
7. Sacar cuidadosamente los tubos y leer la prueba. La prueba se leer con el tubo en posicin casi
horizontal, cerca de una fuente de luz (aglutinoscopio), disgregando suavemente el botn de
eritrocitos, observando si el mismo genera agregados (aglutinacin), que pueden ir desde un
solo grumo con el total de clulas, hasta la formacin de un sedimento de aspecto arenoso fino.
Si no hay aglutinacin, el botn se suspende homogneamente, sin mostrar grumos de ningn
tipo. Comenzar por el tubo control negativo, y luego leer las distintas diluciones de la muestra
de suero. En caso de duda, si se desea repetir la lectura de un tubo, puede volverse a
centrifugar y resuspender.
8. Anotar cul fue la mxima dilucin positiva, o titulo de suero anti-eritrociticos de carnero.
50

Fig. 5.8. Lectura de aglutinacin de las tcnicas en tubo.
5.3.1.3 Microhemaglutinacin en placa (titulacin de un suero anti-eritrocitos de carnero)
1. Obtener sangre del conejo inmunizado con los eritrocitos de carnero. Una sangra de 1ml,
tomada de la arteria central de la oreja, es suficiente. Dejar coagular durante 20 minutos y
separar el suero por centrifugacin durante 5 minutos. Inactivar el complemento del suero,
calentndolo al bao mara. Inactivar el complemento del suero, calentndolo al bao mara
durante 30 minutos.
2. Colocar 100l el VF de PBS en una fila horizontal de hoyos de 1-12 hoyos de una placa de
microhemaglutinacin con fondo en U descrita anteriormente.
3. Colocar 100l de PBS en un hoyo que servir como un control negativo. Anotar la
localizacin de las muestras y controles de un diagrama para placas de 96 hoyos. La placa ni
se rotulara ni se rayara directamente, dado que pueden ser reutilizadas. Se puede usar una
cinta adhesiva para el fin.
Para la reutilizacin de la placa de microhemaglutinacin su lavado debe ser cuidadoso, ya que las trazas
de detergente o el deterioro de la superficie interna de los hoyos, pueden afectar significativamente los patrones
de sedimentacin de eritrocitos. Para no rayar la superficie interna de los hoyos durante el lavado, se puede
aplicar agua a presin, o introducir una torunda de algodn, girndola con suavidad.
4. Realizar la serie de diluciones agregando 100l de la muestra al primer hoyo. Mezclar 5
veces con la micropipeta y trasferir 100l al siguiente hoyo (usando para ello siempre la
misma puntilla). Al final de la serie, descartar 100l. Cambiar la puntilla de la pipeta para
cada muestra de suero, si se titulan varias muestras. Es importante evitar la formacin de
espuma durante el proceso, pues introduce errores en el pipeteo, y tambin porque
involucra desnaturalizacin de protenas.
5. Agregar 25l de una suspensin al 2% v/v de eritrocitos de carnero en PBS (previamente
lavados 4 veces) a cada hoyo, incluyendo al hoyo control negativo.
6. Dejar sedimentar las clulas durante 2 horas. La placa debe estar sobre una superficie
nivelada, lejos de vibraciones causadas por centrifugas u otros artefactos mecnicos.
7. Leer el resultado en cada hoyo, donde un botn pequeo en el fondo del hoyo indicara que
las clulas no se aglutinaron, mientras que un tapete fino que se extiende sobre un rea
apreciable del hoyo indica aglutinacin que se anota en el titulo del antisuero.

51

Fig. 5.9. Microhemaglutinacin en placa de 96 hoyos con fondo en U.
5.3.2 Valoracin de la aglutinacin
Las reacciones de aglutinacin presentan la ventaja de su alto grado de sensibilidad as como
de la gran cantidad de antgenos que se pueden detectar mediante estas pruebas, pero a su vez tienen
el inconveniente de con ellas ser difcil cuantificar, es decir determinar la concentracin de la sustancia
investigada en la muestra problema.
Por ello la mayora de las veces son simplemente cualitativas, es decir solo establecen
presencia o ausencia de sustancias buscadas en muestra problema.
Con todo esto una forma de dar una idea aproximada de la cantidad de sustancia problema que
hay en la muestra utilizada consiste en asignar ms o menos cruces +) a la aglutinacin, dependiendo
del nmero de agregados que aparecen y del tamao de los mismos.
En el caso de una hemoaglutinacin una manera de realizar la valoracin es la siguiente:
CARACTERISTICAS DE LOS
AGREGADOS.
ASPECTO DEL FONDO VALORACIN
Slo apreciable
microscpicamente
dudoso
Aspecto visible a simple vista
pero diminutos
rojizo Dbilmente positivo
Pequeo rojizo +
Mediano Claro ++
Escasos y gruesos claro +++
Un solo muy grueso transparente ++++
Otra forma ms exacta de realizar la valoracin, de forma aproximada, es buscar la concentracin de la
sustancia en la muestra problema que sea semi-cuantificada, esto consiste en preparar diluciones seriadas de una
muestra problema de forma que se disponga de una batera de diluciones en la que la sustancia investigada est
en concentraciones decrecientes, es decir que vallan de menor a mayor concentracin. Seguidamente se prctica
el ensayo de aglutinacin con cada una de las diluciones preparadas. De esta forma, aunque no de positivo con
las primeras diluciones (haya aglutinacin distinguible a simple vista), llegue un momento en el que la
concentracin de la sustancia problema en una disolucin sea lo suficientemente pequea como para que la
prueba se torne negativa y por lo tanto desaparezca la aglutinacin (no haya aglutinacin).
52

Con todo esto habr de hacer referencia tanto al trmino de titulo como al de sensibilidad. trminos ya
comentados y definidos en captulos anteriores.
Tambin habr que hacer referencia al trmino de Unidad Mnima Detectable (U.M.D.) o sensibilidad
mnima que es la cantidad mnima de sustancia problema que es capaz de detectar la prueba utilizada para hacer
la determinacin, cul sea, mediante tcnicas de reaccin de aglutinacin.
Con todo ello multiplicando el titulo citado en captulos anteriores por la UMD se calcula, de forma
aproximada, la concentracin de la sustancia investigada en la muestra problema conocida con el nombre de
Tasa, quedando la siguiente frmula:
Concentracin o Tasa = titulo UMD

UNIDAD DIDCTICA VI
TCNICAS BASADAS EN LA REACCIN DE PRECIPITACIN

55

6.1 Introduccin a la reaccin de precipitacin
La reaccin de precipitacin consiste en la formacin por un antgeno soluble de una red de precipitado
en dicha reaccin entre los complejos inmunes antgeno-anticuerpo (Ag-Ac). Dicha red de precipitacin se
produce cuando se igualan las cantidades entre el antgeno y el anticuerpo, es decir cuando se produce la
equivalencia entre el complejo antgeno-anticuerpo, estando el complejo antgeno-anticuerpo en cantidades
equivalentes, misma proporcin. Esta reaccin tambin se conoce con el nombre de inmunoprecipitacin (en
medios slidos en gel). Tanto la inmunoprecipitacin como la precipitacin se consideran sinnimos.

En esto se podemos decir que para llevar a cabo este tipo de reaccin, es decir, se produzca tanto el
antgeno como el anticuerpo, estos han de ser multivalentes, es decir, que mientras que el antgeno debe poseer
varios determinantes antignicos en torno a 4 5 (sitios de unin), aunque a veces es suficiente con que el
anticuerpo tenga al menos 2 sitios de unin, combinados con el antgeno.

Debido a esto a medida que los anticuerpos van unindose a los determinantes antignicos de las
distintas molculas de antgeno, van formndose complejos inmunes cada vez ms grandes, que acaban
volvindose insolubles con lo que acaban precipitando.

En la reaccin de precipitacin se da el fenmeno zona como ocurre en la aglutinacin comentada en el
anterior captulo, ocurriendo ms o menos lo mismo que en el captulo de la reaccin de aglutinacin pero en
este caso con la precipitacin, dndose tambin las tres mismas zonas explicadas antes en la que la zona 2 es la
zona intermedia en la grfica del fenmeno zona expuesto en el capitulo anterior, conocida como zona de
equilibrio zona donde se lleva a cabo la precipitacin dado que se igualan las concentraciones de antgenos con
las de anticuerpos.

Las otras dos zonas de la grfica llamadas zona 1 y 3 que se encuentran en la parte derecha e izquierda de
la grfica respectivamente no se produce la precipitacin dado que en la zona 1 llamada prozona se produce un
exceso de anticuerpos y en la zona 3 llamada postzona se produce un exceso de antgenos. Estas dos zona al no
tener la misma cantidad de anticuerpos que de antgenos no se produce en ninguna de estas la precipitacin dado
que para que se produzca la precipitacin se ha de dar como ya se ha comentado la misma cantidad de antgenos
que de anticuerpos para poder producir la red de precipitacin para llevar a cabo la reaccin precipitacin.

6.2 Tipos de reacciones de precipitacin
Las reacciones de precipitacin pueden producirse tanto en un medio lquido como en medios
semislidos.
6.2.1 Reaccin de precipitacin en medio lquido
En la reaccin de precipitacin en medio lquido se genera gran cantidad de precipitado cuyos
componentes estn unidos laxamente, recibiendo el nombre de reaccin de floculacin, que es la forma en que
se conoce a la reaccin de precipitacin en medio lquido.
Con ello, el complejo antgeno-anticuerpo que se forma va a reaccionar en los tubos o pocillos con lo cual
se va a producir un aumento de la turbidez que se va a determinar por nefelometra, que vernos ms adelante, la
cual se basa en medir la turbidez que no es ni ms ni menos que el choro de luz que se desva al 90%, dando dicha
tcnica resultados tanto cuantitativa como cualitativa.
Estas tcnicas las de medios slidos actualmente en los ltimos tiempos se puede decir que se estn
convirtiendo en tcnicas de precipitacin en desuso dado que las ms usadas actualmente son las llamadas
tcnicas de inmunodifusin o tcnicas en gel (tcnicas que son slidas o semi-slidas).
56

6.2.2 Reaccin de precipitacin en medio slido, gel o tcnica de inmunodifusin
6.2.2.1 Introduccin
La reaccin de inmunoprecipitacin ejecutada en medio semislido se conoce como reaccin de
precipitacin en geles o inmunodifusin, debido a que los medios semislidos, ms frecuentemente usados en
ellas, el gel de agar slido sin nutrientes (medio slido utilizado para trabajar con l pero en donde no existe
crecimiento bacteriano) y el de la agarosa (el agar se prepara a partir de algas marinas, y la azarosa es uno de los
polisacridos que componen el agar) son medios en donde van a difundir tanto el antgeno como el anticuerpo,
en proporciones optimas equivalentes , en donde aparecer una lnea de precipitado que va a quedar retenida en
dicho gel el cul se podr observar a simple vista.
Esta tcnica se puede hacer tanto en tubo como en placa y en ambos casos puede difundir uno de los
componente del sistema inmune o ambos, es decir puede difundir tanto el antgeno como el anticuerpo o ambos
a la vez.
En todo esto lo que ocurre es que uno de los componentes generalmente el suero se disuelve en un agar
fundido a 45C que se deja enfriar con lo cual encontraremos que el anticuerpo se encuentra en la misma
concentracin en todo el agar slido. A continuacin se le aade el antgeno conocido que ira difundiendo en el
agar, diluyndose en el hasta alcanzar la concentracin equivalente con el anticuerpo, momento en el que se
forma una banda de precipitacin, esta es la tcnica de OUDIN o tcnica de difusin simple, que hoy da est en
desuso siendo sustituida esta por la tcnica de difusin doble, es como la anterior lo nico que en vez de poner
en el tubo una capa de agar se ponen dos, en donde entre la primera y la segunda se pone la capa de anticuerpos
y en lo alto de la segunda capa una capa de antgenos.
Estas son las tcnicas de precipitacin de gel en tubos, las otras tcnicas de precipitacin en gel son las
tcnicas en placas que son similares a las de tubos pero en este caso utilizando placas.
6.2.2.2 Preparacin de geles de agarosa para las tcnicas de precipitacin en medio solido (gel)
Introduccin
Los geles de agarosa sirven como medio de soporte para la realizacin de una gran variedad de tcnicas
inmunolgicas, la doble inmunodifusin, la inmunodifusin radial y diversos tipos de inmunoelectroforesis.
La agarosa es un componente del agar, ya mencionado con anterioridad, una mezcla de polisacridos
extrada de distintos tipos de algas marinas. Adems de la agarosa el agar contiene agaropectina, componente
con propiedades inconvenientes para ciertas tcnicas. La agaropectina posee un alto contenido de productos
ionizables, que pueden interferir con la difusibilidad de algunas molculas en el agar, y que adems genera alta
electroendosmosis. Al eliminar la agaropectina del agar, queda la agarosa, formada por polisacridos lineales
neutros, compuestos por residuos de galactosa, que se alternan y forman redes de entramado. Estos pueden
estar sustituidos por sulfato, metoxilo, piruvato y carboxilo, los cuales determinan en gran parte las propiedades
fsicas del gel. El bajo contenido de grupos ionizados de agarosa reduce los problemas de interaccin con las
muestras, as como sus propiedades electrostticas. A la vez, la agarosa produce geles ms resistentes y
transparentes que el agar.
La mayora de los tipos de agarosa gelifican a temperatura cercanas a los 40C, para el trabajo con clulas
o enzimas muy lbiles, existen preparaciones especiales de agarosa de bajo punto de gelificacin que gelifican a
30C. La temperatura en esto de gelificacin se relaciona directamente con el contenido de grupos metoxilo en el
poliscarido.
Aunque los geles de agarosa pueden someterse a muchos ciclos de licuefaccin y gelificacin, estos deben
evitarse, debido a que durante cada calentamiento se hidroliza una pequea proporcin del polisacrido. Por ello
57

para obtener la agarosa en estado liquido es preferible colocarla en un bao de agua a -50C y no en ebullicin
prolongada. La hidrlisis de la agarosa puede ser importante en tcnicas cuantitativas de difusin, por dos
razones:
Vara la concentracin final real del gel.

Los fragmentos solubles aumentan la viscosidad de la fase fluida del gel.

Por lo anterior, en vez de fundir y gelificar varias veces una misma preparacin de agarosa, es aconsejable
almacenarla en alcuotas de un volumen apropiado para la tcnica a analizar, las cuales se funden al bao mara
para su uso. En la actualidad, tambin es comn la utilizacin del horno de microondas para este fin.

Al enfriarse las soluciones de agarosa forman un gel reticular, con poros de tamao heterogneo. El
dimetro promedio de los poros es inversamente proporcional a la concentracin del gel. La agarosa puede
gelificar a concentraciones tan bajas como 0.1% (p/v). Sin embargo, para logar una concentracin ptima, por lo
general se utiliza entre el 0,5 y el 1,5% de concentracin. Se estima que un gel al 1% forma poros cuyo lmite de
exclusin molecular para molculas esfricas es de 10-50x1u
6
daltons, como promedio.

Fig. 6.1. Gificacin de la agarosa
Cuidados en la preparacin de los geles
Los geles de agarosa se preparan disolviendo la cantidad requerida del slido, ya sea en agua o en un
amortiguador, aplicando calor directo, hasta lograr una ebullicin suave. Esto puede realizarse con un quemador
de gas, en una plantilla de calentamiento elctrica, o en horno microondas. La agarosa est completamente
disuelta cuando su aspecto es cristalino. Durante el calentamiento convencional, se debe agitar constantemente
para evitar que el slido sedimente y caramelice en el fondo. Los agitadores magnticos con calentador
incorporado son un aditamento muy convenientes para la preparar soluciones de agarosa.
Si el amortiguador requerido es termolbil, se puede preparar la agarosa en agua, al doble de la
concentracin deseada. Una vez disuelta, se enfra ligeramente, y se mezcla con un volumen igual de
amortiguador, tambin preparado al doble de la concentracin deseada. Los amortiguadores de boratos pueden
formar complejos con la agarosa, por lo que no se recomiendan como solvente.
Almacenamiento y cuidado en el empleo de los geles
Cuando se realiza rutinariamente un cierto nmero de pruebas de laboratorio que utilizan agarosa,
conviene preparar agarosa y almacenarlas en alcuotas. Para el almacenamiento, se puede agregar un agente
antimicrobiano como la azida de sodio (es un txico que adems puede reaccionar con los metales de las
tuberas, formando compuestos explosivos. Al descartar soluciones con azida, asegrese de hacer correr
suficiente agua por la tubera) (NoN
3
) al 0,02%, o el timerosal al 0,01% (siempre que no interfieran con la tcnica
58

en que se van a emplear los geles). Es importante usar recipientes hermticos para evitar la deshidratacin del gel
(sinresis). Como ejemplo podremos utilizar tubos de vidrio con tapa de rosca, los cuales pueden ser calentados
en bao mara para fundir la agarosa al momento que se requiera. Los geles se pueden almacenar muy bien en
refrigeracin, hasta por periodos de meses, si se previene la perdida de humedad.
Cuando se requiere fundir un gel previamente preparado y almacenado, se utiliza un bao mara en
ebullicin (recuerde aflojar la tapa del recipiente). Una vez en estado liquido, el gel es choreado sobre la placa de
trabajo, sobre una superficie nivelada, y dejado en reposo para gelifique como una capa de grosor homogneo.
Usualmente es posible utilizar los geles apenas unos minutos despus de la gelificacin. Sin embargo en
algunas tcnicas cuantitativas se recomienda dejar los geles a 4C por algunas horas, para que alcancen su
mxima estabilidad.
Recubrimiento de placas de vidrio con una capa base
Las placas o lminas de vidrio poseen poca adhesividad hacia los geles de agarosa. Por ello se recubren
primero con una placa de agarosa que, una vez deshidratada, forma una pelcula base, que prepara agarosa al
0,5% en agua destilada, se distribuye sobre la placa, se gelifica y se deja secar en una estufa o incubadora a 37-
60C. La adhesividad entre el vidrio y el gel de trabajo (chorreado posteriormente) no solo le da ms estabilidad
mecnica al medio, sino que acta como un sello que evita que la muestra depositada en los hoyos del gel se
desplacen entre el vidrio y el gel. Los materiales de plstico, tales como placas de petri, placas comerciales, etc.,
por lo general poseen una alta adhesividad hacia los geles de agarosa, por lo que no requieren de una capa base.

Fig. 6.2. Preparacin de un gel de agarosa sobre una lamina de vidrio
En la fig. 6.2. anterior, se pipetea el volumen requerido de solucin de agarosa caliente, y se esparce
rpidamente sobre toda la superficie de una placa de vidrio, con cuidado de que no rebase los bordes y sin
atrapar burbujas. La placa debe estar sobre una superficie ajustable y nivelada, como se observa en la imagen,
para asegurar que grosor final del gel sea uniforme. Una vez esparcida la solucin, se deja en reposo hasta que
gelifique.

59

Fig. 6.3. Esquema preparacin de la capa base en una lamina de vidrio para el trabajo con geles de
agarosa.
La electroendosmosis en geles de agarosa
La electroendosmosis (EEO) es un flujo de solvente hacia el ctodo (-), que ocurre cuando un gel de
agarosa se somete a un campo elctrico. Este fenmeno ocurre debido a que los grupos negativos ionizados del
gel, tales como sulfato y piruvato, se rodean de iones positivos que se asocian con molculas de aguay se
desplazan hacia el ctodo. Se deduce que la EEO ser mayor, cuanto ms alto sea el contenido de grupos
cargados del gel. Existen comercialmente agarosas de distintas EEO, la cual se determina midiendo la distancia
que recorre una molcula elctricamente neutra como la dextrn cuando el gel es sometido a un campo
elctrico. El valor de EEO se expresa como movilidad relativa (Mr) del dextrn, con respecto a la movilidad de la
albmina humana. Debido a que la albmina migra hacia el nodo (+), mientras que el dextrn es arrastrado
positivamente por la EEO hacia el ctodo, los valores se expresan con signo negativo, siendo los siguientes:
Agarosa de baja EEO: Mr:-0,02
Agarosa de mediana EEO: Mr:-0,13
Agarosa de alta EEO: Mr:-0,25
Dependiendo de la finalidad, la EEO puede ser ventajosa como un mecanismo que aumenta la
separacin entre las diversas sustancias durante una electroforesis (que vernos un poco ms adelante). Incluso se
ha aprovechado el fenmeno electroendosmtico en la tcnica de la contrainmunolectroforesis.
Preparacin de un gel para capa base
Para ello fundir la agarosa al 0,5% (p/v) en agua destilada. Chorrear la solucin caliente sobre las placas o
lminas de vidrio correspondientes, cubriendo cuidadosamente toda su superficie, sin atrapar burbujas. Una vez
ocurrida la gelificacin, colocar las placas en una estufa a temperada de entre 37-60C hasta que se sequen.
A continuacin pasaremos a dar los pasos para la preparacin de la agarosa de inmunodifusin y
electroforesis de protenas que veremos ms adelante.
Preparacin de agarosa para tcnicas de inmunodifusin
En la preparacin de la agarosa para la inmunodifusin se realizan los siguientes pasos:
1. Preparar solucin salina amortiguada con fosfatos (PBS) a pH 7,2. Disolver 10,3g de pH final y
llevar a 1000ml. Conservar en refrigeracin.
2. Fundir la agarosa al 1% (p/v) directamente en PBS. Agregar de inmediato azida de sodio al
0,02% y disolver. El gel caliente puede ser en esto vertido sobre las placas de trabajo, o
almacenarse en alcuotas en refrigeracin.

60

Preparacin de agarosa para tcnicas de electroforesis de protenas
En la preparacin de la agarosa para la electroforesis se realizan los siguientes pasos:
1. Preparar amortiguador de barbital a 0,04 M (moles), pH 8,6 al doble de concentracin,
disolviendo 9,0g de dietibarbiturato de sodio en aproximadamente 700ml de agua, agregando
posteriormente 65ml de HCl al 0,1 M y 0,2g de NoN
3
. Ajustar el pH final y llevar a 1000ml y
conservar en refrigeracin.
2. Fundir la agarosa al 2% (p/v) en agua destilada. Agregar de inmediato azida de sodio al 0,02%
y disolver. Antes de que gelifique, mezclarla con un volumen igual de amortiguador de
barbital de doble concentracin. El gel una vez caliente puede ser vertido sobre las placas de
trabajo, o almacenarse en alcuotas, en refrigeracin.
6.2.2.3 Doble inmunodifusin en gel
Introduccin
La doble inmunodifusin en gel, fue desarrollada por Erick y por Ouchterlony en 1949. Es una tcnica
inmunolgica de precipitacin simple y valiosa. En ella se enfrentan antgenos y anticuerpos en el gel de agarosa
(descrito antes), colocndolos en hoyos o pocillos circulantes adyacentes, para que difundan y formen lneas de
precipitacin entre ellos. Una de las propiedades ms valiosas de esta tcnica es la formacin que proporciona
respecto a las relaciones (similitudes o diferencias) inmunoquimicas entre los antgenos probados por
Ouchterlony y Nilsson ya en la segunda mitad de la dcada de los 80.
En ello, al colocar dos antgenos en hoyos adyacentes y enfrentarlos a un antisuero que los reconoce, se
pueden obtener tres patrones clsicos, que sern:
Identidad
Identidad parcial
No identidad
En el patrn de indentidad, la fusin o continuacin suave de la lnea de precipitado comn a ambos
antgenos, indica que estos poseen epitopos similares o comunes, y utilizan los mismo anticuerpos para
precipitar. Podran ser el mismo antgeno o dos antgenos muy similares, indistinguibles antignicamente.
En el caso del patrn de no identidad, que se produce por dos lneas de precipitacin que se cruzan
independientemente, indica que el antisuero posee anticuerpos para ambos antgenos, pero sin epitopos en
comn. Finalmente, la aparicin de un pequeo saliente o espuela en una lnea de precipitacin fusionada entre
dos antgenos (identidad parcial), indica que existen epitopos similares en ambos (la lnea fusionada), pero
adems, que uno de los antgenos presenta epitopos que o estn presentes en el otro y para los cuales el suero
posee los anticuerpos correspondientes.

Fig. 6.4. Patrones de relacin antignica en la doble inmunodifusin en gel. Los dos hoyos superiores contienen
antgenos (x, y o x), mientras el hoyo inferior contiene un suero inmune (S) con anticuerpos hacia ellos. As
tenemos: A. relacin de identidad; B. relacin de no identidad; C. relacin de identidad parcial.
61

Debe enfatizarse que toda la informacin obtenida en esta tcnica se restringe a aquellos epitopos para
los cuales se tienen anticuerpos, los cuales no necesariamente abarcan toda la estructura del antgeno. La
informacin obtenida se refiere estrictamente a la estructura antignica de las molculas. Toda la diferencia
observable entre dos molculas tiene una base estructural, pero no toda la diferencia estructural implica
diferencia antignica observable.
La informacin sobre las relaciones inmunoqumicas entre dos o ms antgenos se puede obtener
fcilmente por esta tcnica, sobre todo cuando se trabaja con antgenos purificados o con antisueros
monoespecificos. Sin embargo, cuando se utilizan sistemas antignicos complejos y antisueros poliespecificos
(preparados contra mezcla de antgenos), la aparicin de mltiples sistemas de precipitacin puede limitar y
dificultar la interpretacin de los resultados.
En la tcnica de doble inmunodifusin en gel operan todos los principios clsicos de la precipitacin entre
antgeno y anticuerpos, originalmente descritos por M.Heidelberger en sus trabajos sobre precipitacin
cuantitativa. Existe una proporcin ptima de reactivos para la precipitacin. En proporciones desbalanceadas, la
precipitacin se inhibe por que se forman complejos pequeos, que por su bajo peso molecular se mantienen
solubles. Estos son los fenmenos de zona, que operan en todos los sistemas que dependen de la formacin de
redes o agregados multimoleculares, incluyendo a las tcnicas de precipitacin y a las de aglutinacin descritas en
el capitulo anterior y con ella el del fenmeno zona.
Cuando se enfrentan antgenos y anticuerpos en una inmunodifusin, es importante seleccionar las
cantidades ptimas para logar un sistema balanceado, en donde las lneas de precipitacin se forman,
idealmente, en una regin equidistante a los hoyos abarcando una amplia zona hacia los lados, para poder
evidenciar las relaciones entre las muestras adyacentes.
Fig. 6.5. Ejemplo de doble inmunodifusin en gel e interpretacin
En la figura anterior, Fig. 6.5. tenemos que:
A. Se muestra con varios antgenos donde (M) es enfrentada a su respectivo antisuero (S). Se
obtienen tres lneas de precipitacin, lo que es indicativo de que el material contiene. Como
mnimo, tres antgenos reconocidos por este suero. Por otra lado la muestra (x) corresponde a
un componente aislado de la mezcla (M). La fusin de (x) con la lnea del centro identifica a esta
como la correspondiente a dicho componente. Aunque (x) solo form una lnea de precipitacin,
esto no se considera como un indicador formal de pureza de dicho material, debido a la baja
sensibilidad de dicha tcnica y otras limitaciones.
B. En esta se muestra una mezcla antignica (M) enfrentada a su antisuero (S), junto con una
fraccin que se ha aislado de ella (x, y). Dicha fraccin contiene al menos dos componentes,
antignicamente no relacionados entre s, dado que sus precipitados se cruzan sin fusionarse.
62

C. En esta muestra se tiene un sistema aparentemente bien balanceado entre dos antgenos y un
antisuero, pero no se puede deducir la relacin antignica entre ellos porque el precipitado no
se extiende hasta la regin de inters. Esto puede deberse a que las concentraciones de los
antgenos y el antisuero son bajas, o a que la distancia entre los hoyos de los antgenos es muy
grande. Las posibles soluciones son, por tanto, aumentar las concentraciones (o aumentar los
volmenes de la muestra en los hoyos), o disminuir la distancia entre los hoyos con los
antgenos.
D. En esta muestra, la ultima, se tiene un sistema desbalanceado o desproporcionado, en donde el
antgeno (a) est en muy baja concentracin con respecto a la cantidad de anticuerpos
presentes en (S), mientras el antgeno (b) est demasiado concentrado.
Aunque la doble imunodifusin en gel no es una tcnica cuantitativa, puede ser utilizada en pruebas de
titulacin, para estimar y comparar el contenido relativo de anticuerpos (o de antgenos) de la muestra. Por
ejemplo, podemos colocar diluciones dobles de un antisuero frente a una cantidad fija de antgeno, para
establecer cul es la mxima dilucin del suero que es capaz de precipitar (titulo). De manera inversa, se puede
enfrentar diluciones dobles de una muestra que contiene un antgeno, contra una cantidad fija de anticuerpos,
para establecer la mxima dilucin del antgeno capaz de precipitar.

Fig. 6.6. Titulacin. Uso de la doble inmunodifusin en gel para la estimacin semicuantitativa del
antgeno X (diagrama izquierdo) o antgeno anti-X (diagrama central), a travs de diluciones seriadas. La
foto a la derecha muestra la titulacin de un suero anti-albmina bovina (BSA) producido en conejos.
Procedimiento de la doble inmunodifusin en gel
1. Preparar agarosa al 1% (p/v) en PBS, explicados antes, y verter sobre placas de vidrio previamente
recubiertas con capa base, o en placas de Petri de plstico de 10cm de dimetro. Utilizar para ello
8ml de gel para cada vidrio de 5x7, 5cm, o 25ml de gel para cada placa de Petri.
2. Abrir hoyos para las muestras con un sacabocados, formando un patrn hexagonal con un hoyo
central. Los hoyos deben tener 4-5mm de dimetro, y una distancia de aproximadamente 5mm
entre sus bordes.
3. Llenar los hoyos con las muestras correspondientes (25-30l), teniendo cuidado de no rebasar su
capacidad.
4. Dejar difundir las placas en una cmara hmeda (una caja tapada, con un papel humedecido) a
temperatura ambiente, durante al menos 24 horas, sobre una superficie nivelada. Leer los
resultados.
5. Si se requiere, los resultados pueden fotografiarse frente a un fondo negro, con iluminacin
oblicua, para que los precipitados se observen de color blanco. Alternativamente, se puede lavar
el gel exhaustivamente con PBS, para eliminar protenas solubles, y luego teir los precipitados
con un colorante para protenas. Los colorantes incrementan la sensibilidad fsica de la tcnica,
evidenciando lneas de precipitacin tenues que podran pasar desapercibidas. Si se desea teir la
placa, lavarla sumergindola en abundante PBS (o PBS diluido 1/3-1/4 con agua), con agitacin
suave, por 24-48 horas, realizando varios cambios.
63

6. Sumergir la placa en el colorante por unos 15-30 minutos y posteriormente decolorar con varios
cambios de cido actico al 5%, dejando finalmente secar la agarosa sobre el vidrio. Esto resulta
en un registro permamente de los resultados, que se puede almacenar por aos, o puede
fotografiarse convencionalmente.
Colorante para protenas
1. Rojo Ponceau-S
1,0 g Ponceau-S; 37,5g cido tricloroactico; 37,5g cido sulfosaliclico; disolver en agua y llevar a 500ml.
Guardar a temperatura ambiente.
2. Negro de almidn 10 B
0,1g negro de almidn (amidoblack 10 B); 45ml de cido actico 12%; 45ml acetato de sodio 1,6%; 10ml
glicerol. Guardar a temperatura ambiente.
3. Azul Coomassie R-250
0,25g Coomassie blue R-250; 225ml metanol; 46ml de cido actico; 230ml agua; disolver el
colorante en el metanol, luego agregar el cido, y finalmente el agua. Mezclar durante 15 minutos,
filtrar y guardar a temperatura ambiente.
6.2.2.4 Inmunodifusin radial
Introduccin
La inmunodifusin radial es una tcnica cuantitativa, basada en la precipitacin en gel de un sistema
antgeno-anticuerpo monoespecfico. Para cuantificar un antgeno dado se incorpora en el gel una cierta cantidad
de los anticuerpos correspondientes, con lo que al aplicar una muestra en un hoyo y dejarla difundir libremente,
se forma un precipitado circular. De aqu se deriva el nombre de esta tcnica, ya que la difusin de la muestra y su
precipitacin ocurren de forma radial. El dimetro del crculo o anillo de precipitado guarda una proporcin con la
cantidad de antgeno en la muestra. De esta forma, se puede establecer una curva de referencia con cantidades
conocidas de antgeno (estndares o patrones de referencia) y as interpolar los valores de muestras
desconocidas.
Los requisitos del mtodo son:
1. El sistema antgeno-anticuerpo forme precipitados en gel.
2. El antisuero debe ser monoespecfico, es decir, reconozca un solo componente antignico en la
muestra.
3. El antgeno no exista en diferentes estados fsicos en cuanto al nmero de subunidades (ej.
monmero+dimero+trmero, etc.). Esto ltimo podra afectar a la velocidad de difusin de las
diversas formas del antgeno en gel y conducir a error.

64

Fig. 6.7. Inmunodifusin radial. Representacin de una placa para la cualificacin de antgenos en gel de
agarosa con contenido de anticuerpos anti-x
Esta tcnica tambin puede utilizarse para cuantificar anticuerpos contra el antgeno dado, incorporando
dicho antgeno en el gel. Sin embargo, esta aplicacin es menos comn. Entre los usos ms frecuentes de este
mtodo se encuentran la cuantificacin de inmunoglobulinas sricas (que en este caso actuaran como antgeno),
del algunos componentes del sistema complemento (C3, C4) y de algunas otras protenas plasmticas.
Existen dos variantes principales del mtodo de inmunodifusin radial que son:
Difusin completa donde la muestra que se manene en un periodo comprendido entre 48-72
horas, establece una relacin lineal entre la concentracin de antgeno y el cuadrado del dimetro
del precipitado.
Difusin parcial esta es la otra variante de la inmunodifusin radial donde la muestra se
mantiene en un periodo de tiempo en torno a 4-16 horas, establecindose una relacin lineal
entre el logaritmo de la concentracin del antgeno y el dimetro de precipitado, siente este ms
rpido pero de menor exactitud y precisin lo que el ms utilizado ser el anterior el de difusin
completa.
En la Fig. 7.2. que expondremos a continuacin se muestra un ejemplo de la aplicacin de inmunodifusin
radial para la cuantificacin de una inmunoglobulina srica, la IgG, empleando para ello placas comerciales. En
dicho caso el gel de agarosa contiene anticuerpos contra la cadena pesada de la inmunoglobulina humana, las
cuales precipitan al encontrarse con la IgG de los estndares, o de la muestras. Con los tres estndares de
concentracin conocida se traza una curva de referencia, para la interpolacin de las distintas muestras.
Fig. 6.8. Ejemplo curva de representacin difusin completa para cuantificacin de inmunoglobulina IgG mediante
inmunodifusin radial.
Para la mayora de aplicaciones clnicas de la inmunodifusin radial existen placas comercialmente
disponibles, listas para su uso. Sin embargo, esta tcnica puede aplicarse a situaciones muy variadas, de manera
sencilla y con un mnimo de recursos materiales, como se describe a continuacin.
65

Una tcnica cuantitativa que compite en la prctica clnica con la inmunodeficiencia radial es la
inmunonefelometra. Esta se basa en la medicin de la dispersin de la luz causada por la formacin de un
complejo insoluble antgeno-anticuerpo, al agregar un suero contra el antgeno de inters a la muestra a
determinar. Algunas de sus ventajas son:
Proveer resultados en minutos.
Automatizacin.
No conduce a error importante.
Su principal desventaja radica en las interferencias que pueden causar la turbidez de la muestra ya sea
por la presencia de complejos inmunes per-existentes o de agregados moleculares de origen no- inmunolgico.
Fig.6.9. Principio de inmunonefelometra, donde tenemos a la derecha el inmunonefelmetro.
Mtodo para la inmunodifusin radial
Par desarrollar una tcnica de inmunodifusin radial propia (no comercial) se requiere:
Agarosa
Un antisuero monoespecifico contra el antgeno de inters
Una solucin patrn de concentracin conocida del antgeno (para preparar la curva de
referencia).
Los principales patrones que deben estandarizarse y optimizarse son:
La concentracin de antisuero en el gel, la cual depender de la titulacin y avidez de los
anticuerpos; en general el antisuero se utiliza a una concentracin del 2-10% (v/v).
La cantidad de muestra generalmente 5-10l.
Es fundamental mantener constante el grosor del gel, as como los dos parmetros mencionados, para
obtener resultados cuantitativos que sean confiables y reproducibles.
66

Estas condiciones se deben ajustar con el fin de lograr anillos de precipitado con bordes ntidos,
fcilmente visibles, cuyos dimetros varen entre los 5-15mm. La aparicin de ms de un anillo de precipitacin
indica que el antisuero utilizado reconoce ms de un antgeno (no es monoespecifico), y por lo tanto, no sera
apropiado para esta tcnica.
Fig. 6.10. Inmunodifusin radial
Procedimiento
1. Fundir la agarosa al 1,5% (p/v) en PBS y enfriarla a menos de 60C, mantenindola en un bao
calibrado. Adicionar el volumen necesario de antisuero (seleccionado a partir de pruebas
preliminares) y mezclar. De inmediato, chorrear las placas, sobre una superficie nivelada. El
volumen del gel debe estandarizarse mediante pruebas preliminares del sistema, para que el
grosor sea constante.
2. Una vez gelificadas las placas, estabilizar el gel a 4C durante 60 minutos, en cmara hmeda.
Posteriormente abrir los hoyos para muestras, con un sacabocados de tamao predeterminado y
constante (ej. entre 2-3mm). Si se mantienen las placas en bolsas hermticas y con preservante
(ej. azida de sodio 0,02%) a 4C, se pueden conservar durante meses.
3. Al momento de utilizar las placas, cargar las muestras y los estndares en los hoyos, con una
micropiteta de precisin (ej. Hamilton Microsyringe de 10l), preferiblemente por duplicado. El
volumen de las muestras debe ser constante y estandarizado. Finalmente, dejar las placas en una
cmara hmeda a temperatura ambiente, sobre una superficie nivelada, por 48 horas (difusin
completa).
4. Medir los dimetros de los anillos de precipitado, preferiblemente con un visor de precisin,
graduado a divisiones de 0,1mm. La lectura se facilita utilizando una iluminacin indirecta del gel.
Los precipitados ovales, causados por desnivel o por mala tcnica manual en la colocacin de las
muestras induce a error.
5. Construir una curva de referencia para corrida de muestras, con al menos tres estndares de
concentracin conocida. Graficar en papel milimetrado el dimetro elevado al cuadrado (J
2
) en el
eje Y, contra la concentracin de los estndares del antgeno (ej., mg/dl) en el eje X. Trazar la lnea
de mejor ajuste entre los puntos (notar que no sale del origen, sino del valor que representa el
dimetro del hoyo vaco elevado al cuadrado). En condiciones ptimas, los puntos son
prcticamente colineales, por lo que las desviaciones usualmente sugieren una impresin
instrumental o manual.
6. Interpolar las incgnitas. Si una muestra proporciona un dimetro mucho mayor que el estndar
ms alto, debe diluirse y repetir la determinacin hasta que el valor sea interpolable (no es
correcto extrapolar la curva de referencia).
67

6.2.2.5 Inmunoelectroforesis
6.2.2.5.1. Conceptos previos al estudio de la inmunoelectroforesis
1. Purificacin de inmunoglobulinas
1.1. Introduccin
Los mtodos de precipitacin de protenas mediante uso de compuesto orgnicos tales como el rivanol y
el cido caprilino o de sales inorgnicas tales como el sulfato de amonio o sodio se han utilizado durante ms de
60 aos para fines de purificacin parcial. Sus principales ventajas son, sobre otras ms modernas:
Simplicidad
Bajo costo
Rapidez
Alto rendimiento final
En la precipitacin de protenas por sales inorgnicas (salting-out), en general si se produce un aumento
en la concentracin de iones en el solvente esto conduce a mayor interaccin protena-protena, y con ello
disminucin en su solubilidad. Cada protena precipita a una concentracin de sales, y esta diferencia es
aprovechada para logar su separacin, cuyos factores ms importantes son:
PH
Temperatura
Concentracin de protenas
En base a esto, para las inmunoglobulinas se utiliza:
PH 7,0-8,0
Temperatura optima de 4 a temperatura ambiente sobre 25C, para su ptima solubilidad.
Mayor concentracin salina para baja concentracin de protenas y viceversa.
Estos mtodos de precipitacin proteica son de gran utilidad para obtener una preparacin de
inmunoglobulinas parcialmente purificadas, con un mnimo de recursos y un mximo de rendimiento, en forma
rpida. Los mtodos que utilizan sales proporcionan preparaciones enriquecidas en inmunoglobulinas, aunque no
logran eliminar por completo ni la albumina srica ni diversas globulinas del plasma. Por otro lado la utilizacin de
acido caprlico (octanoico) es notable, por la relativa pureza con que se obtienen las inmunoglobulinas, con
menos cantidad de albmina que en el uso de sales para la purificacin.
El cido caprlico causa la precipitacin de la mayora de las protenas plasmticas, salvo las
inmunoglobulinas las cuales quedan en solucin. Por el contrario las sales inorgnicas causan la precipitacin de
las inmunoglobulinas (y otras globulinas), dejando a la albumina en solucin. En este sentido es importante notar
que en la precipitacin por sales, las inmunoglobulinas son sometidas a un proceso de desnaturalizacin
reversible, ya que se hacen precipitar y luego se disuelven nuevamente (disminuyendo la salinidad del medio).
Esto puede resultar, potencialmente, en mayores alteraciones moleculares en las inmunoglobulinas. Sin embargo
una ventaja es que al momento de redisolver las inmunoglobulinas precipitadas, se tiene la opcin de poder
convinarlas, manteniendo el volumen del solvente a un mnimo. Por otra parte, la tcnica del acido caprlicio se
considera como un tratamiento menos drstico para las inmunoglobulinas, ya que no las desnaturaliza, aunque a
diferencia del mtodo anterior, no permite concentrarlas directamente.
A continuacin se presentan algunos procedimientos descritos para la purificacin parcial de
inmunoglobulinas, basados en procesos de precipitacin diferencial de protenas.
68

1.2. Purificacin de inmunoglobulinas sricas por precipitacin con sulfato de amonio

2. Disolver 100g de sulfato de amonio (de alta pureza, libre de metales en) en 1000ml de agua
destilada, a 50C. Dejar a temperatura ambiente durante la noche y ajustar el pH a 7,2 con una
solucin diluida de cloruro de amonio o de cido sulfrico.
3. Diluir la muestra de suero 1/2 con solucin salina fisiolgica (NaCl 0,15 M). Colocarlo en un
recipiente apropiado, sobre un agitador magntico, a velocidad moderada. Evitar la formacin de
espuma, pues implica la desnaturalizacin de protenas.
4. Agregar la cantidad requerida del sulfato de amonio saturado, poco a poco, para llegar a una
concentracin final del 45% v/v. Como ejemplo podemos coger 10ml de suero al que se agregaremos
8,2ml de sulfato de amonio 100% saturado. La solucin se torna blancuzca, por la formacin de un
precipitado. Dejar en agitacin suave por 15-30 minutos adicionales, para que los grumos de
precipitado crezcan.
5. Centrifugar durante 15 minutos a 1000 revoluciones por sg. y descartar el sobrenadante.
6. Lavar el precipitado, agregando abundante sulfato de amonio (al 45% de saturacin), y resuspender
bien los grumos de precipitado. Anotese que a esta concentracin el sulfato de amonio no permite
que el precipitado se redisuelva, y funcione solo como un solvente que diluye aquellas protenas que
aun estn solubles (principalmente albmina), atrapadas entre los grumos de precipitado y
centrifugar de nuevo.
7. Descartar el sobrenadante y redisolver el precipitado, al mismo volumen de la muestra original, con
solucin salina. Centrifugar una vez ms, con el fin de eliminar residuos de protena insoluble
(desnaturalizada de modo irreversible). Recoger el sobrenadante.
8. Re-precipitar las inmunoglobulinas, ahora con una concentracin final de 40% de sulfato de amonio
saturado. Centrifugar.
9. Descartar el sobrenadante. Lavar el precipitado con sulfato de amonio al 40% de saturacin y
centrifugar.
10. Descartar el sobrenadante. Redisolver el precipitado en un volumen mnimo de solucin salina, o de
PBS (salina amortiguada con fosfatos pH 7,2).
11. Eliminar las sales de la preparacin final mediante dilisis contra PBS (ej. 5 cambios de 1 litro en 24
horas), ultrafiltracin, o cromatografa de filtracin en gel, con Sephadex P-10, G-25, u otros medios
similares.
En base a todo ello cabe dar a conocer el clculo por el cual obtendremos el volumen de solucin
saturada requerida para alcanzar una concentracin dada de sulfato amonio, para la cual podemos utilizaremos la
siguiente frmula:
V=Im(S Si)(1 S) Donde: V= volumen de solucin saturada agregada.
Vm= volumen de la muestra de suero a procesar.
Sf= saturacin final deseada.
Si= saturacin inicial.
1.3. Purificacin de IgG srica mediante cido caprlico
Estas tcnicas permiten la purificacin rpida de IgG a partir del suero. Tambin se ha descrito su
utilizacin para purificar anticuerpos monoclonales murinos (un tipo de anticuerpos monoclonales) a partir de
fluido asctico. El acido caprlico u octanoico se utiliza en condiciones a las cuales precipitan las otras protenas
plasmticas, dejando a las inmunoglobulinas en solucin. La pureza final de la IgG obtenida es cercana al 90%.
69

En base a ello los pasos a seguir para este tipo de purificacin son:
1. A cada 100ml de suero, agregar 200ml de acetato de sodio 0,06 M a pH 4,0 para conseguir un pH
final de 4,8.
2. Agregar 6,8g de cido caprlico, gradualmente, con agitacin fuerte. Dejar 30 minutos en agitacin.
3. Centrifugar. Recoger el sobrenadante y subir el pH con NaOH 1,0 M, hasta el pH deseado. Eliminar
las sales y el cido caprlico de la preparacin final mediante dilisis contra PBS, ultrafiltracin o
cromatografa de filtracin en gel.
1.4. Purificacin de IgG srica por un mtodo combinado, mediante sulfato de amonio y cido
caprlico
Para este tipo de purificacin realizaremos los siguientes pasos:
1. Precipitar con cido caprlico como se describi ms arriba en el capitulo. Recoger el
sobrenadante y ajustar el pH a 7,4 con NaOH 1 M.
2. Precipitar con sulfato de amonio slido (0,28 g/ml para obtener 45% de saturacin) y agitar
durante 15-30 minutos, a temperatura ambiente.
3. Centrifugar durante 15 minutos a 5000 revoluciones por sg. y redisolver el precipitado en PBS,
usualmente a 1/10 del volumen original. Eliminar las sales de la preparacin final mediante
dilisis contra PBS, ultrafiltracin, o cromatografa de filtracin en gel.
2. Electroforesis

2.1. Introduccin
Una vez se prepara el gel en la cubeta tanto del de agar y agarosa que vimos anteriormente como el de
poliacrilamida que veremos a continuacin, se procede a la realizacin de unos pocillos donde se pondr la
muestra. Tanto las muestras problema como las de control que irn mezcladas con un colorante inerte para
poder visualizar la migracin.
La cubeta de electroforesis est rellenada con el tampn adecuado el cul se pone en funcionamiento
hasta que se observe que el colorante se encuentre a 0,5 cm del final del gel. Entonces se para la migracin.
Una de las bandas que contiene el antgeno separado por la electroforesis se corta, se deseca, se tie con
azul de Coomassie y se decolora. Esto nos sirve posteriormente como control del proceso electrofortico.
El resto del gel se electrotransfiere inmediatamente para evitar la difusin del antgeno en el gel, lo que
disminuye mucho la sensibilidad de la tcnica.
En base a ello la electroforesis puede ser de dos tipos:
Electroforesis de protenas en poliacetato de celulosa o agarosa
Electroforesis en gel de poliacrilamida

70

2.2. Electroforesis de protenas en poliacetato de celulosa o agarosa
Introduccin
La electroforesis de zona es una tcnica para la separacin de molculas con base en su carga neta, en un
campo elctrico. Puede utilizarse con fines:
Analticos (evaluacin de protenas sericas).
Preparativos (purificacin)
O combinada en mtodos inmunoqumicos como la inmunoelectroforesis (que veremos ms
adelante en este captulo).
Esta electroforesis puede utilizar distintos medios de soporte, como son:
Cintas o membranas de poliacetato de celulosa.
Geles de agarosa.
En esto, las protenas migran sin restriccin de tamao cuando se utiliza estos medios. La tcnica en
membrana es ms rpida, aunque ms limitada en el volumen de la muestra, mientras la de agarosa es ms lenta,
pero permite el uso de mayores volmenes de muestra (lo cual es importante en tcnicas
inmunoelectroforeticas).
Usualmente se realiza la electroforesis en medio con pH entre 8,2 y 8,6, en donde mayora de protenas
se cargaran negativamente y migraran hacia el nodo positivo (+). Las inmunoglobulinas, en promedio, poseen
poca carga a este pH, y por tanto migran poco desde el punto de aplicacin u origen. Las 5 zonas clsicas
separadas en este sistema son:
Albmina
Globulinas o
1
, o
2
, y
Aunque los amortiguadores de pH 8,2 y 8,6 son los ms utilizados, se pueden variar las condiciones para
analizar otro tipo de muestras. Los amortiguadores clsicos ms utilizados estn constituidos a base de
barbituratos (brbital sdico y cido dietibarbitrico). Sin embargo, debido a las restricciones de estas sustancias,
se pueden utilizar otros sistemas amortiguadores como el Tris-glicina con resultados satisfactorios.
Las protenas separadas por electroforesis pueden fijarse y teirse con distintos colorantes, los cuales
varan en sensibilidad, tales como:
Negro de almidn 10 B (azul oscuro)
Ponceau-S (rojo, ligeramente ms sensible)
Estos son algunos de los colorantes ms que ya se comentaron en apartados anteriores de este captulo.
Por otro lado otros colorante, tambin comentados antes en este captulo, si se requiere mayor sensibilidad se
puede utilizar:
Coomassie G-250 (azul brillante)
Coomassie R-250 (azul violeta)
Las protenas separadas electroforticamente pueden someterse a un anlisis cuantitativo mediante
densitometra. Esto requiere que el medio de soporte sea trasparente, por lo general. En el caso de la agarosa los
geles son naturalmente trasparentes, pero en el caso del poliacetato de celulosa, que es opaco debe realizarse un
71

proceso de trasparentizacin. En breve la densitometra consiste en pasar el electroferograma final (la placa de
agarosa o membrana de poliacetato de celulosa teida) por un espectofotmetro especialmente diseado para
que el haz de luz rastree gradualmente una lnea continua, que abarca la regin de inters. La fotocelda de
deteccin, otra parte del aparato que esta acoplado a un sistema graficador, que proporciona un trazo en donde
la absorbancia es proporcional a la concentracin de protena. El rea bajo la curva de cada pico electrofortico es
proporcional a la cantidad de protena en la banda correspondiente.
Las tcnicas electroforticas tienen gran versatilidad, dado que se pueden realizar tinciones para la
deteccin de diversos tipos de sustancias, incluyendo:
Proteinas
Lpidos
Carbohidratos
cidos nucleicos
Tambin se puede adaptar para la deteccin de:
Enzimas y sus isoformas (a travs de la actividad particular)
De antgenos (en combinacin con una variedad de tcnicas inmunolgicas)
Fig. 6.11. Partes bsicas de una cmara de electroforesis en agarosa o poliacetato de celulosa. 1. Fuente
de poder; 2. Recipientes con electrodos sumergidos en el amortiguador; 3. Puentes de contacto entre el
amortiguador y el medio electrofortico (papel filtro, esponja etc.); 4. Medio electrofortico (agarosa o
poliacetato de celulosa)
Electroforesis en poliacetato de celulosa
Para llevar a cabo esta tcnica realizaremos los siguientes pasos:
1. Hidratar la membrana (manejarla con pinzas), sumergindola lentamente en el amortiguador de
electroforesis. Dejarla sumergir como mnimo durante 10 minutos.
2. Preparar la muestra (suero) agregndole unos granitos de azul de bromofenol. Este colorante
migra hacia el nodo y sirve para visualizar el frente de migracin.
3. Sacar la membrana y colocarla sobre una hoja de papel secante o papel filtro. Secar el exceso de
lquido cuidadosamente, sin que se seque el medio por completo.
4. Aplicar la muestra (ej. 1-3l) sobre la membrana con un aplicador especial o segn el sistema de
partculas utilizado. Inmediatamente para reducir la difusin colocar la membrana en su posicin,
en la cmara electrofortica, haciendo contacto uniforme con los recipientes del amortiguador a
72

ambos lados. Los distintos tipos de cmaras varan en sus sistemas de contacto, como esponjas,
papel filtro, imanes para sostener la membrana, etc.
5. Encender la fuente de poder y correr las muestras a 180v durante 15-20 minutos (hasta que el
frente de migracin haya recorrido por lo menos 3-4cm).
6. Bajar el voltaje a 0 y apagar la fuente de poder. Asegurarse de haber desconectado la corriente
antes de abrir la cmara. Retirar la membrana y sumergirla en el colorante deseado, ej. Ponceau-
S, por 10 minutos. Decolorar en cido actico al 5%, haciendo varios cambios, hasta que el fondo
de la membrana sea blanco nuevamente.
7. Si es necesario transparentizar (para densitometra), colocar la membrana sobre una lamina de
vidrio, sin atrapar burbujas, y sumergirla durante 1 minuto en metanol. Luego sumergirla durante
30-60 sg. en el reactivo transparenciador, y colocar durante unos minutos en una estufa a 100C,
hasta que se aclare. Se puede utilizar una secadora de cabello con aire caliente en sustitucin de
la estufa.
Electroforesis en gel de agarosa
Para llevar a cabo esta tcnica realizaremos los siguientes pasos:
1. Preparar el volumen deseado de agarosa (1%v/v) en amortiguador de electroforesis (ej. Tris-
glicina). Si el amortiguador es termolbil (ej. barbital), se funde la agarosa en agua, al doble de la
concentracin, y se agrega un volumen igual de buffer. Para una placa de 8x10cm se puede
utilizar 12ml de gel. Es importante que las placas de vidrio hayan sido descubiertas con placa base
(ya descritas antes en este captulo).
2. Con el gel fundido, chorrear de inmediato la placa sobre una superficie nivelada. Rpidamente
colocar unos trozos de clip para formar los hoyos de la muestra, en el lugar deseado y dejar
gelificar. Los clips sern retirados posteriormente con un imn. Tambin es posible utilizar un
peine de tefln para formar las ranuras de las muestras. Despus de la gelificacin, mantener la
placa en cmara hmeda, si no se va a utilizar de inmediato.
3. Preparar las muestras como se describi arriba, con azul de bromofenol. Eliminar material
insoluble por centrifugacin. Cargar las muestras (ej. 3-15l) en las ranuras.
4. De inmediato, colocar la placa en la cmara y encender la fuente de poder. Utilizar 16mAmp
(miliamperios) por cada placa de 8cm de seccin trasversal (2mAmp/cm) hasta que el colorante
haya migrado unos 4-5cm.
5. Bajar los controles de la fuente de poder a cero y apagarla. Asegrese de haber desconectado la
corriente antes de abrir la cmara. Sumergir la placa en colorante (ej. Ponceau-S) durante 20-30
minutos. Decolorar en cido actico al 5%, haciendo varios cambios, hasta que la agarosa quede
transparente. Si se desea un registro permanente se puede secar la placa en una estufa.
73

Fig. 6.12. Conversin de las bandas electroforticas (ej. de protenas sricas) en un trazo densitomtrico.
El rea bajo la curva de cada pico es proporcional a la cantidad de protena en la banda correspondiente.
Reactivos
Colorante negro almidn 10 B y Colorante Ponceau-S, ambos son los mismos que se expusieron en este
captulo un poco ms arriba por lo que no nos detendremos.
Amortiguador de barbituratos 2X (0,044 M, pH 8,6 =0,1)
9g dietilbarbiturato de sodio; 65ml HCl 0,1 M; ajustar pH y aforar a 1000ml; conservar en refrigeracin.
Amortiguador Tris 0,116 M-glicina 0,3 M (alternativo al barbital)
14,1g de Tris; 22,6g glicina; ajustar pH a 8,6 y aforar a 1000ml; conservar en refrigeracin.
Transparentizador
Acido actico glacial 20ml; alcohol metlico 80ml.
Fig. 6.13. Electroforesis de suero
74

En la Fig. 6.13. s muestran varios sueros con un patrn normal de protenas, separados en membrana de
poliacetato de celulosa a pH 8,6 y teido con Ponceau-S. Las regiones electroforticas que se indican en la fig.
7.7.:
1. Albmina
2. 1
3. 2
4.
5.
En donde el nodo (+) se encuentra a la izquierda, mientras el punto de aplicacin u origen est a la
derecha de la regin gamma.
Fig. 6.14. Electroforesis de suero en agarosa
En la Fig. 6.14. s puede observar que la intensa zona de la albmina enmascara la regin 1. Dicha foto
anterior por otro lado, corresponde a una muestra corrida en un gel de agarosa, en el que se abri el canal
correspondiente a la muestra mediante la inclusin de un trozo de clip en el gel.
Por otro lado en dicha imagen a pH 8,2. Corresponde a pH 8,2 en donde la accin electroendosmtica del
gel que arrastra a las inmunoglobulinas hacia el ctodo (-) a partir del punto de aplicacin. Por ltimo comparar,
a partir del punto de aplicacin o comparar la ubicacin de la regin gama en relacin a la fig. 6.13.
Fig. 6.15. Aplicacin de muestras para electroforesis en cintas de poliacetato de celulosa.
75

Las muestras en la Fig. 7.9. se colocan en un cargador con alambres que atrapan 2-3l, mediante
capilaridad. Luego el cargador se presiona suavemente sobre la cinta prehidratada, dejando marcadas las
muestras por contacto sobre su superficie.
Fig. 6.16. Fuente de poder y cmara para electroforesis en poliacetato de celulosa.
En esto la fuente de poder de la izquierda de la Fig. 7.10 se conectara a los electrodos de la cmara en la
parte derecha, observando la correcta polaridad. La cmara tendr una tapa acrlica transparente que permite
visualizar la corrida de las muestras, a la vez que previene accidentes por descargas elctricas.
2.3. Electroforesis en gel de poliacrilamida
Introduccin
Los geles de poliacrilamida constituyen un excelente medio de soporte para separacin electrofortica,
dado que renen una serie de propiedades idneas:
Transparencia
Elasticidad
Porosidad controlable
Compatibilidad con gran variedad de compuestos qumicos.
La poliacrilamida se forma por copolimerizacin de dos compuestos:
Acrilamida
Bis-acrilamida
Ambas mediante una reaccin iniciada por la tetrametiletilndiamina (TEMED) y el persulfato de amonio.
Entre las diversas tcnicas de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE, siglas en ingles), de estas
probablemente la ms utilizada es la modalidad que se lleva a cabo en presencia del detergente duodecilsulfato
de sodio (SDS-PAGE), tanto para analizar mezcla de protenas, como para ser combanada con tcnicas de
inmunoelectrotransferencia, como la inmunoelectroforesis que describiremos en el presente captulo ms
adelante. En la tcnica de SDS-PAGE, se mezclan las protenas con el detergente aninico SDS para formar
complejos desnaturalizados, cargados negativamente. La cantidad de SDS unido a la protena es proporcional a su
tamao, unindose el SDS en proporcin aproximada de 1,4g SDS/g protena. Dado que la relacin final
carga/masa queda constante para las distintas protenas (se anula su carga intrnseca), estas van a ser separadas
76

en el gel poroso fundamentalmente con base en sus diferencias de peso molecular (PM): donde a mayor tamao,
mayor movilidad de la protena, y viceversa.
Geles en gradiente
Ciertos tipos de muestras poseen componentes con PMs muy variados, donde se incluyen desde
macromolculas hasta pequeos pptidos. En tales casos, el uso de un gel separador de concentracin
homognea limita a resolver adecuadamente solo una fraccin determinada de los componentes. La alternativa
para estos casos es la utilizacin de geles de concentracin heterognea, en los cuales se prepara un gradiente
que va desde una concentracin baja, al inicio del gel como por ejemplo 5%, aumentando hacia el final a por
ejemplo 30%. Estos geles proporcionan la mayor resolucin obtenible por SDS-PAGE para mezclas heterogneas y
su preparacin requiere de un aditamento simple para generar gradientes, que pueden ser obtenidos
comercialmente, o preparado en el laboratorio.
Fig. 6.17. Esquema de la preparacin de un gel poliacrilamida en gradiente. 1. Llave; 2. Agitador magntico;
3. Bomba peristltica; 4. Modelo de vidrio para el gel; A. Solucin diluida (concentracin mnima): B. Solucin
concentrada (concentracin mxima)
Preparacin de geles para SDS-PAGE
Para la preparacin de lo geles para SDS-PAGE, se llevaran a cabo mediante una serie de pasos en donde
se utilizaran unas cantidades descritas a continuacin que sirven para el sistema de mini-geles de Bio-Rad. Estas
mismas cantidades pueden adaptarse para otras cmaras de diversa capacidad, conservando las proporciones. En
base a ello se llevaran a cabo los siguientes pasos:
1. Para preparacin del gel separador (5ml, grosor=0,75 mm), mezclaremos los siguientes
reactivos, segn el porcentaje de gel deseado, en un frasco Kitasato (matraz de precipitado)
de 50ml:
Componente Concentracin final
20% 15% 12% 10% 7,5% 5%
Agua desionizada 367 1167 1687 2000 2367 2783 l
Amortiguador separador 1250 1250 1250 1250 1250 1250 l
SDS 50 50 50 50 50 50 l
Acrilamida/bisacrilamida 3333 2500 2000 1667 1250 833 l
2. Preparar el molde para el gel. Hacer una marca de1-1,5cm debajo del nivel del peine de
muestras. Retirar el peine.
3. Con la mezcla de reactivos a temperatura ambiente, desgastar aplicando vaci
(asegurndose de que el sistema cuenta con una trampa de seguridad), durante 15
minutos.
77

4. Iniciar la polimerizacin agregando 3 l de TEMED y 15 l de persulfato de amonio (estas
cantidades pueden variar segn cada lote y estado de los reactivos) a la mezcla.
Inmediatamente mezclar y verter la solucin en los vidrios (molde), hasta la marca echa en
el paso 2, sin atrapar burbujas. De seguido eliminar la curvatura (menisco) en la superficie,
con una delgada capa (1-2mm) de agua destilada o isobutanol, depositada suavemente
sobre la mezcla. Dejar que polimerice el gel (ptimamente en 15-20 minutos).
5. Una vez que la interfase entre el polmero u el agua se torna visible, esperar 10-15 minutos
adicionales para que se complete la reaccin. Luego decantar el exceso de lquido de la
superficie, y colocar el peine para muestras, en posicin ligeramente inclinada (para no
atrapar burbujas).
6. Mezclar los componentes del gel (compactador):
Componente Cantidad
Agua desionizada 1,5 l
Amortiguador superior 630 l
SDS 33 l
Acrilamida/bisacrilamida 330 l
TEMED 2 l
Persulfato de amonio 10 l
7. Una vez agregados los catalizadores, mezclar y verter de inmediato en el molde, nivelando
el peine y colocarlo en su posicin horizontal, sin atrapar burbujas. Dejar polimerizar.
8. Quitar el peine deslizndolo suavemente, y lavar los hoyos llenndolos con agua y aspirar
luego con una jeringa. Esto elimina residuos de componentes no polimerizados.
9. Preparar las muestras. Estas se pueden analizar en estado, residual, no residual,
mezclndola con el respectivo amortiguador de muestras. Si las muestras son slidas, se
puede disolver directamente en el amortiguador de 1x. Si son liquidas se mezclan partes
iguales de muestras y amortiguador 2x. La cantidad de protena a aplicar depende de la
sensibilidad del sistema de deteccin (ej. g para tincin de Coomassie, ng para tincin de
plata) y de la heterogeneidad de la muestra. Para reducir los enlaces disulfuro de la muestra
con amortiguador reductor. Colocarlas en un bao de agua a ebullicin durante 5 minutos.
Para correr muestras no reducidas, se mezclan con amortiguador (sin reductor) y se aplican
al gel directamente, sin calentar. La concentracin de la muestra a usar depende de su
heterogeneidad. Las mezclas complejas de protenas se pueden preparar a 5-10 mg/ml.
10. Cargar las muestras en los hoyos (5-15 l, correspondiendo por ej. a 10-30 g en el caso de
mezclas complejas, o 3-10 g para protenas purificadas). Para esto se puede llenar
previamente todos los hoyos con amortiguador de cmara, y luego aplicar las muestras bajo
el amortiguador (dado que son ms densas por la glicerina), con una jeringa Hamilton o una
pipeta de puntas capilares. Es fundamental asegurarse que no ocurran contaminaciones
cruzadas entre los distintos hoyos. Igualmente, si se utiliza una pipeta Hamilton, hay que
lavarla exhaustivamente entre las distintas muestras. Incluir marcadores de PM (peso
molecular) en uno de los carriles como referencia.
11. Llenar el tanque con el amortiguador de cmara (189ml en el tanque inferior y 120 ml en el
superior). Colocar el gel en la cmara y correr a 200 v (voltaje constante) hasta que el azul
bromofenol llegue casi al borde inferior del gel (45-60 minutos).
12. Sacar el gel y sumergirlo en fijador durante 15 minutos, en un recipiente tapado (para evitar
los vapores txicos del metanol), con agitacin suave. Adems de fijar, esta solucin extrae
una cierta proporcin del SDS del gel, cual interfiere con la tincin.
13. Teir el gel durante 1 hora con azul de Coomasie R-250. Eliminar luego el exceso de
colorante con varios cambios de decolorador. La decoloracin es ms rpida si se agrega al
recipiente unos trocitos de esponja (tipo espuma de poliuretano) limpios, que actan
adsorbiendo el colorante.
78

14. Registrar los resultados por fotografa. Si se desea guardar el gel por algunos meses, se
puede dejar en acido actico al 7% en cajas o bolsas de plstico selladas. El gel puede
secarse sobre un papel filtro grueso, o entre trozos de celofn. Para esto se sumerge el gel
durante la noche en 5% metanol con 3% glicerol, se monta sobre el papel filtro o celofn,
con otra hoja de celofn encima, y se coloca en un secador de vaco durante 1-3 horas a
60C. El secado de geles no est exento de riesgos, ya que pueden ocurrir rupturas que lo
arruinen. A mayor concentracin de gel, mayor es la dificultad para el secado, y viceversa. Si
no se dispone de un secador, se pude emplear un vidrio con peso sobre el celofn para
secar a temperatura ambiente, ms lentamente.
Fig. 6.18. Preparacin de un gel de poliacrilamida, partes. 1. Vidrio separador por reglitas de tefln, que
determinan el grosor del gel; 2. Peine para formar los hoyos para muestras; 3. Bloque de plstico para
ensamblar los vidrios; 4. Base para realizar el chorreo del gel; 5. Ncleo de cmara de electroforesis, con
los electrodos.
Fig. 6.19. Polimerizacin del gel. Una vez ensambladas las piezas del molde, los componentes del gel se
mezclan con los catalizadores e inmediatamente se vierten en el espacio entre los vidrios.

79

Fig. 6.20. Anlisis de la pureza y composicin de subunidades de una protena mediante SDS-PAGE.
Reactivos
Solucin de monmeros de acrilamida
29,2 g acrilamida; 0,8 g bis-acrilamida; disolver en agua desionizada y aforar a 100 ml. Filtrar y guardar en
botella mbar de vidrio, en refrigeracin ( 1 mes).
Amortiguador del gel separador (inferior)
18,15 g Tris; disolver en 60 ml de agua, ajustar a pH 8,8 con HCl, aforar a 100 ml. Guardar en refrigeracin.
Amortiguador del gel separador (superior)
3,0 g Tris; disolver en 60 ml de agua, ajustar a pH 6,8 con HCl, aforar a 100 ml. Guardar en refrigeracin.
Amortiguador de cmara (solucin concentrada 10x)
12 g de Tris; 57.6 g glicerina; 4 g SDS; disolver en 300 ml de agua. El pH debe quedar entre 8,3-8,4 si las
pesadas son correctas (debe evitarse el ajuste del pH para no altera la fuerza inica de esta solucin). Aforar a 400
ml. Guardar a temperatura ambiente, Diluir 10 veces al momento de utilizar.
Persulfato de amonio
Preparar al momento una solucin al 10%. Este reactivo es muy higroscpico (sellar bien el frasco y
mantener en desecador). Una alternativa es preparar alcuotas (ej. 200 l) en viales pequeos y congelarlas.
Solucin SDS
1,0 g duodecilsulfato de sodio; disolver en 10 ml de agua. Guardar en botella de vidrio a temperatura
ambiente.
Amortiguador de muestras no reductor (solucin concentrada 2x)
10,0 ml amortiguador del gel superior; 16,0 ml solucin de SDS; 50 mg azul de bromofenol; 12,0 ml
glicerol; 4,0 ml agua; mantener a temperatura ambiente ( 2 meses).

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Amortiguador de muestras reductor (solucin concentrada 2x)
El mercaptoetanol es inestable en esta solucin, por lo que se prepara una pequea cantidad del reactivo
para una semana. Agregar 0,2 ml de 2-mercaptoetanol a 4,2 ml de amortiguador no reductor. Guardar a
temperatura ambiente. Las concentraciones finales de los agentes son 4% SDS y 5% 2-Me. El 2-Me es txico y la
inhalacin de vapores de metanol.
Fijador
500 ml metanol; 70 ml cido actico glacial; 430 ml de agua. Guardar a temperatura ambiente en
recipiente hermtico, y evitar el contacto e inhalacin de vapores de metanol.
Colorante Coomssue Blue R-250 (ya descrito anteriormente en este captulo)
Decolorador
200 ml metanol; 100 ml etanol; 50 ml cido actico; 650 ml agua. Guardar a temperatura ambiente.
Introduccin a la inmunoelectroforesis
La inmunoelectroforesis, descrita por Grabar y Williams en 1953, es la combinacin de una electroforesis
con una inmunodifusin en gel. En la etapa electrofortica se separan los antgenos de una mezcla, y en la etapa
de inmunodifusin se preciptan dichos antgenos con sus respectivos anticuerpos, formando bandas en forma de
arco.

Fig. 6.21. Inmunoelectroforesis simple
En la fig. 6.21. en la parte izquierda en a la muestra (m) se separa electroforticamente en un gel de
agarosa. Los componentes separados se representan por las reas punteadas. Una vez finalizada la corrida, en
b, se abre un canal a lo largo de la placa para colocar el antisuero deseado. En c, despus de 24 horas de
difusin, se evidencian los distintos sistemas antgeno-anticuerpo que precipitaron, formando arcos. En la parte
derecha se observa la separacin de suero bovino (SB) y posterior difusin frente a anticuerpos contra la
albmina (suero -BSA)
La corrida electrofortica se realiza en una placa de agarosa, en la cual se abren uno o ms pocillos
circulantes para las muestras. Despus de la corrida se abre un canal largo, paralelo a la direccin de la corrida. El
canal se llena con el antisuero correspondiente y la placa se deja en cmara hmeda durante 24 horas. Durante
81

este periodo, los diferentes antgenos y anticuerpos se encuentran, se forman precipitados en forma de arco
(para cada sistema antgeno-anticuerpo), siguiendo los mismo principios de la doble inmunodifusin, en gel,
descritos antes en este mismo captulo.
Fig. 6.22. Inmunoelectroforesis en suero
La inmunoelectroforesis tiene utilidad para analizar mezclas de antgenos, y caracterizar sus propiedades
electroforticas y antignicas. En el campo clnico, es til para determinar la presencia y tipos de paraprotenas
(mielomas multiples, gammapatas monoclonales benignas, etc.). Tambin permite evidenciar la ausencia o
disminuciones sustanciales de algunos componentes sricos tales como IgG, IgA e IgM C3 del complemento. En la
clasificacin de mielomas se utilizan sueros monoespecficos contra los distintos isotipos de las cadenas pesadas y
livianas, para determinar el tipo de inmunoglobulina involucrado en la neoplasia. Dado que en los mielomas hay
un aumento considerable de una inmunoglobulina monoclonal, con la que se detecta una distorsin en el
correspondiente arco de inmunoprecipitacin.
Tipos de inmunoelectroforesis
Posteriormente a la descripcin del mtodo original de la inmunoelectroforesis simple (cuyo
procedimiento veremos a continuacin), surgieron numerosas variantes, algunas de ellas con fines cuantitativos,
entre las que distinguimos:
1. Inmunoelectroforesis en cohete permite la primera cuantificacin de antgenos, al incorporar
sus anticuerpos correspondientes (monoespecificos) en el gel para obtener un precipitado
alargado, cuya altura es proporcional a la cantidad de antgenos en la muestra.
En este tipo de inmunoelectroforesis, la placa con gel de agarosa contiene anticuerpos contra el antgeno
a determinar. Las muestras se colocarn en los pocillos circulantes y se sometern a un campo elctrico para que
se formen los precipitados alargados cohetes, cuya altura depender de la concentracin del antgeno.
Utilizando estndares de concentracin conocida, trazando una curva de referencia en donde graficaremos la
altura del precipitado en (mm) contra la concentracin del antgeno como veremos en las imgenes a
continuacin.
Fig. 6.23. Inmunoelectroforesis en cohete y grafica de representacin del precipitado.
82

Fig. 6.24. Inmunoelectroforesis en cohete
En este caso el de la fig. 6.24. los hoyos 1-4 se llenaron con muestra de 5 l de albmina, con las siguiente
concentracines 1. 15 g/ml, 2. 30 g/ml, 3. 60 g/ml y 4. 120 g/ml. El gel de agarosa al 1% contiene anticuerpos
anti-albmina (7 l cm
2
), y se corri a pH 8,6 durante 3 horas a 10 V/cm, con el nodo arriba.
2. Inmunoelectroforesis bidimensional permite aun mayor resolucin que la simple, al separar
una mezcla de antgenos en una dimensin de electroforesis y luego perpendicularmente una
segunda dimensin electrofortica en gel con antgenos.
En base a ello, una muestra proteica es separada en un gel de agarosa (izquierda de la siguiente imagen).
Posteriormente se corta la porcin superior del gel (derecha siguiente imagen) y se agrega otro gel de agarosa
que con tiene anticuerpos contra los antgenos de inters. En este punto se aplica otra electroforesis (segunda
dimensin) en un ngulo de 90 con respecto a la primera, para que se formen distintos arcos de precipitacin
antgeno-anticuerpo.
Fig. 6.25. Inmunoelectroforesis bidimensional
Fig. 6.26. Inmunoelectroforesis bidimensional
83

En este caso el de la fig. 6.26. en la primera dimensin (horizontal) se corri 3 l de suero humano, desde
el origen (o) hacia el nodo. En la segunda dimensin (vertical) se corri las protenas en un gel con suero anti-
humano total (9 l cm
2
), a pH 8,6. Antese el gran nmero de componentes que precipitan (con tincin
Coomassie G-250). Se puede identificar la pre-albmina (p) y la albmina (a), entre algunos otros arcos conocidos.
3. Contrainmunoelectroforesis (CIEF) es una variante que podra considerarse como una doble
inmunodifusin, movida por electroforesis. En esta tcnica se hace migrar electroforticamente,
pero en sentidos opuestos, dos muestras que contienen, respectivamente, el antgeno y los
anticuerpos. La tcnica se basa en que a valores de pH cercanos a 8, las inmunoglobulinas poseen
poca carga neta y son arrastradas hacia el ctodo por la electroendosmosis (vista anteriormente
en este captulo). La CIEF es til para detectar antgenos acdicos (pH7), que migran hacia el
nodo a pH de 8,2. Al encontrarse el antgeno con sus respectivos anticuerpos, se formara una
banda de precipitacin en un tiempo mucho menor de 1 a 2 horas que en una inmunodifusin, ya
que el movimiento de las muestras es acelerado por el campo elctrico.
En este tipo de inmunoelectroforesis en la placa de agarosa, se colocan antgenos y anticuerpos en la
posicin indicada en el diagrama de la figura siguiente parte izquierda. Despus de la corrida electrofortica, se
observan las bandas de precipitacin formadas en la parte derecha de la figura. En el caso de este ejemplo, solo
las muestras control, estaran dando resultado positivo.
Fig. 6.27. Contrainmunoelectroforesis
Fig. 6.28. Contrainmunoelectroforesis
En el caso de esta figura, la fig. 6.28. las muestras 1-4 se enfrentaron contra un antisuero (hoyos de la
izquierda) para la deteccin de un antgeno acdico. El nodo se encuentra a la izquierda. Las muestras 1,3 y 4 son
positivas, mientras la 3 es negativa.
Esta tcnica clsica, la contrainmunoelectroforesis es utilizada por ejemplo para la deteccin tanto de
antgenos como de anticuerpos para el virus de la hepatitis B (HBsAg), al igual que para ciertas enfermedades
autoinmunes entre otras determinaciones.
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Procedimiento inmunoelectroforesis simple
Para dicho procedimiento se realizaran los siguientes pasos:
1. Preparar agarosa al 1% en amortiguador de electroforesis, tales como Tris-glicina o barbital. Para
placas de 8x10 cm se puede utilizar 18 ml de gel, y para placas de 5x7,5 cm se puede utilizar 8
ml. El vidrio debe tener capa doble (como ya se explico).
2. De inmediato, chorrear la placa sobre una superficie nivelada, esparciendo cuidadosamente el
gel por los bordes, sin dejar burbujas. Dejar gelificar.
3. Abrir los pocillos de 3-4 mm cada uno en el gel con un sacabocados. Si se utilizan varios pocillos,
debe dejarse una distancia de al menos 15 mm entre ellos. Es conveniente dibujar previamente
un molde con las posiciones de los pocillos y los canales, para colocarlo debajo de la placa y
utilizarlo como gua.
4. Agregar azul de bromofenol al menos a una de las muestras, para visualizar el frente de
migracin. Cargar las muestras en sus hoyos correspondientes de 30 l/hoyo.
5. De inmediato, colocar la placa en la cmara elecfortica. Encender la fuente de poder y ajustar a
2mAmp/cm de seccin transversal (ej. 16 mAmp para las placas de 8 cm de altura). Correr hasta
que el colorante haya migrado unos 5-6 cm.
6. Al finalizar la corrida, sacar la placa de la cmara. Asegrese de haber desconectado la corriente
antes de abrir la cmara. Cortar los canales para el antisuero en el gel, con la ayuda de una
cuchilla doble de 3 mm de dimetro. Con una cua o esptula, retirar el gel del canal, y cargar el
volumen establecido de antisuero, con micropipeta. Dejar algunos minutos para que el
antisuero comience a ser absorbido por el gel, y baje su nivel, antes de mover la placa, para
evitar que rebalse.
7. Colocar la placa en cmara hmeda durante 24-48 horas a temperatura ambiente. Observar y
registrar los resultados.
A parte de esta tcncia de inmunoelectrofesis simple y todas las mencionadas anteriormente basadas en
la inmunoelectroforesis, as como el resto de tcnicas basada en la precipitacin en gel, existen otras tcnicas
tales como:
Determinacin de inmunoglobulina G (IgG) mediante inmunodifusin doble bidimensional
Dicha determinacin se basa en medir de forma aproximada la cantidad de inmunoglobulina G (Ig G)
presente en el suero de una muestra sangunea. Para lo que se preparan unas diluciones seriadas de la muestra,
que se depositan en posillos perifricos de una placa de agarosa y se enfrenta a un antisuero anti-Ig G
(inmunoglobulina G) situada en el pocillo central de dicha placa. Tcnica basada en la inmunodifusin doble
bidimensional descrita anteriormente.

UNIDAD DIDCTICA VII
TCNICAS BASADAS EN LA REACCIN DE FLUORESCENCIA

87

7.1 Conceptos previos al estudio de la reaccin de fluorescencia
Antes del estudio de ver la reaccin de flourescencia Deberemos dar a conocer que son los marcadores en
una reaccin antgeno-anticuerpo y los distintos tipos de marcadores existentes entre los que se encuentran los
de fluorescencia que se vern en este captulo y otros distintos marcadores que se vern en los sucesivos
captulos del presente documento.
En base a ello, los marcadores son sustancias que permiten la visualizacin del complejo antgeno-
anticuerpo de la reaccin.
El marcador es una forma cmoda de ver los antgenos sin romper en absoluto el complemento. Dicho
marcador puede ser un fluorocromo, enzima o istopo radiactivo, dependiendo de esto se puede obtener lo
siguiente:
Si el marcador es un fluorocromo la tcnica se conoce como inmunofluorescencia (IF).
Si el marcador utilizado es una enzima y se obtienen la EIE, EIA y ELISA la tcnica que se
realizara ser conocida como enzimoinmunoensayo. Estas sern las tcnicas de
enzimoinmunoanlisis.
Si el marcador utilizado es un istopo radiactivo la tcnica se conoce como RIA o lo que es lo
mismo rayoinmunoensayo.
Con todo esto se puede decir que el fluorocromo es una sustancia utilizada para ver la presencia de
fluorescencia a travs de la observacin de la muestra marcada con dicha sustancia al microscopio electrnico y
que la enzima EIA forma un complejo antgeno-anticuerpo sustrato especfico que se mide
espectrofotomtricamente y (que se vern en sucesivos captulos).

7.2 Inmunofluorescencia
7.2.1 Introduccin
Esta es una tcnica basada en la bsqueda de antgenos en el suero o en los tejidos del paciente mediante
su reaccin con un anticuerpo marcado con fluorescencia.
Dicho anticuerpo se une covalentemente a un fluorocromo (sustancia que emite fluorescencia), que es
aquella molcula capaz de absorver energa a una determinada longitud de onda comprendida entre 200-400 nm.
(espectro ultravioleta) y que a su vez es capaz de emitir una longitud de ondas comprendida entre 400-700 nm.
(espectro visible). Dicha unin no altera al anticuerpo en su actividad inmunolgica.
Los flurocromos ms utilizado en dicha tcnica son:
El isotiocianato de fluorescena (FITC) que emite un color de fluorescencia verde.

Y la rodamina que da un color de fluorescencia rojo anaranjado.
Entre estos dos se prefiere el isotiocianato de fluorescena ya que la sensibilidad del ojo humano para el
color verde es mayor y se producirn menos falsos positivos por autofluorescencia natural.

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Los mtodos de anticuerpos marcados con fluorocromo ms utilizados habitualmente son los siguientes:
Mtodo directo.
Mtodo indirecto.
Mtodo de tincin del complemento.
Mtodo en sndwich o bocadillo.

7.2.2 Tipos de inmunofluorescencia
7.2.2.1. Mtodo directo
En este mtodo lo que ocurre es que el anticuerpo especifico frente al antgeno que estamos buscando es
marcado con fluorescencia y a este antgeno marcado con fluorescencia es al que se le hace reaccionar en
condiciones ptimas.
Seguidamente despus de esto lo que se har es lavar los anticuerpos marcados con fluorescencia para
eliminar el exceso de anticuerpo que no haya reaccionado y con todo esto se procede por ultimo a la lectura de
los resultados.
Fig. 7.1. Inmunofluorescencia directa
7.2.2.2 Mtodo indirecto
Esta reaccin se realiza en dos etapas que son:
Primera etapa se hace reaccionar el antgeno con su anticuerpo especfico sin marcar.
Segunda etapa una vez realizada la etapa anterior (primera etapa) se aade un
anticuerpo marcado con fluorescencia dirigido frente al anticuerpo de la primera fase.
Este mtodo permite detectar tanto antgenos como anticuerpos, teniendo la ventaja de que un mismo
anticuerpo antiglobulina pueda ser utilizado en mltiples tipos de la reaccin antgeno-anticuerpo.
Normalmente se usa una globulina antihumana de conejo o cabra, que abarata mucho el coste de la
tcnica en comparacin con el mtodo directo, donde se usa anticuerpos monoespecficos marcados con
fluorescencia.
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Fig. 7.2. Inmunofluorescencia indirecta

7.2.2.3 Tincin del complemento
Esta tcnica se puede decir que es una modificacin del mtodo indirecto donde se aplica la reaccin ya
mencionada con anterioridad aadindole complemento.
Fig. 7.3. Tincin del complemento
90

La tcnica de fluorescencia basada en la tincin del complemento consta de las siguientes fases:
Primera fase esta es la fase donde se realiza la reaccin, con un anticuerpo especfico
frente al antgeno buscado.
Segunda fase despus de llevarse a cabo la reaccin aadir el complemento en fresco,
que se une alrededor del anticuerpo en gran cantidad.
Tercera etapa esta se puede decir que es la ltima etapa de esta tcnica en la cual se
utiliza un anticuerpo anti-complemento marcado con fluorescencia.
Este mtodo permite detectar tanto antgenos como anticuerpos desconocidos en suero de un paciente.
7.2.2.4 Mtodo en sndwich o bocadillo
Este mtodo se emplea para la detencin de anticuerpos en tejidos, generalmente de biopsias donde se
produce la reaccin antgeno-anticuerpo-antgeno donde el ltimo antgeno es el marcado con fluorocromo.
7.2.3 Aplicaciones clnicas de la inmunofluorescencia
7.2.3.1 Introduccin
Dichas tcnicas tienen un campo de aplicacin muy amplio.
Las muestras utilizadas son muestras lquidas tanto de suero como de lquido cefalorraqudeo en donde
se cuantifican tanto antgenos como anticuerpos. Estos mtodos exigen aparatos especiales tales como el
fluormetros o espectofluormetros, capaces de detectar con exactitud la seal que son emitidas por la muestra.
Dichas tcnicas se conocen con el nombre de inmunofluorimetria.
Tambin se utilizan en cortes de tejidos y cultivos celulares. Aqu se puede detectar y localizar el antgeno,
anticuerpo, complemento y reaccin antgeno-anticuerpo. Esto permite el diagnstico rpido de enfermedades
microbianas al ser localizado el agente causal en un determinado tejido o clula, tambin sirve para marcar
ciertas hormonas y enzimas.
En estas tcnicas citoqumicas o histoqumicas es necesaria la presencia de un microscopio de
fluorescencia para que pueda realizarse el anlisis de los resultados. Tiene este tipo de microscopio como
caracterstica diferenciadora de los microscopios pticos convencionales, un sistema de iluminacin especial y
una fuente de luz en regin del espectro electromagntico que se corresponde al mximo de absorcin de los
fluorocromos utilizados.
En base a todo ello y por su utilidad en estas tcnicas, los microscopios utilizados para
inmunofluorescencia, son como su propio nombre indica microscopios de fluorescencia que son aquellos que
poseen una fuente de luz ultravioleta (lmpara de mercurio o xenn entre otras) que sirve para excitar a los
fluorocromos y un sistema ptico con filtros de barrera que solamente permiten el paso de la longitud de onda
visible apropiada hacia el usuario, eliminando la radiacin UV, peligrosa para nuestra retina. Los filtros de
excitacin son utilizados para seleccionar la longitud de ondas adecuada para activar el fluorocromo a utilizar.
Los primeros microscopios de este tipo empleaban una iluminacin convencional (trans-iluminacin), en donde la
luz proviene desde debajo de la lamina o portaobjetos, y debe atravesar tanto a estas como a la muestra (ej. un
tejido), para finalmente general la fluorescencia que va a ser visualizada por el usuario. Posteriormente se
desarrollaron los microscopios epi-luminacin, en donde gracias a un aditamento ptico denominado lente
dicroico, o espejo dicroico, es posible iluminar la muestra desde arriba, a travs de la misma ruta que sigue la luz
visible percibida finalmente por el usuario.
91

Fig. 7.4. Microscopio de fluorescencia con epi-iluminacin.
En la Fig. 7.4. a izquierda se muestra la ubicacin del sistema de epi-iluminacin en el microscopio. Un
diagrama simplificado de los componentes pticos principales (derecha) muestra el filtro de excitacin, que deja
pasar solamente la longitud de onda deseada (2), la cual es reflejada por el espejo dicroico hacia la muestra. Este
componente deja pasar la luz fluorescente generada por el fluorocromo (4, 5), la cual es seleccionada an ms
(4) por el filtro de barrera, antes de llegar al observador.
Por otro lado la muestra para inmunofluorescencia consta de una preparacin especial para evitar la
inactivacin de los antgenos. Para lo mismo los tejidos de biopsia y sustratos empleados debern ser
conservados inmediatamente en nitrgeno lquido a - 70C. Posteriormente se corta el criostato y se coloca
sobre portas para proceder a su tincin.
7.2.3.2 Inmunofluorescencia directa
Se puede decir que esta tcnica la de inmunofluorescencia directa es una tcnica sencilla y rpida de
realizar, pero tiene el problema de ser una tcnica cuyo coste es elevado ya que para esta se emplean anticuerpos
monoclonales (AcMo) marcados con fluorescencia, especficos para cada determinacin.
Dicha tcnica es utilizada en algunas tcnicas de diagnstico microbiolgico donde se pone de manifiesto la
presencia o ausencia del germen, cul sea, en la muestra del paciente, muestra que pertenece a una muestra de
tejido en donde se detectan antgenos con ayuda de antgenos especficos marcados con fluorocromo frente al
germen en estudio, antgenos que no son detectados en suero de dicho paciente.
Dicha tcnica se realizara de la siguiente forma:
1. Se extiende la muestra en un porta, para que los antgenos queden pegados al mismo
porta.
2. Una vez pegados los antgenos al porta se le aade anticuerpos marcados frente al
germen que se quiere detectar.
3. Se lava la muestra con agua, con ello todos los anticuerpos no unidos desaparecen.
4. Se observan estos anticuerpos unidos al microscopio de fluorescencia donde se ve la
presencia de color verde en aquellos antgenos donde encontremos anticuerpos
marcados con fluorocromo.
Por otro lado esta tcnica es utilizada cada vez con ms frecuencia en la determinacin de antgenos
leucocitarios (CD) y antgenos de histocompatibilidad (HLA).
92

Estas tcnicas van asociada a otra y en su conjunto forman la citometra de flujo que se estudiar ms
adelante en prximos captulos.
7.2.3.3 Inmunofluorescencia indirecta (IFI)
Tcnica muy utilizada tanto en citoqumica como en histoqumica mediante la determinacin de
anticuerpos en suero empleando para lo mismo, un anticuerpo conocido y una antigammaglobulina marcada con
fluorocromo.
Esto tiene la ventaja de emplear la gammaglobulina utilizada para muchas otras determinaciones.
S emplea para el diagnostico microbiolgico de gran cantidad de grmenes.
Por otra parte presenta dicha tcnica un amplio campo de utilizacin en la detencin de auto-anticuerpos
en pacientes que pueden presentar trastornos autoinmunes.
En muchos casos dicha tcnica es ms sencilla que otras tcnicas tales como los ensayos de fijacin del
complemento o tcnicas de precipitacin.
Para detencin de auto-anticuerpos se emplean sustratos celulares que contienen sus antgenos
correspondientes.
Con todo ello tendremos distintos anticuerpos detectados en distintas partes de nuestro organismo
dependiendo del tipo de anti-anticuerpo as como en algunos animales tales como ratas, ratones y monos entre
otros dependiendo del tipo de anti-anticuerpo tal y en el caso los humano.
El sustrato que utilizado para dicha tcnica est formado por tres tipos de tejidos que son estomago,
hgado y rin de rata lo que permite identificar varios auto-anticuerpos distintos que son: anti-nucleares (ANA),
anti-mitocondriales (AMA), clulas parietales (PCA), anti-msculo liso (ASMA) y anti-microsomas (LKM).
Adems de estos sustratos existen otros sustratos que son empleados tambin con frecuencia, estos son
los HEp2, que son lneas de clulas que proceden de un tumor de laringe humano lo que permiten detectar auto-
anticuerpos frente a los anticuerpos procedentes de la divisin celular. Y la Crithidia Luciliae, protozoo
hemoflagelado que permiten la detencin de anti-cuerpos anti-DNA.
Con todo esto la aparicin de fluorescencia en determinadas clulas o tejidos permite determinar el tipo
de auto-anticuerpo presente en el suero de en un paciente.
En esta tcnica es fundamental la experiencia del personal al interpretar los resultados, para una
adecuada interpretacin de los mismos. Adems dependiendo del sustrato que se emplee se obtienen distintos
patrones de fluorescencia que son indicadores de la presencia de uno u otro anticuerpo en el suero del paciente.
As se obtiene anticuerpos anti-nucleares (ANA), que se detectan sobre sustratos de hgado o rin de
rata, y se presentan bsicamente en 4 patrones de fluorescencia que son:
Homogneo aparece una fluorescencia difusa por la totalidad del ncleo celular que se
corresponde con la presencia de anticuerpos que se dirigen frente al ADN e histonas
(protenas unidas a ADN).
Lo podemos encontrar en gran cantidad, es decir a titulo elevado en enfermedades tales como: lupus
eritematoso sistmico (SLE), lupus inducido por frmacos y artritis reumatoide.
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Perifrico aparece con mayor fluorescencia en la periferia del ncleo que en el centro del
mismo lo que indica presencia de anticuerpos frente al ADN de doble cadena. Dicho patrn
es muy especfico en el lupus eritematoso sistmico.
Moteado aparece gran cantidad de motas fluorescentes de tamao variable, lo que es
indicativo de presencia de anticuerpos frente a antgenos que son extrables del ncleo
(ENAS), estos pueden ser variables.
Se presenta dicho patrn en enfermedades como lupus, enfermedades mixtas de tejido conectivo,
esclerodermia y sndrome de Sjgren (enfermedad del sistema inmune).
Nucleolar presenta una mancha fluorescente en el interior del ncleo que corresponde
con el nuclolo, lo que es indicativo de la presencia de anticuerpos frente al RNA nucleolar.
Dicho patrn se detecta en enfermos de esclerodermia.
Todos esto patrones son ms numerosos si se emplean clulas HEp2, ya que se pueden observar la
presencia de clulas en metafase e interfase (dos etapas de la divisin celular), con lo cual dicha interpretacin
gana en especificidad a la vez que es ms compleja.
En dicho sustrato celular podemos observar o no la presencia de anticuerpos localizados
citoplasmticamente, entre los que se encuentran el anti-msculo liso, anti-mitocondrial M2 y anti-LKM, todos
ellos relacionados con enfermedades hepticas.
Por todo lo expuesto en dicha tcnica se puede decir que esta tcnica la de inmunofluorescencia indirecta
es muy til en el campo de la autoinmunidad, en tcnicas de este tipo tales como screening diagnstico, dado que
permite hacer un seguimiento a los anticuerpos y visualizar al mismo tiempo, dichos anticuerpos tanto de
localizacin celular como citoplasmtica. Dicha visualizacin puede ser tanto cualitativa como semicuantitativa.
Sin embargo posee inconvenientes dado la dificultad para estandarizar, lo que da lugar a producir
reacciones inespecficas, necesitando para ello personal experimentado, con lo cual la interpretacin es en cierta
medida subjetiva.
7.2.3.4 Inmunofruorescencia en sndwich o bocadillo
Tcnica que es utilizada para determinacin en este caso no de antgenos sino de anticuerpos en tejido
de un paciente, en esto se puede decir que dicha muestra de tejido pertenece fundamentalmente a una muestra
procedente de una biopsia.
Dicha tcnica se realiza de la siguiente forma:
1. Se obtiene un anticuerpo pegado a un porta, que pertenece a un trozo de tejido.
2. A este anticuerpo se le aade un antgeno conocido, especfico con el que formara el
complejo antgeno-anticuerpo.
3. Seguidamente se hace un lavado donde es eliminado el exceso de antgenos que se
produce.
4. Despus de esto se le aade un anticuerpo especifico marcado con fluorescencia con lo
cual dicho anticuerpo se pega al complejo antgeno-anticuerpo quedando finalmente
formado el complejo anticuerpo-antgeno-anticuerpo. De estos dos anticuerpos
formados, el segundo es el que se marcado con fluorescencia (fluorocromo).

94

7.3. Otras tcnicas de fluorescencia

7.3.1. Introduccin
Una de las tcnicas que ha revolucionado la inmunofluorescencia actualmente es la combinacin con la
microscopia confocal, en la cual es posible analizar en gran detalle la morfologa de clulas vivas, marcadas con
diversas sondas fluorescentes, y logrando una reconstruccin tridimensional de las imgenes a travs de
iluminacin con luz lser y manejo computerizado de los datos. Por otro lado, la citometra de flujo, que
igualmente aprovecha el marcaje inmunofluorescente de clulas, la cual se ha convertido en una tcnica de gran
poder y utilidad en el laboratorio, como se describe a continuacin.
7.3.2 Citometra de flujo
La citometra de flujo empleara un instrumento capaz de identificar clulas aisladas que influirn a travs
de fuentes de excitacin en un medio lquido.
Esta tecnologa ser nica a la hora de facilitar anlisis rpidos, cuantitativos y multiparamtricos de
clulas individuales. La medida de la luz visible y fluorescente emitida permitir cuantificar las caractersticas
fsicas, bioqumicas y antignicas de cada una de las clulas de la muestra. Al mismo tiempo podr separar
distintas subpoblaciones celulares basndose en esas caractersticas. A dicha tecnologa se le llamara clasificacin
celular electrnica.
La citometra de flujo tendr dos aplicaciones generales que sern:
Anlisis cuantitativo.
Separacin celular.
Se realizara una representacin grfica de los parmetros analizados en cada clula que se llamara
histograma. En este histograma se incluirn tanto el nmero de clulas como el valor de una o ms caractersticas
estudiadas.
La tcnica se compondr de 3 fases distintas pero interdependientes:
Fase previa en donde se realizara la preparacin de la muestra y los reactivos, y la
tincin de la muestra con reactivos fluorescentes.
Fase de citometra donde se desarrollara la tcnica y se recogern los datos analizados.
Fase de anlisis de los parmetros obtenidos.
Estas tres fases podrn ser desarrolladas por el mismo individuo en el curso de un solo da, o por el
contrario ser realizadas por tres personas diferentes en momentos distintos.
Por otro lado se puede decir que estos sern aparatos bastante complejos los cuales constaran de un
sistema de aspiracin y flujo de la muestra que har pasar las clulas una a una a travs de una fuente de
excitacin. Esta fuente ser un lser monocromo que emitir a diferente longitud de onda dependiendo del gas
utilizado.

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Las seales emitidas por la muestra irn a cuatro detectores que sern:
Dos de dispersin de luz.
Dos de fluorescencia.
Los detectores de dispersin de luz irn uno hacia delante y otro en ngulo resto, los cuales permitirn
obtener datos del tamao, granularidad y complejidad de la clula.
Los detectores de fluorescencia se situarn en ngulo resto y las seales se seleccionaran mediante filtros
adecuados y espejos dicroicos. Los fluorocromos ms empleados sern el Isotiocianato de fluorescencia (FITC) y la
Ficoeritrina (FE), que tendr la ventaja de absorber luz a misma longitud de onda pero emitiendo una luz muy
diferente.
Ambas sustancias absorbern luz a 488nm. Luz que proceder de un lser con in argn, pero el FITC
emitir fluorescencia verde a 530 nm. Y el FE emitir fluorescencia naranja a 575 nm.
Una vez que las clulas pasan a la fuente de excitacin entrarn en un sistema electrnico de clasificacin
celular que las separara en funcin de alguna de las caractersticas analizadas.
Todos estos pasos sern realizados a una velocidad extraordinaria y permitir el anlisis de grandes
volmenes celulares en corto periodo de tiempo.
Los resultados se procesarn obtenindose varios tipos de representaciones graficas (histogramas).
Dado que las principales aplicaciones del citmetro de flujo sern el contaje y la clasificacin celular, esta
tcnica ser muy empleada en laboratorios de hematologa, inmunologa y oncologa.
96

Fig. 7.5. Esquema de un citmetro de flujo e interpretacin grafica del mismo

97

7.4 Principales tcnicas de inmunofluorescencia
La principal tcnica de inmunofluorescencia es la siguiente:
Deteccin de anticuerpos anti-msculo liso tcnica que se realiza es el test SMA donde se
enfrentan los posibles anticuerpos circulantes en la muestra a un sustrato que contiene
clulas de msculo liso.
Dichos anticuerpos no son especficos de una especie solamente y pueden encontrarse en tejidos con
rea de msculo liso. Estos son principalmente inmunoglobulinas tipo IgM.
Para ello se utiliza como sustrato secciones congeladas de estomago de rata.
De todas las reacciones que se producen la primera reaccin enfrentara los anticuerpos presentes en la
muestra del paciente a su homlogo los antgenos del msculo liso. Esto es llevado a cabo durante el periodo de
incubacin en el cul el suero recubre la superficie del antgeno.
Una segunda reaccin tiene lugar a continuacin del lavado que eliminara los anticuerpos humanos no
ligados. El reactivo utilizado en un conjugado no fijado y se observa a travs del microscopio de fluorescencia.
En esto un brillo fluorescente en el citoplasma de las capas del msculo liso de la mucosa sustrato que
indica un resultado positivo.
En los ltimos aos las investigaciones han demostrado que el antgeno activo en la reaccin de SMA es la
actina. Esta dentro de su estructura histolgica tales como: tubos capilares, plaquetas, bordes del epitelio tubular
renaly en clulas glomedulares del rin.
Estos anticuerpos que intervienen en esta tcnica no son rgano-especficos y pueden reaccionar con
msculo liso de arterias circundantes, venas y otras estructuras histolgicas que contienen actina.
Por ltimo se puede decir que en las clulas de mucosa gstrica (parietales o principales) o tincin
ncleolar, es en el test ANA donde no debe considerarse SMA como positivo.

UNIDAD DIDCTICA VIII
TCNICAS BASADAS EN REACCIONES MARCADAS CON
RADIOISOTOPOS

101

8.1 Introduccin a la reaccin de radioinmunoensayo
8.1.1 Concepto

El radioinmunoensayo o RIA es una tcnica puesta en marcha Berson y Yalow, la cual consiste en
enfrentar la sustancia buscada en la muestra problema a una muestra radiomarcada, es decir marcada con una
sustancia radiactiva que utiliza el principio de inhibicin competitivo de la unin de un complejo antgeno-
anticuerpo con una molcula de antgeno-marcada radiactivamente con uno de los muchos radiactivos marcados
que pueden ser utilizados.
La evaluacin de los resultados obtenidos se ejecuta, posteriormente, mediante el recuento de
radiactividad desprendida del complejo formado.

8.1.2 Elementos necesarios para la realizacin de las tcnicas RIA
8.1.2.1 Ligandos
Los ligandos o ligantes son aquellos elementos capaces de fijarse a una sustancia con alta afinidad y
especificidad.
Los ligandos ms utilizados son los anticuerpos. Estos pueden ser fabricados, incluso, contra sustancias de
baja capacidad inmunognica, al unirse a un portador adecuado como el caso de una protena y as ser
transformadas en un hapteno.
Tambin se pueden emplear otros ligandos como son las protenas de fijacin naturales. stas tienen la
desventaja de poseer menor afinidad y especificidad irregular. Adems estas solo existen para un nmero
reducido de sustancias tales las globulinas plasmticas transportadoras de las hormonas tiroideas. Con esto se
puede decir que la tcnica que utiliza las protenas de fijacin recibe el nombre de radioensayos.
Otras estructuras potenciales que son utilizadas como ligandos son los receptores de la membrana
celular. Estos son complejos moleculares que se encargan del reconocimiento y la interaccin selectiva de estos
ligandos con la porcin biolgicamente activa de una enzima como el caso de un frmaco. Lo que ocurre es que
pueden ser estos ligandos bastantes inestables al poderse alterarse en el proceso de los tejidos en donde est
presente.
8.1.2.2 Marcadores radiactivos
Las molculas indicadoras llamadas ligandos o antgenos utilizadas en estas tcnicas pueden ser marcadas
con distintos istopos radiactivos.
Pueden emplearse marcadores isotpicos que emiten radiaciones , como el tritio (
3
H) aunque son ms
usados otros istopos que emiten raciones tales como
57
Co,
75
Se,
131
I y
125
I. De todos estos el ms utilizado es el
125
I.
Por otra parte el proceso este de marcar la molcula indicadora acarreara una reduccin de su
inmunoreactividad lo que puede tener que necesitar de algunos requisitos como el caso del marcador con
istopos del yodo (I), que debe poseer como molcula indicadora residuos de tirosina.
8.1.2.3 Sistemas de separacin
Esta no es una tcnica homognea, es decir, para el recuento de la radiactividad se proceder,
previamente a la separacin de las molculas indicadoras fijadas o lo que es lo mismo fraccin ligada, de las no
fijadas o fraccin libre.
102

Esto puede ser llevado a cabo de distintas maneras, de la forma siguiente:
Proceso de precipitacin de fraccin ligada mediante sustancias tales como sulfato amnico
con lo cual la fraccin libre se queda en disolucin.
Forma de precipitacin basada en la absorcin de la fraccin libre por productos como el
carbn activado, talco o florisil.
Pese a esto, el mtodo ms se utiliza consiste en recubrir con antgenos o anticuerpos, segn el caso, un
soporte slido que es la pared interna de un tubo o los pocillos de una placa a la que van a ligarse, de forma bien
directa o indirectamente algunas molculas indicadoras.
Tras todo esto la fraccin libre puede ser eliminada fcilmente mediante lavado, por determinacin en
fase slida.
8.1.2.4 Instrumentos de medida
La radiactividad resultante del marcaje con istopos radiactivos se cuantificara mediante el aparato
llamado contador gamma o bien con el aparato llamado de centelleo lquido.
El uso de uno u otro aparato depender del tipo de radiacin emitida por el marcador radiactivo que se
vaya a utilizar. As si el istopo emitiera radiacin se utilizara un contador gamma mientras que si la radiacin
emitida fuera se empleara un contador de centelleo lquido.
Las unidades en las que ser medida la radiactividad sern las cuentas por minuto (CPM).

8.2 Tipos de radioinmunoensayos (RIA)
8.2.1 RIA convencional
En este tipo de RIA ocurre lo siguiente:
1. Un antgeno es adherido, previamente, a un soporte slido, es decir es sensibilizado.
2. Tras ellos se aade a lo precedente, la muestra problema que puede contener el antgeno
buscado y dirigir con ello esto especficamente contra ese antgeno. En esto las protenas que no
fijadas al antgeno son eliminadas mediante lavado.
3. Despus se le agrega a todo lo anterior un ligando de los explicados anteriormente, que es
generalmente una anti-inmunoglobulina marcada con un istopo radiactivo que tiende a su vez a
fijarse al anticuerpo.
4. Por ltimo, es evacuado mediante lavado el ligante radiomarcado libre que es cuantificado de
forma radiactiva, cuantificando la radiactividad desprendida del soporte slido y que procede del
ligante radiomarcado fijado, a travs del anticuerpo, al antgeno.
Con todo esto cuanto mayor es la radiacin medida, ms anticuerpos problemas deben haber en la
muestra.

103

Fig. 8.1. Esquema de un RIA convencional (radioinmunoensayo convencional)

8.2.2 RIA competitivo
En el RIA competitivo, el soporte slido es sensibilizado, generalmente con un anticuerpo especfico para
un antgeno.
Este tipo de RIA se realizado de siguiente forma:
1. Primeramente se pone en contacto el soporte slido, sensibilizado mencionado
anteriormente con una muestra problema en la que se sospeche la presencia del antgeno
que se busca.
2. Seguidamente dicha muestra es puesta en contacto con un reactivo preparado a base del
mismo antgeno pero este marcado con un istopo radiactivo.
3. Con todo esto anterior el antgeno problema compite con el antgeno radiactivo por su
unin al anticuerpo, de forma que a mayor concentracin del antgeno en muestra
problema, menor debe ser la cantidad de antgeno radiactivo marcado que debe fijarse al
anticuerpo.
104

4. Tras todo esto se elimina, mediante lavado, el antgeno radiomarcado no ligado, es decir el
antgeno radiomarcado libre.
5. Finalmente y por ltimo se cuantifica la radiactividad desprendida del soporte slido,
sensibilizado que proceda del antgeno radiomarcado fijado al anticuerpo.
Con todo esto se puede decir que a menor radiacin medida, menos antgenos radiomarcados se habrn
ligado, y por lo tanto mayor debe ser la concentracin de antgenos en la muestra.
Adems de este RIA competitiva existe otra clase de RIA competitiva en la que, en vez de utilizar un
antgeno radiomarcado, se utiliza un anticuerpo radiomarcado, el cual recibe el nombre de ensayo
inmunorradiomtrico competitivo.
Fig. 8.2. Esquema de un RIA competitivo

105

8.3. Lectura de los resultados
En estas tcnicas las de RIA, es recomendable analizar el blanco (preparado sin marcador radiactivo), la
muestra problema y cada uno de los patrones por duplicado.
Una vez terminado el ensayo se calcula la media (X) de los resultados que se obtengan con cada par de
determinaciones y seguidamente, se calcula las cuentas netas o N.C. conseguidas con la muestra y patrones
quedando esto de la siguiente forma:
N.C. = X CPM (de muestra o patrn) X CPM del blanco
En el RIA competitivo, adems se calcula el porcentaje de ligamiento o P.B. logrado con la muestra y con
cada patrn de la siguiente manera:
P.B.= B/B
0
100
Donde:
P.B.= porcentaje de ligamento.
B = cuentas netas de muestras o patrones.
B
0
= cuneta neta de los porcentajes que carecern de antgeno sin marcar y con el que se obtienen, por lo
tanto, un mximo de ligamento del antgeno radiomarcado.
Finalmente para terminar, se traza en un papel semi-logartmico, una curva de calibracin. Para ello, se
sita, en ordenadas las cuentas netas o los porcentajes de ligamiento, segn el caso, conseguidos con los
patrones en eje de ordenadas de dicha muestra mientras que en el eje de abscisas, los valores de concentracin
con los que debe corresponderse.
La conservacin de la sustancia analito en muestra problema se halla mediante la interpolacin del
analito por curva de calibracin.
El RIA es una tcnica especfica y muy sensible, pero sin embargo, necesita para ser llevada a cabo la
presencia de aparatos costosos y sobre todo supone un riesgo para la salud de los que la realizan.

CAPITULO IX
TCNICAS BASADAS EN LA REACCIN ENZIMTICA

109

9.1 Introduccin a la reaccin de enzimoinmunoanlisis
9.1.1 Introduccin
Estas tcnicas son aquellas que utilizan enzimas como marcadores inmunoqumicos de complejos
antgeno-anticuerpo. El hecho de que una pequea cantidad de enzima pueda catalizar una gran cantidad de
sustrato permite amplificar la reaccin antgeno-anticuerpo de forma que se hace posible detectar cantidades
muy pequeas, minsculas de antgeno-anticuerpo en las muestras estudiadas.
Por ello estas tcnicas compiten con los mtodos RIA (radoinmunoanalisis) descritas en el capitulo
anterior, ya que en esta adems de su gran sensibilidad presentan menos riesgos en el manejo de los reactivos as
como un tiempo de conservacin de los mismos ms prolongado, como ya se explico.
Fundamentalmente existen dos tipos de enzimoinmunoanlisis (EIA) que son:
Homogneo en el cul el complejo antgeno-anticuerpo es el encargado de modular la
actividad enzimtica.
Heterogneo en el cul se hace necesario un paso previo a la separacin de los complejos
antgeno-anticuerpo para poder medir as de esta forma la actividad enzimtica.
En ambos casos, el enzima que se utiliza debe cumplir unos requisitos mnimos que son:
El deber de estar altamente purificado y ser obtenido de forma econmica.
El deber de poseer una actividad especfica asociada.
El no deber de estar dicha enzima utilizada en los lquidos biolgicos en cantidades
suficientes para que estas puedan interferir en la determinacin.
Adems de todo esto el enzima utilizado necesita para ser conjugado con el antgeno o el anticuerpo un
reactivo bifuncional (es decir con capacidad para realizar dos funciones) que es en la mayora de los casos el
glutaraldehdo.

9.2 Tipos de enzimoinmunoanlisis (EIA)
9.2.1 EIA homogneos
Este es un mtodo de anlisis sencillo y rpido que permite la automatizacin, aunque su sensibilidad sea
menor que la de los heterogneos.
Son utilizados fundamentalmente en determinaciones de hormonas y medicamentos.
Existen varios tipos de EIA homogneos aunque todos tienen en comn el hecho de que la reaccin
antgeno-anticuerpo es el modulador de la actividad enzimtica, que se puede medir sin la necesidad de separar
los componentes marcados enzimticamente de los no marcados.
Entre los EIA homogneos existentes, el ms empleado es el denominado EMIT (tcnica de
enzimoinmunoanlisis multiplicado), que utiliza el enzima para marcar el hapteno buscado que es hormona,
medicamento o droga generalmente. Frente a dicho conjugado se utiliza un anticuerpo especfico para el hapteno
110

que al unirse a l, inhibe la actividad enzimtica. El mecanismo que probablemente se utiliza es el de que el
anticuerpo que impide cambios conformacionales en la molcula del enzima dificultandose as su actuacin.
En el ensayo de la EIA homognea ms empleada, el EMIT (tcnica de enzimoinmunoanlisis
multiplicado), en donde se produce competencia entre el hapteno marcado enzimticamente por sitios de unin
del anticuerpo anti-hapteno. Seguidamente se mide la actividad enzimtica que persistir despus de dicha unin
del hapteno con su anticuerpo correspondiente, que es directamente proporcional a la concentracin de hapteno
libre en la muestra que se va estudiar.
En este tipo de anlisis los enzimas ms utilizados son el malato-deshidrogenasa y la glucosa-6-fosfato-
deshidrogenasa, ya que estas son las que presentan menos interferencias con los componentes del suero,
sustancias que tras todos estos pasos anteriores producen el complejo antgeno-anticuerpo-antgeno (sustrato).
Fig. 9.1. Inactivacin del enzima por unin del hapteno al anticuerpo en las tcnicas EIA homogneas
tambin conocidas como ELISA.
Fig. 9.2. Ensayo EMIT en tcnicas ELISA
9.2.2 EIA heterogneos (ELISA)
Este tipo de anlisis es el que presenta mayor sensibilidad y sus principios se asemejan mucho con los de
la radioinmunoanlisis estudiados en el captulo anterior.
Para poder medir la actividad enzimtica en estas tcnicas es necesario un paso previo de separacin de
componentes marcados, que pueden darse por precipitacin o bien por utilizacin de un antgeno o anticuerpo
fijado a una fase slida.
111

Este ltimo mtodo de anlisis es uno de los ms utilizados y recibe el nombre genrico de ELISA, que es
como se les conoce a las EIA heterogneas.
Esta tcnica la ELISA es una tcnica que permite detectar tanto la presencia de antgenos cmo de
anticuerpos la cual consiste en una enzima conjugada a un anticuerpo que reacciona con el sustrato adecuado
produciendo color.
Entre las enzimas utilizadas tenemos la peroxidasa de rbano picante, la fosfatasa alcalina y la glucosa
oxidasa.
Existen tres tipos de tcnicas de ELISA que sern las siguientes:
Sndwich.
Captura.
Competitivo.
9.2.2.1 Tipos de EIA heterogneos (ELISA)
ELISA sndwich
En esta tcnica si el anlisis se realiza para la determinacin del antgeno que se presenta en una muestra
cul sea, se utiliza un anticuerpo especfico fijado a una fase slida como las paredes del tubo de ensayo o pocillo
de la placa de microtitulacin.
Esta tcnica ser lleva a cabo mediante los siguientes pasos:
1. Se incuba el suero problema que contiene el antgeno buscado en el pocillo con el anticuerpo
especfico.
2. Seguidamente se procede al lavado de dicho pocillo para poder eliminar los componentes del
suero que no haya reaccionado.
3. Despus de esto se aade los anticuerpos marcados enzimticamente que son los que se unen al
antgeno del suero por otro determinante antignico (ya mencionado en captulos anteriores),
formndose con esto el llamado sndwich, dando lugar al complejo anticuerpo-antgeno-
anticuerpo.
4. Se incuba la muestra tras todo lo anterior y se procede a otro lavado para eliminar el exceso del
anticuerpo conjugado que no haya reaccionado.
5. A esto se le aade el sustrato cromognico especifico del enzima una vez que haya sido realizados
todos los pasos anteriores con lo que se produce un color cuya intensidad es medida de forma
espectofotomtrica. Dicha intensidad es proporcional a la concentracin de antgeno que se
presente en la muestra problema.
En estos casos en los que el anlisis se realiza para buscar antgenos en el suero problema, se usan
pocillos recubiertos con el antgeno especfico. El resto del ensayo es similar al descrito anteriormente.

112

Fig. 9.3. Tcnica de ELISA En sandwich
ELISA de captura
Esta tcnica es utilizada fundamentalmente en detencin de anticuerpos en la muestra problema. En ella
se emplea un anticuerpo anti-inmunoglobulina humana fijada a la fase slida.
Los pasos a seguir en esta tcnica son:
1. Primero incubar la muestra con anticuerpos fijados a las paredes del pocillo.
2. Seguidamente lavar la muestra con la que los anticuerpos presentes en la muestra unidos al anti-
Ig humano y el resto eliminado.
3. Posteriormente aadir un antgeno especfico para el anticuerpo que se busca e incubar para ser
lavados otra vez a continuacin.
4. Tras todo esto se aade un anticuerpo especfico para el antgeno de la etapa anterior, pero ya
marcado enzimaticamente.
113

5. Por ltimo se adiciona un sustrato cromognico especfico de ese enzima con lo que se produce
un color de intensidad directamente proporcional a la concentracin de anticuerpo presente en la
muestra problema.

Fig. 9.4. Tcnica de ELISA de captura
ELISA competitivo
Esta es una tcnica basada en la determinacin sobre todo de antgenos. En el caso de que se quiera
cuantificar el antgeno presente en la muestra, se usa un anticuerpo especfico que se fija a una fase slida.
Los pasos que se siguen en esta tcnica son:
1. Primeramente al pocillo con el anticuerpo fijado se la aade la muestra problema con el antgeno
buscado, y ese mismo antgeno marcado enzimticamente.
2. Seguidamente se incuba producindose una competencia por el sitio donde se produzca la unin al
anticuerpo.
3. Tras lo anterior se lava el exceso que no se halla unido y se aade el sustrato especfico del enzima con
lo que se produce un color que es inversamente proporcional a la concentracin del antgeno presente
en la muestra.
114

Fig. 9.5. Tcnica de ELISA competitivo

9.3 Muestras y reactivos necesarios
Este caso es de vital importancia el correcto manejo de las muestras y reactivos, para evitar la posible
degradacin de antgenos y anticuerpos utilizados.
Tambin tiene importancia evitar reacciones inespecficas con otros componentes para que no puedan
producirse falsos positivos.
En cuanto a los sustratos que se emplearan, se debe usar los ms especficos para el enzima que se vaya a
utilizar, as se consigue aumentar al mximo la actividad cataltica. Siempre debe aadirse sustrato en cantidad
suficiente para evitar que se agote ante gran cantidad de enzima.
Debido a que la actividad enzimtica puede ser disminuida por inadecuada manipulacin del enzima, se
debe procurar mantener las condiciones ptimas de trabajo, as como la temperatura, el pH y la fuerza inica del
buffer, que se establecen para cada enzima.
Por otro lado la sensibilidad de la tcnica debe depender en gran medida del correcto cumplimiento de
dichas condiciones y utilizacin de espectrofotmetro que debe ser adecuado para la lectura de los resultados.

115

9.4 Cuantificacin de anticuerpos y antgenos mediante ELISA
9.4.1 Introduccin
La mayora de las tcnicas inmunoenzimticas utilizadas en el trabajo clnico se realizan con juegos de
reactivos comerciales, en donde el mtodo ha sido previamente desarrollado y optimizado, y todo el material
est listo para su uso. En el trabajo de investigacin, o en aplicaciones no rutinarias de estos mtodos, puede ser
necesario utilizar una tcnica inmunoenzimtica para un propsito particular.
A continuacin daremos una gua general, tanto para la cuantificacin de antgenos como de anticuerpos.
9.4.2 ELISA para cuantificacin de anticuerpos
Para la cuantificacin de anticuerpos mediante tcnica de ELISA realizaremos los siguientes pasos:
1. Recubrir placas con el antgeno de inters (100 l/hoyo), diluido en amortiguador de recubrimiento.
Incubar por un periodo de tiempo comprendido entre 10-16 horas a temperatura ambiente. En esto
la cantidad optima de antgeno se encontrara en el mbito 0,05-5 g/hoyo, y puede determinarse
en pruebas preliminares, con una cantidad fija de suero y cantidades variables del antgeno. Es
recomendable escoger la mnima cantidad de antgeno capaz de proporcionar la mxima seal.
2. Decantar y agregar 100 l/hoyo de albmina bovina (u otra protena irrelevante para l sistema) al
1% de PBS (si se va a trabajar con peroxidasa), durante un periodo de tiempo comprendido entre 30-
60 minutos, para bloquear o saturar los sitios libres del plstico.
3. Lavar 5 veces las placas con amortiguador de lavados (PBS-Tween o FALC). Secar a temperatura
ambiente y guardar en refrigeracin (incluso meses, protegiendo de la humedad), hasta su uso.
4. Diluir seriadamente las muestras de suero a titular, con PBS al 1% de albmina o con FALC al 1% de
albmina (segn la enzima a utilizar), con factor de dilucin (FD)=2 o factor de dilucin (FD)=3. Por lo
general, se parte de una dilucin de suero 1/100 o 1/200, por alta sensibilidad de la tcnica. Colocar
las distintas diluciones (100 l) en los hoyos, que sern 96 por placa, en donde se hace indispensable
la utilizacin de una hoja de registro con un diagrama de posiciones de la muestra, preferiblemente
por triplicado. Dejar un hoyo para el control de sustrato (blanco). Incluir un suero control positivo (si
se tiene) y un suero normal (negativo), tratado de igual mantera que las muestras. Cuando se corren
varias placas simultneamente, la inclusin de estos controles en cada una, permite evaluar la
reproducibilidad y la validez de las comparaciones. Incubar por un tiempo en torno a 1-2 horas a
temperatura ambiente.
5. Lavar 5 veces con amortiguador de lavados (PBS-Tween o FALC). No dejar secar las placas. Tener
siempre preparada la solucin del paso siguiente, antes de descartar o aspirar por quinta vez la
solucin de lavado.
6. Agregar al conjugado anti-inmunoglobulina/enzima (100 l/hoyo) adecuado para la especie de la
que provengan los anticuerpos a detectar, en dilucin previamente determinada. Es conveniente
utilizar conjugados anti-inmunoglobulinas/enzima comerciales (de preferencia purificados mediante
inmunoafinidad), los cuales funcionan bien a altas disoluciones (ej. 1/2000-1/10000). Diluir el
conjugado en amortiguador con 1% de protena irrelevante. Incubar por un periodo comprendido
entre 1-2 horas a temperatura ambiente.
7. Lavar 5 veces con el amortiguador de lavados correspondiente (PBS-Tween o FALC).
8. Agregar el sustrato correspondiente a la enzima (100 l/hoyo), preparado al momento y protegido
de la luz. Incubar a temperatura ambiente hasta obtener un color adecuado (seal de fondo 0,1-0,2
y seales mximas cercanas a 1,5-2,0). La reaccin ser por lo general muy rpida con peroxidasa de
5 a 30 minutos, y ms lenta entorno a 15-60 minutos con fosfatasa. Detener la reaccin (en los
ensayos que utilizan fosfatasa alcalina, no es necesario detener la reaccin si se utiliza un lector
automtico de alta velocidad, ya que la reaccin es relativamente lenta) con 50 l de NaOH 2
M/hoyo (fosfatasa alcalina) o con 50 l de HCl 2 M (peroxidasa). Leer las absorbancias de inmediato
a 405-410 nm (fosfatasa) o 490-492 nm (peroxidasa) en un espectrofotmetro para placas.
116

9. Procesar las lecturas, calculando el promedio y desviacin estndar (SD) de los triplicados. La
magnitud de la SD es un indicador del desempeo personal e instrumental. Los lectores de
microplacas modernos estn equipados con un puerto para comunicacin serial con computadoras,
donde los datos pueden ser analizados con una hoja de clculo o con paquetes de software para
ELISA.
10. Trazar la curva de titulacin para cada suero graficando la absorbancia promedio correspondiente a
cada dilucin la desviacin tpica (SD). Calcular el titulo de cada muestra, interpolando la dilucin
que corresponde a una absorbancia de 0,5. Como ejemplo la siguiente figura:
Fig. 9.6. ELISA para cuantificacin de anticuerpos equinos anti-miotoxina de Bothrops asper.
La Fig. 9.6. presenta a izquierda: curva de referencia en unidades de masa, preparada con estndares de
concentracin conocida de anticuerpos anti-miotoxina equinos purificados mediante cromatografa (que vernos
en siguientes captulos) de inmunoafinidad. Y a la derecha: el diseo de la tcnica; 1. Miotoxina, 0,4 g/hoyo; 2.
Anticuerpos anti-miotoxina (muestra); 3. Conjugado anti-Igs equinas/peroxidasa. La tcnica se utilizo para
estudiar la distribucin in vivo de los anticuerpos equinos contra la toxina, en modelo animal.
9.4.3 ELISA para cuantificacin de antgeno
Para la cuantificacin de antgeno mediante tcnica de ELISA seguiremos los siguientes pasos:
1. Recubrir la placa de los 96 hoyos con los anticuerpos (o antgenos monoclonales) de captura (100
l/hoyo) en amortiguador de recubrimiento. Incubar por un periodo de tiempo comprendido
entre 10-16 horas a temperatura ambiente. En esto debe determinarse la dilucin ptima de los
anticuerpos de manera previa, seleccionando la menor concentracin capaz de proveer una
mxima seal. Esta dilucin puede variar desde 1/250-1/500 hasta 1/5000 o ms, dependiendo
de la afinidad, especificidad y pureza de los anticuerpos de captura. La pureza es un factor crtico,
ya que se busca adherir al plstico la mayor proporcin posible de anticuerpos contra el antgeno
de inters.
2. Decantar y agregar 100 l/hoyo de albmina bovina (u otra protena irrelevante para l sistema)
al 1% en PBS (si se va a trabajar con peroxidasa) o en amortiguador FALC (si se va a trabajar con
fosfatasa alcalina), durante un periodo de 30-60 minutos, para bloquear o saturar los sitios libres
del plstico.
3. Lavar 5 veces las placas con el amortiguador de lavados (i.e. PBS-Tween o FALC). Secar a
temperatura ambiente y guardar en refrigeracin (incluso meses protegido de la humedad),
hasta su uso.
4. Colocar las muestras y los estndares del antgeno (100 l) en sus respectivos hoyos,
preferiblemente por triplicado. Dejar hoyos para el control de sustrato solo (blanco) y para
muestra control (- y +), si estn disponibles. Las muestras deben ser diluidas en solucin con
protena (ej. 1% albmina en PBS o en FALC). Incubar durante 1-2 horas a temperatura ambiente.
117

5. Lavar 5 veces con el amortiguador de lavados correspondiente (PBS-Tween o FALC). No dejar
secar.
6. Agregar 100 l/hoyo del conjugado, en dilucin ptima previamente establecida, en
amortiguador con protena. Incubar durante 1-2 horas a temperatura ambiente.
7. Lavar 5 veces con el amortiguador de lavados correspondientes.
8. Agregar el sustrato correspondiente a la enzima (100 l/hoyos), preparado al momento y
protegido de la luz. Incubar a temperatura ambiente hasta obtener un color adecuado (seal de
fondo 0,1-0,2 y seales mximas cercanas a 1,5-2,0). Detener la reaccin con 50 l de NaOH 2
M/hoyo (fosfatasa alcalina) o con 50 l de HCl 2 M (peroxidasa). Leer las absrobancias de
inmediato a 405-410 nm (fosfatasa alcalina) o 490-492 nm (peroxidasa) en un espectrofotmetro
para placas.
9. Procesar la lectura calculando el promedio y desviacin estndar (SD) de los triplicados. Trazar la
curva de referencia con los valores de los estndares de antgeno, graficando la concentracin vs.
la absrobancia. Calcular los valores de concentracin de la muestra por interpolacin. Las
extrapolaciones no son vlidas, por lo que si una muestra llega al punto mximo de lectura debe
diluirse y analizarse nuevamente. A modo de ilustracin observaremos como ejemplo la imagen
siguiente:
Fig. 9.7. Cuantificacin de toxina tetnica mediante ELISA
La Fig. 9.7. presenta a izquierda: curva de referencia con estndares de concentracin conocida de la toxina.
A la derecha: diseo 1. Suero equino anti-tetnico, 1/3000; 2. Toxina tetnica (muestras); 3. Fragmento C de
toxina; 4. Suero de conejo anti-fragmento C, 1/500; 5. conjugado anti-Igs de conejo/fosfatasa alcalina,
1/2000. La determinacin de toxina tetnica mediante este ELISA muestra buena correlacin con el mtodo
de estimacin de toxina en muestras para la produccin de toxoide y suero anti-tetnico.
9.4.4 Reactivos
Reactivos para el sistema de la fosfatasa alcalina
Amortiguador de recubrimiento (Tris 0,1 M, NaCl 0,15 M, pH 9,0):
12,1 g Tris; 8,7g NaCl; ajustar con HCl y aforar a 1000 ml. Refrigerar.
Amortiguador FALC (Tris 0,05 M, NaCl 0,15 M, ZnCl
2
1 M; 20 M, MgCl
2
1mM, pH 7,4):
6,1 g Tris; 8,7 g NaCl; 0,8 ml de solucin madre de ZnCl
2
0,025 M; 1,0 ml solucin madre de MgCl
2
1 M;
0,2 g azida de sodio; ajustar pH con HCl y aforar a 1000 ml. Refrigerar.
118

Solucin madre ZnC|
2
0,025 M:
0,34 g ZnCl
2
/100 ml
Solucin madre MgC|
2
1 M:
20,3 g MgCl
2
/100 ml
Amortiguador de sustrato para fosfatasa alcalina:
0,5 solucin madre de MgCl
2
; 97 ml dietanolamina; 0,2 g azida de sodio; 1000 ml agua destilada; ajustar
pH a 9,8 con HCl y refrigerar.
Sustrato (p-nitrofenilfosfato):
Al momento, disolver en el amortiguador de sustrato a concentracin final de 1 mg/ml.
Reactivos para el sistema de peroxidasa
Amortiguador de recubrimiento:
Igual que en sistema para fosfatasa alcalina. Asegurarse de que ningn reactivo tenga azida de sodio
(inhibe).
Amortiguador de lavados: PBS-Tween 0,05%, pH 7,2 (fosfatos 0,04 M. NaCl 0,12 M):
15,5 g No
2
EP0
4
.7E
2
0; 3, g NaE
2
P0
4.
E
2
0; 13,5 g NaCl; ajustar pH a 7,2, aforar a 2000 ml y agregar 1 ml
Tween-20.
Amortiguador del sustrato para peroxidasa: citrato de sodio 0,1 M pH 5,0.
29,4 g citrato de sodio2E
2
0(C
6
E
5
No
3
0
7
2E
2
0); ajustar pH a 5,0 y aforar a 1000 ml. Refrigerar.
Sustrato para peroxidasa:
Disolver o-fenilndiamina (OPD) a 2 mg/ml en su amortiguador, al momento, y agregar 4 l de E
2
0
2
al
30% por cada 10 ml de solucin final.
Persulfato de amonio:
Preparar al momento una solucin al 10%. Este reactivo es muy higroscpico (sellar bien el frasco y
mantener en desecador). Una alternativa es preparar alcuotas (ej. 200 l) en viales pequeos y congelarlas.
Solucin de SDS:
1,0 g duodecilsulfato de sodio; disolver en 10 mg de agua. Guardar en botella de vidrio a temperatura
ambiente.
Amortiguador de muestras no reductor (solucin concentrada 2x):
10,0 ml amortiguador del gel superior; 16,0 ml de solucin de SDS; 50 mg azul de bromofenol; 12,0 ml
glicerol; 4,0 ml agua; mantener a temperatura ambiente (2 meses).
119

Amortiguador de muestras reductor (solucin concentrada 2x):
El marcaptoetanol es inestable en esta solucin, por lo que se prepara una pequea cantidad de reactivo
para una semana. Agregar 0,2 ml de 2-mercaptoetanol a 4,2 ml del amortiguador no reductor. Guardar a
temperatura ambiente. Las concentraciones finales de los agentes son 4% SDS y 5% 2-Me. El 2-Me es txico y de
olor desagradable (usar una campana de extraccin).
Fijador:
500 ml de metanol; 70 ml de acido actico glacial; 430 m de agua. Guardar a temperatura ambiente en
recipiente hermtico. Es importante evitar el contacto y la inhalacin de vapor de metanol.
Colorante Coomassie Blue R-250 (tal como ya se describi antes en el captulo de precipitacin):
Decolorador:
200 ml de metanol; 100 ml etanol; 50 ml cido actico; 650 ml agua. Guardar a temperatura ambiente.
9.4.5 Consideraciones finales en cuantificacin de antgenos y anticuerpos
mediante ELISA
Para finalizar la cuantificacin tanto de antgenos como de anticuerpos se lleva a cabo mediante una serie
de aparatos como los que se observan en las siguientes imgenes:
Fig. 9.8. Aditamentos importantes para realizar tcnicas de ELISA.
En la Fig. 9.8. las pipetas multicanal, en versiones de 8 o de 12 puntas, son la herramienta ms til para el
trabajo de las placas de 96 hoyos. Los reactivos como el conjugado, sustrato, etc. pueden ser colocados en
canales de plstico (como se muestra a la izquierda) para agilizar el pipeteo. Para facilitar el lavado de las placas
se puede utilizar un sistema sencillo de 8 puntas acoplado al recipiente con la solucin lavadora mediante una
vlvula de repeticin. Tambin existen aparatos lavadores automatizados, con bomba de vaco de mayor costo.
120

Fig. 9.9. Lector automtico de placas de 96 hoyos para tcnicas de ELISA.
En esta Fig. 9.9. se observan espectrofotmetros que utilizan un sistema de haces de luz mltiples,
perpendiculares a la placa, que permiten leer la absorbancia de los 96 hoyos en menos de 10 segundos. Las
lecturas pueden ser enviadas a una impresora, o mejor an, a un ordenador, en donde puede procesarse y
almacenarse. Los lectores poseen un conjunto de filtros para seleccionar la longitud de onda apropiada, muy
tiles en diversas tcnicas, adems del ELISA.

9.5. Principales tcnicas de enzimoinmunoanlisis
La principal tcnica de enzimoinmunoanlisis ser la siguiente:
Determinacin de T
4
mediante enzimoinmunoensayo se puede decir que la T
4
es una
hormona sintetizada y almacenada por folculos tiroideos, que tambin reciben el nombre de
tetrayodotironina o tiroxina.
Este anlisis se basa en un ELISA del tipo competitivo.
Lo que ocurre en dicho anlisis es que despus de separar la T
4
, contenida en la muestra, de protenas
transportadoras con el cido 8-anilino-Naphthaleno Sulfnico (ANS) y salicilato sdico, dicho ensayo es ejecutado
en dos etapas:
Etapa 1 de reaccin enzimtica la muestra con T
4
y un reactivo a base de T
4
marcado con
peroxidasa de rbano picante se incubaran dentro de un tubo cuyas paredes estn
recubiertas interiormente con anticuerpos anti-T
4
.
Etapa 2 de revelado enzimtico previamente se produce un lavado interno del tubo, tras
este se vierte un sustrato cromognico en su interior, sobre el que acta la peroxidasa ligada,
a travs de la T4, a los anticuerpos anti-T
4
, producindose con esto una coloracin amarillo-
anaranjada que puede ser medida espectrofotomtricamente en forma de absorbancia.

CAPITULO X
TCNICAS BASADAS EN LA REACCIN DE INMUNOTRANSFERENCIA

123

10.1 Introduccin a la reaccin de inmunotransferencia
El uso de tcnicas inmunolgicas basadas en el marcaje de anticuerpos, especialmente como enzimas
(tales como las tcnicas de ELISA vistas en el captulo anterior), tiene importancia fundamental en los laboratorios
biomdicos.
Las tcnica denominada originalmente en ingls Western blotting, es de gran utilidad en el anlisis de
mezclas antignicas y sus interacciones con anticuerpos. Esta tcnica combina una separacin electrofortica
(vista en el captulo anterior sobre precipitacin) de los antgenos, su transferencia electrofortica a un medio de
soporte en forma de membrana u hoja, y finalmente, su inmunodeteccin a travs del uso de anticuerpos
marcados (u otras molculas con capacidad de reconocimiento selectivo como lectina, protena A, protena G,
avidina, etc.). Estos mtodos han recibido diversos nombres, tanto en la literatura en ingls (Western blotting,
inmunoblotting, electroblotting), como en espaol. En este captulo utilizaremos el nombre traducido,
inmunoelectrotransferencia, para sealar que el mtodo combina una electrofotransferencia con una
inmunodeteccin, por lo tanto por ellos se estudiara a parte al ser una tcnica que mezcla la precipitacin de la
electroforesis con una reaccin macada mediante inmunodeteccin.
Histricamente el nombre original de Western surgi despus de que un investigador de apellido
Southern desarrollara una tcnica para transferir ADN de geles a membranas, que se popularizo con el nombre de
Southern blotting. El mtodo fue descrito simultneamente por varios grupos de investigadores. A pesar de que la
tcnica se puede realizar utilizando marcaje con radioistopos, el uso de enzimas ha tenido una mayor
aceptacin. El empleo de enzimas o istopos confiere a estas tcnicas una alta sensibilidad una alta sensibilidad
fsica para la deteccin de cantidades muy bajas de antgenos o anticuerpos.
En sus inicios la inmunoelectrotransferencia no tuvo aplicaciones en el trabajo de rutina clnica. Sin
embargo, en poco tiempo se difundi rpidamente en el campo hospitalario gracias a su introduccin como un
mtodo de referencia para la deteccin de anticuerpos contra protenas de los virus HIV, agentes etiolgicos del
sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA).
El poder de la inmunoelectrotransferencia radica en que combina la alta resolucin de las tcnicas
electroforticas, con la posibilidad de igualar la capacidad de unin de los componentes separados frente a
distintas sondas bioespecificas, tales como anticuerpos, lectinas, etc., con una alta sensibilidad. Adems cuando la
tcnica se realiza a partir de geles de SDS-PAGE (vistos anteriormente en el captulo de precipitacin), los
resultados proveen informacin directa en cuanto al peso molecular de los antgenos que interaccionan.
Fig. 10.1. Principio de inmunoelectrotransferencia
La Fig. 10.1. se inicia con la separacin electrofortica de una mezcla de antgenos, por ejemplo mediante
SDS-PAGE. En la presente fig. las partes A, B y C corresponden a: A. Transferencia de componentes separados del
gel hacia una membrana de nitrocelulosa (NC) mediante un campo elctrico; B. es donde los componentes
quedan inmovilizados sobre su superficie mediante uniones no covalentes, probablemente hidrfobicas; C. Aqu
aparece la membrana u hoja de nitrocelulosa que es finalmente tratada con anticuerpos (u otras sondas
bioespecificas) acoplados a una enzima, para poder visualizar los componentes de inters.
124

Fig.10.2. Principio de deteccin inmunoenzimtica sobre membrana de nitroecelulosa
En esta, la fig.10.2. los componentes unido a la nitrocelulosa son accesibles a la interaccin con
anticuerpos (u otras moleculas). En A, los anticuerpos reconocen al antgeno 1, pero no al 2. Despus de lavar en
B, los anticuerpos unidos al antgeno son detectados mediante un conjugado anti-inmunoglobina/enzima, que
convierte al sustrato incoloro (S) en un producto (P) coloreado precipitable. La visualizacin final de dicha
reaccin queda esquematizada en C.
Los pasos generales de una inmunoelectrotransferencia son los que expondremos a continuacin en
donde se realiza entre otros pasos una separacin electrofortica, siendo la electroforesis ms utilizada la de
poliacrilamida con duodecilsufato de sodio (SDS-PAGE), que separa las protenas con base en su peso molecular.
Sin embargo tambin es posible utilizar una amplia gana de tcnicas electroforticas en combinacin con
transferencia.
En relacin con todo ello, los principales pasos de la inmunoelectrotransferencia son:
1. Separacin electrofortica de la mezcla de antgenos.
2. Transferencia de nitrocelulosa (u otro tipo de membrana).
3. Bloqueos de sitios libres de la nitrocelulosa con una protena irrelevante.
4. Deteccin especfica de antgenos o anticuerpos, mediantes:
a. Conjugado enzima-anticuerpos.
b. Conjugados enzima-protena A o protena G.
c. Conjugado enzima-avidina.
d. Otros
5. Revelado de bandas con un cromgeno precipitante.
Para la interpretacin de los resultados es importante tener en cuenta que los epitopos conformacionales
o discontinuos de las protenas son alterados por la accin del detergente SDS. Los anticuerpos dirigidos contra
epitopos conformacionales, en ocasiones no pueden ser detectados cuando la inmunoelectrotransferencia se
hace a partir de SDS-PAGE (aunque puede haber algn grado de renaturalizacin parcial de ciertas protenas al
paso del gel a la nitrocelulosa). Esto es muy evidente cuando se utiliza un anticuerpo monoclonal contra un
epitopo conformacional. En los sueros policlonales, sin embargo, hay muchos anticuerpos que reconocen
epitopos lineales (continuos, secuenciales) del antgeno, por lo que prcticamente siempre dan una seal
positiva, independientemente de la desnaturalizacin causada por el SDS.
La inmunoelectrotransferencia, al igual que prcticamente todas las tcnicas inmunoqumicas, puede ser
utilizada para la deteccin de antgenos o de anticuerpos, segn el inters. Por ejemplo, en las pruebas
125

serolgicas para diagnosticar la infeccin por HIV, se confirman las reacciones positivas obtenidas en las pruebas
de tamizaje mediante ELISA (vistas en captulo anterior) (el cual utiliza una mezcla de antgenos del HIV para
detectar los respectivos anticuerpos de los pacientes), mediante una inmunoelectrotransferencia. Para esto, se
separan primero las protenas virales mediante SDS-PAGE, y se transfieren a una hoja de nitrocelulosa, la cual se
puede recortar en forma de cintas delgadas. El suero del individuo en estudio se incuba con una cintilla, para
determinar si contiene anticuerpos contra uno o ms componentes virales, detectados mediante el uso de
conjugados anti-inmunoglobulina/enzima. La tcnica tiene una alta sensibilidad fsica y una buena especificidad
diagnstica, y se utiliza como un mtodo de referencia o conformacin en este campo.

10.2 Inmunoelectrotransferencia (Western blotting)
10.2.1 Inmunoelectrotransferencia (Western blotting) a partir de SDS-PAGE
Para llevar a cabo el mtodo de inmunoelectrotransferencia (Western blotting) a partir de la tcnica de
SDS-PAGE se realizan los siguientes pasos:
1. Una vez terminada la corrida electrofortica (tal como se vio en el captulo de precipitacin),
desconectar la fuente de poder. Sacar el gel y ensamblar el cassette de transferencia,
colocando:
a. La primera esponja.
b. Dos hojas de papel filtro mojadas con amortiguador de transferencia.
c. El gel
d. La nitrocelulosa, previamente hidratada por algunos minutos en el mismo amortiguador.
e. Dos hojas de papel filtro.
f. La otra esponja.
Es fundamental que no se atrapen burbujas entre el gel y la nitrocelulosa, pues esto impedira la
transferencia de las protenas en esa rea.
2. Colocar el cassette dentro de la cmara de transferencia, con la nitrocelulosa (NC) (manipular la
membrana de nitrocelulosa con guantes limpios o con pinzas de punta plana, no directamente
con las manos) hacia el nodo. Introducir el bloque de enfriamiento y una barra magntica en la
cmara. Colocar sobre un agitador magntico a baja velocidad, y encender la fuente de poder
transfiriendo las protenas a 150 mAmp (miliamperios) durante 2 horas.
3. Apagar la fuente de poder, sacar el gel transferido y teirlo con Coomassie R-250, para evaluar la
eficacia del proceso, comprobando que queda poca protena en el gel (la protena de mayor masa
molecular tiene mayor dificultad en transferirse).
4. Sacar la hoja de NC y pre-teirla con negro de almidn diluido al 1/100 en amortiguador Tris 0,02
M pH 7,5. Colocar en un agitador durante 15 minutos. Decolorar con varios cambios de agua
destilada y marcar sobre la NC la posicin de los estndares de PM (peso molecular) (y cualquier
otro punto de referencia til) con una aguja, antes de que se decoloren. Eliminar aquellas
porciones de NC que muestren distorsiones, burbujas, u otras zonas indeseables, si estas llegan a
producirse. El colorante azul se desvanecer gradualmente durante el resto del proceso.

126

Fig.10.3. Cassette de elctrotransferencia, en donde se coloca el gel y la nitrocelulosa entre hojas de papel
filtro y esponjas, Una vez ensamblado el sandwich, el cassette se cierra convencionalmente con la
prensa observada a la derecha.
Fig. 10.4. Bloque de electrotransferencia, donde se colocan 1 o 2 cassettes ensamblados, observando
cuidadosamente la orientacin final de los electrodos (+) y (-) a los lados.
Fig. 10.5. Cmara de electrotransferencia, con la tapa y electrodos conectados.

127

Fig.10.6. Inmunoelectrotranferencia (Western blotting):
revelado.
En este ejemplo se quera determinar si un conjugado
comercial anti-IgG humana, marcado con peroxidasa,
era especifico para la IgG (anti-gamma) o si reconocera
a todas las inmunoglobulinas (anti-gamma + anti-
cadenas livianas), ya que dicha informacin no estaba
disponible en el frasco. Para ello se tomo cantidades
variables de una preparacin purificada de IgG
humana, reducida con 2-mercaptoetanol (cariles 1-6) y
se corri una electroforesis en gel de poliacrilamida al
12% con SDS. El gel se transfiri luego a nitrocelulosa, y
despus de saturar la membrana con albmina bovina,
se incub con el conjugado en estudio. El revelado de la
peroxidasa con E
2
0
2
y cloronaftol result en la
aparicin del patrn de coloracin mostrado. Se deduce que el conjugado anti-IgG humana posee
anticuerpos no solo contra la cadena pesada gamma (50 KD), sino tambin contra las cadenas livianas (25
KD). Es decir, el conjugado son anti-inmuglobulinas totales, y no un anti-IgG selectivo.
5. Bloquear los sitios libres de la NC, sumergindola en la solucin de protena bloqueadora durante
al menos 30 minutos con agitacin suave.
6. Agregar los componentes del sistema de deteccin, segn cada finalidad particular:

6.1. Si la finalidad es detectar anticuerpos contra una mezcla de antgenos:
6.1.1. Agregar una dilucin apropiada del suero en estudio, en solucin de lavados con
0,2% de protena, e incubar por un tiempo comprendido entre 1-4 horas con agitacin
suave (el tiempo se optimiza segn cada sistema). La dilucin apropiada para los sueros se
determina mediante pruebas preliminares, generalmente a partir de 1/100, escogindose
alguna que permita detectar tanto sueros dbiles como fuertes, con un mnimo de tincin
de fondo (background).
6.1.2. Lavar durante 4 o 5 minutos el material no unido con la solucin de lavados, en el
agitador.
6.1.3. Agregar el conjugado anti-inmunoglobulina/enzima correspondiente (ej. anti-Ig
humana, para sueros humanos), en dilucin apropiada, durante 1-2 horas, con agitacin. La
dilucin ptima del conjugado depende de su potencia y se determina previamente,
escogiendo aquella que proporcione la mejor seal con la menor tincin de fondo posible.
Cuando se desea detectar IgG, tambin es posible utilizar conjugados de protena A/enzima
o protena G/enzima. Otros isotipos y subclases se pueden detectar con los conjugados
monoespecficos correspondientes.

6.1.4. Lavar por 4-5 minutos el material no unido, y revelar con un sustrato precipitable
para la enzima utilizada. El uso de controles negativos (i.e. suero negativo, ausencia de
suero) y positivos, revelados en paralelo, es indispensable.
128

6.2. Si la finalidad es la detencin directa de antgenos sobre la NC, agregar una dilucin
apropiada de los anticuerpos correspondientes, ya sea directamente conjugados a una
enzima (para proseguir con el revelado), o alternativamente, seguidos de una segunda
capa de conjugado anti-inmunoglobulina/enzima, y del revelado. Los pasos de
incubacin, lavado etc. son similares a los de arriba descritos.
7. Revelar la membrana NC con la solucin de sustrato precipitable correspondiente a la enzima
utilizada. La reaccin puede detenerse descartando la solucin de sustrato y lavando la
membrana con abundante agua destilada.
8. Estimar el peso molecular (PM) de las bandas que dieron una reaccin positiva, interpolando en
la curva de referencia de los marcadores. En esto el uso de marcadores comerciales pre-
teidos, que son visibles directamente sobre la NC, facilita la determinacin del PM de los
antgenos.
10.2.3 Dot-blotting
La tcnica conocida en ingls como dot-blotting puede considerarse como una variante de una ELISA,
pero realizada sobre una membrana de nitrocelulosa, con los mismos procedimientos de deteccin utilizados en
la inmunoelectrotansferencia o Western blotting. En similitud con dichas tcnicas, en el dot-blotting tambin se
une a antgenos en una membrana de nitrocelulosa, pero su diferencia radica en que no se realiza ninguna etapa
de separacin electrofortica previa a la inmunodeteccin. Ms bien el antgeno o mezcla antignica se aplica
directamente sobre la NC, en forma de mancha o punto (de all el nombre de dot).
La aplicacin de las muestras sobre la NC puede ser manual, simplemente pipeteando un pequeo
volumen de entre 1-3 l sobre la membrana, dejando que las protenas queden unidas en unos minutos. Tambin
pueden utilizarse sistemas de filtracin, cuando se quieren adherir protenas diludas, en volmenes mayores (ej.
100-300 l). Para esto, se coloca la membrana dentro de un molde acrlico en formato de 96 hoyos, y se utiliza
una bomba de vaco para hacer pasar las muestras a travs de la NC, descartando el solvente que atraviesa la
membrana y dejando unidas a las protenas sobre la superficie de filtracin. La membrana es posteriormente
retirada del aditamento de filtracin, para proseguir con los pasos de inmunodeteccin deseados.
Los procedimientos para la inmunodeteccin en el dot-blotting son idnticos a los descritos en la
inmunoelectrotransferencia. Se observa que el dot-blotting puede ser un mtodo muy conveniente de tamizaje
preliminar de muestras, antes de realizar un anlisis ms detallado de una mezcla antignica mediante Western
blotting. Tambin puede explorarse esta tcnica para tamizar sueros por la presencia de determinados
anticuerpos, para fines de apoyo diagnstico, como veremos en la siguiente imagen.
Fig. 10.7. Aplicacin comercial del dot-blotting
En la fig. 10.7. presente, se observa la prueba del dot-
blotting, para la deteccin de anticuerpos IgG sricos contra
antgenos de Toxoplasma, un protozoario parsito de
importancia mdica. En esto se observa que el peine tiene
adheridas las protenas del agente infeccioso, a las cuales se
unen los posibles anticuerpos de las muestras de suero. Los
lavados se llevan a cabo en el bloque de plstico inferior, y la
deteccin final de los anticuerpos se logra con un conjugado anti-
inmunoglobulina G humana/peroxidasa.

129

10.2.4 Reactivos
Amortiguador para la electroforesis (geles con SDS):
29,6 g glicina; 6 g Tris; 400 ml metanol. Ajustar pH a 8,3, aforar a 2000 ml y mantener en refrigeracin.
Amidoblack para pre-tincin no-desnaturalizante de protenas en NC (solucin 10x):
0,5 g negro de almidn; 50 ml de cido actico glacial; 225 ml de metanol; 225 ml de agua destilada. Diluir
1/100 al momento de usar con el amortiguador Tris 0,02 M, pH 7,5.
Solucin de protena para bloquear NC:
Albmina bovina 1% y casena 1% en PBS pH 7,2. No utilizar alzida de sodio (inhibe la peroxidasa).
Para algunos procedimientos se puede agregar Tween20 al 0,05%, sin embargo en ciertos sistemas
puede causar el desprendimiento de protenas de la NC.
Solucin de lavados con protenas:
Diluir a 1/10 la solucin anterior (protena bloqueadora) con PBS, para obtener 0,2% de protena final.
Amortiguador Tris 0,02 M, pH 7,5:
4,8 g de Tris; 58,5 g NaCl. Disolver, ajustar pH y aforar a 2 litros.
Sustrato precipitable para peroxidasa:
Para 60 ml, disolver 30 mg de 4Cl1 naol en 10 ml de metanol (proteger de la luz). Al momento,
agregar 50 ml de amortiguador Tris pH 7,5 y 25 l de perxido de hidrgeno concentrado (35%).
Sustrato precipitable para fosfatasa alcalina:
1. Solucin madre Tris 2,0 M pH 9,0:
24,22 g Tris. Disolver, ajustar pH con HCl y aforar a 100 ml.
2. Solucin de trabajo:

10 ml de solucin madre Tris; 11,7 g NaCl; 1 ml MgCl
2
1M. Aforar a 200 ml.
3. Solucin A:
2,5 mg BCIP (5bromo4cloro3indolil) disuelto en 50 l de DMSO (dimetilsulfxido) y luego diluidos
con 1 ml de solucin de trabajo.
4. Solucin B:
3 mg NBT (nitroblue tetrazolium) disueltos en 1 ml de metanol.
5. Proteger todo de la luz, mezclar A + B + 18 ml de solucin de trabajo y agregar a la NC.

CAPITULO XI
TCNICAS BASADAS EN LA REACCIN DE CROMATROGRAFA
DE AFINIDAD

133

11.1 Introduccin a la reaccin de cromatografa de afinidad
La cromatografa de afinidad explota las interacciones especficas que ocurren entre las biomolculas,
con la finalidad de lograr su separacin. En la naturaleza existen muchos sistemas de unin especficos o
selectivos, entre los que se pueden citar las interacciones:
Antgenoancuerpo
Enzimasustrato
Enzimainhibidor
Oligosacridolecna
Hormonarepector
cido nucleicoprotenas
Etc.
Adems de las interacciones naturales citadas, pueden encontrarse interacciones fortuitas, que no por
ello son de menor utilidad.
Fig. 11.1. Principio de la cromatografa de afinidad
Dicho principio el de cromatografa de afinidad, como ha quedado expuesto en la fig. 11.1. anterior,
presenta un sistema de interaccin especfico y reversible entre dos componentes en donde se observa:
a. Se acopla covalentemente uno de ellos a un medio de soporte (b).
b. Al componente inmovilizado de esta manera se le denomina ligando. Al pasar una muestra
heterognea que contiene el componente complementario, este se unir al ligando (c).
c. Este permitir mediante la unin con de b con el ligando, eliminar las dems molculas
mediante lavado.
d. Finalmente, el componente de inters es eludo mediante un cambio en las condiciones del
medio y recuperado, volviendo a su posicin inicial.
El principio de la cromatografa de afinidad es simple, para ello se acopla covalentemente uno de los dos
componentes a un medio de soporte, para capturar al componente complementario a partir de una mezcla
compleja de molculas. Esta unin es reversible. Despus de lavar las molculas no unidas, se eluye el
componente de inters mediante un cambio en las condiciones del medio, que induzcan una disociacin.
134

Para la elucin de una columna de afinidad es comn utilizar cambios de pH que alteren la afinidad de la
unin, causando cambios reversibles y transitorios en las protenas. Sin embargo tambin existen otras
estrategias para la elucin, tales como el uso de soluciones salinas de alta moralidad, el uso de agentes
caotropicos (es una sustancia que desorganiza la estructura tridimensional en macromolculas tales como
protenas, ADN o ARN y las desnaturaliza), o las eluciones de tipo competitivo que utilizan el mismo ligando, pero
en estado libre. Algunas de estas eluciones las ms importantes se expondrn en el siguiente cuadro:
Formas de elucin en la cromatografa de afinidad
Condiciones de elucin Comentarios
Glicina-HCl, pH 2,5-3,0 Incompatible con el uso de deoxicolato
Acido propinico 1 M
Ms eficiente que el HCl al mismo pH, posiblemente por una ligera
accin detergente. Pero puede causar desnaturalizacin irreversible.
Dietilamina 0,05M, pH 11,5
Compatible con deoxicolato, por lo que es til para antgenos de
membrana.
Urea 2-8 M, pH 7,0 El calentamiento causa carbamilacin de protenas.
Guanidina-HCl 6 M Fuertemente desnaturalizante.
Tiocionato de sodio 3,5 M Las trazas inhiben el marcaje con yodo o fluorescencia.
Cloruro de magnesio 2-5 M Incompatible con el uso de deoxicolato.
Yoduro de potasio 2-5 M, pH 7,5-9,0 -
Etiln glicol 50% v/v, pH 11,5 Romper interaciones hidrofbicas.

La cromatografa de afinidad a ganado terreno por su simplicidad y rapidez, as como su alta selectividad,
especialmente despus de la introduccin de los anticuerpos monoclonales (AcMo). Con un anticuerpo
monoclonal adecuado, en principio es posible aislar cualquier antgeno en un solo paso cromatogrfico y con un
alto grado de purificacin. En la prctica, sin embargo, pueden presentarse diversos tipos de limitaciones al
respecto.
Comercialmente, estn disponibles varios tipos de medios de soporte (en forma de microesferas) pre-
activados por mtodos qumicos, para acoplar prcticamente cualquier clase de ligandos, y aislar as sus
molculas complementarias naturales (o fortuitas). Las mayoras de las reaciones de acople a un soporte, como
veremos en el presente captulo ms adelante, se realizan a travs de los grupos amino primarios de las
protenas, a pesar de que el enlace resultante es uno de los menos estables. Tambin existen medios de soporte
para realizar acoples covalentes a travs de otros grupos qumicos.
Algunos medio de transporte tienen un brazo espaciador en su grupo reactivo, cuyo fin es aumentar la
distancia entre la superficie del medio y la molcula covalentemente acoplada. Esto permite reducir el
impedimento estrico en la interaccin entre el ligando y su componente complementario, durante el proceso
cromatogrfico. Sin embargo, el brazo espaciador tambin puede dar lugar a fenmenos de absorcin inespecfica
de algunas molculas, especialmente cuando el mismo es de naturaleza hidrofbica, y se trabaja con una alta
concentracin de sales. Otro aspecto a considerar en el acople del ligando al medio de soporte es que, en
ocasiones, pueden ocurrir cambios importantes en su conformacin nativa, en especial cuando el ligando
reacciona con el soporte a travs de mltiples puntos de unin.
135

Fig. 11.2. El brazo espaciador. Se esquematiza el acople de una molcula (ligando) directamente al medio de
soporte activado (izquierda), o a travs de un brazo espaciador (derecha) para facilitar la interaccin y unin con
su componente complementario, mediante la reduccin de posibles impedimentos estricos.

11.2 Acople de protenas a Sepharose activada con CNBr
11.2.1 Introduccin
Cuando se desea purificar los anticuerpos especficos contra un antgeno, a partir de un suero inmune, la
cromatografa de afinidad es una de las mejores opciones disponibles. Para esto, se acopla covalentemente el
antgeno de inters a un medio de soporte, para que acte como lingando en la captura y posterior elucin de los
anticuerpos.
Uno de los medios de soporte ms utilizados es la Sepharose activada con CNBr. Este medio consiste en
microesferas de agarosa tratadas con bromuro de ciangeno, en las cuales se establece un enlace isotiourea con
las protenas, a travs de sus grupos aminos libres o primarios (-amino). Tambin existen otros medios de
soporte preactivados que utilizan reacciones distintas para el acople (N-hidroxisuccinimida, carbonildiimidazol,
tuoleno-sulfonil cloruro, etc.). Cada uno de ellos posee sus ventajas y desventajas.
11.2.2 Procedimiento para acoplar protenas a Sepharose activada por CNBr
Para el procedimiento de acoplamiento mediante este proceso se deben realizar los siguientes pasos:
1. Disolver la protena en el amortiguador de acople. Utilizar 5-10 mg de protena por cada ml de
gel. El amortiguador de acople en esto se prepara con:
4,2 g de NaHC0
3
(concentracin final 0,1 M)
14,6 g de NaCl (0,5 M)
Se ajusta su pH a 8,3 y se afora a 500ml.
2. Hidratar el gel seco con HCl 1 mM (milimoles) durante 15 minutos (47 l de HCl concentrado,
11,7 N en 500 ml de agua). Lavarlo varias veces con la misma solucin, utilizando al menos 200
ml por cada gramo de gel seco. Esto puede realizarse con un embudo de vidrio poroso, o
alternativamente, en tubos de centrifuga de 50 ml. El uso de un pH cido preserva la reactividad
de los grupos qumicos del gel para el acople. Hay que tener en cuenta que 1 g de gel seco
resulta 3 ml de gel hidratado.
136

3. Lavar por ltima vez el gel con amortiguador de acople (utilizando por lo menos 5 ml por cada
gramo de gel seco). A partir de este momento se debe acoplar la protena de inmediato, pues al
subir el pH, los grupos reactivos del gel comienzan a inactivarse.
4. Transferir rpidamente el gel a la solucin de ligando (se recomienda una proporcin de gel
/amortiguador de 1/2 v/v). Mezclar suavemente en un rotador (no utilizar agitador magntico,
para no fragmentar las microesferas). La reaccin se puede dejar completar durante 2 horas a
temperatura ambiente o durante la noche a 4C.
5. Bloquear el exceso de grupos reactivos con etanolamina 1 M, o con glicina 0,2 M (1,5 g en 100 ml
de agua) a pH 8,0 durante 2 horas a temperatura ambiente o durante 16 horas en refrigeracin.
6. Empacar el gel en una columna comatrogrfica y lavar la protena no acoplada, haciendo 4 ciclos
de cambio de pH alto y bajo, respectivamente, con amortiguador de acople y amortiguadro de
acetato (4,1 g de acetato de sodio al 0,1 M; 14,6 g NaCl al 0,5 M, ajustar pH a 4,0 y aforar a 500
ml).
7. Con ello, la columna est lista para ser utilizada. Mientras tanto una vez preparada, hasta su uso
guardar en refrigeracin. En base a todo esto, se puede determinar la eficiencia del acople de la
protena al soporte, midiendo la disminucin en la A
280
de una pequea alcuota de
sobrenadante de reaccin, al inicio y fin del proceso.
Fig. 11.3. Componentes de un sistema de cromatografa liquida convencional (de baja presin).
En la figura anterior, fig. 11.3. se observan los componentes del sistema de cromatografa liquida convencional de
baja presin que son:
1. Bomba peristltica encargada de hacer uir el solvente hacia la columna, a una velocidad
constante y regulable.
2. Medio cromatogrfico es en este caso una pequea columna de inmunoafinidad.
3. Fotocelda de flujo continuo se encarga de detectar la absorbancia a 280 nm del auente de la
columna que finalmente termina en un recolector de fracciones.
4. Sistema mecnico de tubos intercambiables estos se regulan por empo o recuento de
gotas.
137

11.2.3 Aislamiento de anticuerpos mediante cromatografa de afinidad
El siguiente procedimiento es un procedimiento general para sistemas protena-protena. Pueden existir
casos particulares en que las condiciones de este mtodo causen desnaturalizacin irreversible de las molculas
de inters. En tal caso deben buscarse otras modalidades de elucin.
Para dicho aislamiento se deben realizar los siguientes pasos:
1. Equilibrar la columna de Sepharose-antgeno con PBS, pH 7,2. Cuando la columna se ha dejado
de utilizar por algn tiempo, es conveniente realizar una pre-corrida sin muestra para limpiarla.
Concentrar la columna a un sistema de deteccin continua de protenas (A
280
).
Fig.11.4. Detalle de una columna y graficador.
En la fig. 11.4. en los detalles de una columna y graficador, se muestran a la izquierda un detalle de la
columna de inmunoafinidad de la fig.11.3. anterior, construida con una jeringa descartable de 20 ml, a la cual se
le coloc una base de lana de vidrio en el fondo, para detener el medio cromatogrfico. La jeringa est sellada
en su parte superior mediante un tapn de caucho, perforado por una aguja de calibre 20 que se conecta a la
lnea de entrada del solvente. En la parte inferior se acopl una llave de plstico, unida a la lnea de salida. A la
derecha se muestra la graficacin continua de la absorbancia del efluente de la columna, generndose un patrn
de elucin de protenas, con base en la seal enviada por la fotocelda de flujo continuo.
2. Aplicar la muestra, diluida a partes iguales con PBS, y pasarla lentamente (ej. 1 gota/10-20 sg.).
Si el flujo es muy rpido, habr mejor posibilidad de interaccin en la columna y el rendimiento
final puede disminuir. Cuando se desea obtener el mximo de rendimiento de una muestra, se
puede dejar recirculando continuamente por la columna durante unos 30 minutos, antes de
continuar con el siguiente paso.
3. Una vez pasada la muestra, lavar la columna con unos 50 ml de PBS, con una velocidad de 1
gota/3-4 sg, para eliminar las protenas no unidas. El lavado debe continuar hasta que la A
280

del eluente haya regresado completamente a su lnea base.
4. Eluir los anticuerpos unidos al antgeno, aplicando el amortiguador de elucin (glicina-HCl 0,1
M, pH 2,8-3,0). Recoger fracciones de 3-4 ml en tubos que contienen 0,5 ml de amortiguador
receptor (Tris-HCl 0,5 M, pH 8,8), para neutralizar inmediatamente el pH cido y renaturalizar los
anticuerpos.
138

5. Una vez recolectados loa anticuerpos, re-equilibrar la columna con PBS y conservarla en
refrigeracin. Una columna de afinidad puede ser reutilizada muchas veces, siempre y cuando la
funcionalidad y el rendimiento se mantengan aceptables.
Observe que este mismo procedimiento puede ser utilizado de forma inversa, para purificar un antgeno a
partir de una mezcla compleja. Para ello se puede acoplar a la columna los respectivos anticuerpos, o un
anticuerpo monoclonal apropiado y realizar la purificacin del antgeno por inmunoafinidad.

CUESTIONARIO

141

1. Qu entendemos por inmunologa clnica?
a. Ciencia encargada del estudio del sistema inmune en su conjunto.
b. Ciencia encargada del estudio de los linfocitos.
c. Ciencia encargada de los rganos productores de las clulas del sistema inmune.
2. Los rganos linfoides primarios estn formados por:
a. Mdula sea.
b. Timo.
c. Ambas son correctas.

3. Qu entendemos por antgenos?
a. Sustancia extraa al organismo sin reaccin con el sistema inmune.
b. Sustancia extraa al organismo que puesta en contacto con un sistema inmunocompetente
maduro es capaz de provocar respuesta inmunitaria.
c. Sustancia extraa al organismo capaz de producir anticuerpos.

4. En los linfocitos B tiene lugar:
a. La produccin de los distintos tipos de inmunoglobulinas.
b. La produccin de un solo tipo de inmunoglobulinas.
c. No es capaz de producir inmunoglobulinas.

5. Cules son los tipos de inmunoglobulinas existentes:
a. A, D y M.
b. A, D, E, G y M.
c. A y D.

6. Adems de las cadenas polipeptidicas, de la estructura bsica de las inmunoglobulinas, esta presentan
las siguientes molculas adicionales:
a. Cadena J
b. Pieza de cola o secrecin
c. Ambas

7. Qu se entiende por reaccin Ag-Ac?
a. Aquella reaccin llevada a cabo cuando entra en contacto un antgeno con un anticuerpo frente
al que va dirigido.
b. Aquella reaccin llevada a cabo cuando entra en contacto un antgeno con un anticuerpo
cualquiera del organismo.
c. Ninguna es correcta.

8. Cualquier dilucin est compuesta por:
a. Soluto+solvente.
b. Soluto+solvente+otras sustancias.
c. Ninguna de las anteriores es correcta.
9. En qu consisten las diluciones seriadas?:
a. En preparar distintas diluciones a partir de una sustancia madre llamada soluto.
b. En prepara distintas diluciones cada una de las cuales se obtienen partiendo de una anterior,
siendo la dilucin inicial a partir de la sustancia madre llamada soluto.
c. En preparar distintas diluciones partiendo de distintas cantidades de solvente previamente
preparado, al que se le aade la misma cantidad de sustancia madre llamada soluto.
142

10. En qu consiste la reaccin de aglutinacin?:
a. Consiste en el agrupamiento de una suspensin de partculas debidas deba a la reaccin
producida entre un antgeno presente en las partculas (aglutinogeno) y un anticuerpo especifico
de l (aglutinina), el cual forma un complejo aglutingeno-aglutinina, el cual se observa de
manera macroscopica.
b. Consiste en el agrupamiento de una suspensin de partculas debidas deba a la reaccin
producida entre un antgeno presente en las partculas (aglutingeno) y un anticuerpo especifico
de l (aglutinina), el cual forma un complejo aglutingeno-aglutinina, el cual se observa de
manera microscpica.
c. Suspensin de partculas producidas entre antgenos y anticuerpos diversos y distintos que unos
se observaran macroscpicamente y otros de manera microscpica.
11. En qu consiste la inhibicin de la aglutinacin:
a. En detectar los anticuerpos presentes en la muestra que no forman el complejo antgeno-
anticuerpos, es decir, aquellos que no van unidos al antgeno.
b. En detectar los antgenos presentes en la muestra que no forman el complejo antgeno-
anticuerpos, es decir, aquellos que no van unidos al anticuerpo.
c. En detectar tanto antgenos como anticuerpos que se encuentran en la muestra separados sin
estar unidos ni formando el complejo antgeno-anticuerpo.
12. En qu consiste la reaccin de precipitacin:
a. En la formacin por un antgeno soluble de una red de precipitado entre los complejos inmunes
antgeno-anticuerpo.
b. En la formacin por un anticuerpos soluble de una red de precipitado entre los complejos
inmunes antgeno-anticuerpo.
c. En la formacin tanto por un antgeno soluble como por un anticuerpo soluble de una red de
precipitado entre los complejos antgeno-anticuerpo.
13. Qu consiste la doble inmunodifusin en gel?:
a. En enfrentar antgenos y anticuerpos en el gel de agarosa, colocndolos en hoyos o pocillos
circulantes adyacentes, para que difundan y formen lneas de precipitacin entre ellos.
b. En enfrentar antgenos y anticuerpos en el gel de poliacrilamida, colocndolos en hoyos o
pocillos circulantes adyacentes, para que difundan y formen lneas de precipitacin entre ellos.
c. Enfrentando antgenos y anticuerpos de manera aleatoria en gel de agarosa, en el gel tal cual sin
hoyos ni pocillos ni nada, sino el gel tal cual.
14. En la inmunodifusin radial uno de los requisitos es:
a. Que el antisuero debe ser poliespecifico, es decir reconozca al menos tres componentes
antignicos de la muestras.
b. Que el antisuero debe ser biespecifico, es decir reconozca dos componentes antignicos de la
muestras.
c. Que el antisuero debe ser monoespecifico, es decir reconozca un solo componente antignico de
la muestra.
15. En cuantas partes se separa y micra la electroforesis en gel de agarosa:
a. En Albmina y globulinas: , y .
b. En Albminas: , y y globulinas: , y .
c. En albmina y globulinas:
1
,
2
, y .

143

16. Qu es el SDS-PAGE?:
a. Es el detergente duodecilsulfato de potasio utilizado para analizar tanto mezcla de protenas
como para ser combinada en tcnicas de inmunoelectrotransferencia.
b. Es el detergente duodecilsulfato de sodio utilizado para analizar tanto mezcla de protenas como
para ser combinada en tcnicas de inmunoelectrotransferencia.
c. Es el detergente duodecilsulfato de sodio utilizado para analizar mezcla de protenas
exclusivamente.
17. Los componentes para la mezcla del gel para SDS-PASE son:
a. Persulfato de amonio, TEMED y acrilamida/bisacrilamida.
b. SDS, amortiguador superior y agua desionizada.
18. Qu es la inmunoelectroforesis?:
a. Un tipo de electroforesis.
b. Un tipo de inmunodifusin.
c. La combinacin de una electroforesis con una inmunodifusin en gel.
19. Entre los distintos tipos de inmunoelectroforesis tenemos la contrainmunoelectroforesis (CIEF), pero,
en qu consiste la contrainmunoelectroforesis?:
a. En hacer migrar electroforticamente, pero en sentido opuesto, dos muestras que contienen,
respectivamente el antgeno y los anticuerpos.
b. En hacer migrar electroforticamente, pero en sentido opuesto los antgenos de dos muestras.
c. En hacer migrar electroforticamente, pero en sentido opuesto los anticuerpos de, dos muestras
que contienen.
20. Los marcadores en la reaccin antgenoancuerpo pueden ser de:
a. Inmunofluorescencia y radioinmunoensayo.
b. Inmunofluorescencia, enzimoinmunoensayo y radioinmunoensayo.
c. Enzimoinmunoensayo y radioinmunoensayo.
21. En qu se diferencian la inmunofluorescencia directa de la indirecta?:
a. Qu en la directa se produce reaccin antgeno-anticuerpo marcado con fluorescencia y en la
indirecta se produce reaccin antgeno-anticuerpo sin marcar-anticuerpo marcado.
b. Qu en la directa se produce reaccin antgeno marcado con fluorescencia-anticuerpo marcado
con fluorescencia y en la indirecta se produce reaccin antgeno-anticuerpo ambos sin marcar-
antgeno-anticuerpos en este segundo caso ambos marcados.
c. Qu en la directa se produce reaccin antgeno-anticuerpo marcado con fluorescencia y en la
indirecta se produce reaccin antgeno-anticuerpo y todo el complejo en su conjunto es el que
quedara marcado.
22. Qu es la citometra de flujo?:
a. Un instrumento capaz de identificar clulas sin aisladas que influirn a travs de fuentes de
excitacin en un medio liquido.
b. Un instrumento capaz de identificar clulas aisladas que influirn a travs de fuentes de
excitacin en un medio liquido.
c. Un instrumento capaz de identificar clulas sin aisladas que influirn a travs de fuentes de
excitacin en un medio solido.
23. Una de las principales tcnica de inmunofluorescencia es:
a. El test de ANA.
b. El test de ASA.
c. El test de ADA.
144

24. Cul de las siguientes sustancias radiactivas es la ms utiliza en una tcnica de RIA?:
a.
57
Co.
b.
131
I.
c.
125
I.
25. Qu son las tcnicas de enzimoinmunoanlisis?:
a. Tcnicas que utilizan protenas como marcadores inmunoqumicos de complejos antgeno-
anticuerpo.
b. Tcnicas que utilizan enzimas como marcadores inmunoqumicos de complejos antgeno-
anticuerpo.
c. Tcnicas que utilizan enzimovitaminas como marcadores inmunoquimicos de complejos
antgeno-anticuerpo.
26. Con que nombre se les conoce a las tcnicas de enzimoinmunoanlisis heterogneo?:
a. EIA.
b. ELISA.
c. ELIA.
27. En las tcnicas de ELISA para la cuantificacin tanto de anticuerpos como de antgenos, que es lo que
decantaremos y agregaremos a las recubiertas con el antgeno de inters en el caso de cuantificacin
de anticuerpos o anticuerpos de inters en el caso de cuantificacin de antgenos:
a. 200 l por hoyo de albmina de bovino.
b. 150 l por hoyo de albmina de bovino.
c. 100 l por hoyo de albmina de bovino.
28. Algunos de los pasos llevados a cabo en la inmunoelectrotransferencia son:
a. La separacin electrofortica de la mezcla de antgenos.
b. Revelado de bandas con un cromgeno precipitante.
29. La cromatografa de afinidad explora las interacciones especficas que ocurren entre las biomolculas,
con la finalidad de lograr su separacin. Pero, qu sustancias son las que puede separar?:
a. Antigeno-anticuerpo.
b. Otras sustancias tales como enzima-sustrato, hormona-receptor, etc.
30. Cul ser el primer paso en el procedimiento para el acople de protenas a Sepharose activada por
CNBr?:
a. Disolver las protenas de la muestra en el amortiguador de acople.
b. Diluir las protenas de la muestra con PBS.
c. Separar las protenas de las muestra mediante centrifugacin.

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