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Impreso por: Lorena Parra Fecha Oficial: Oficial desde 01-dic-2019 Tipo de Documento: Capítulos Generales @2023 USPC
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á60ñ EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE PRODUCTOS NO ESTÉRILES:
PRUEBAS PARA EL COMPLEJO BURKHOLDERIA CEPACIA
INTRODUCCIÓN

Las pruebas que se describen en este capítulo permitirán determinar la ausencia del complejo Burkholderia cepacia (Bcc), el
cual puede detectarse en las condiciones descritas.
Las pruebas han sido diseñadas para determinar si una sustancia o preparación cumple con una especificación establecida
de calidad microbiológica y/o para evaluar si los productos—especialmente aquellos para inhalación o preparaciones acuosas
para uso oral, oromucosal, cutáneo o nasal—contienen miembros del Bcc.

PROPIEDADES INHIBITORIAS Y DE PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO DE LOS MEDIOS Y

APTITUD DE LA PRUEBA PARA DETECTAR LA AUSENCIA DE BCC

Analizar cada partida de medio listo para usar y cada partida de medio preparada a partir del medio deshidratado o de los
ingredientes.

l
Preparación de Cepas de Prueba

ia
Usar suspensiones estables estandarizadas de las cepas de prueba (ver la Tabla 1) de no más de 5 pasajes desde del cultivo
original de la cepa.

Tabla 1. Cepas de Prueba de Microorganismos para las Pruebas de Promoción de Crecimiento y de Aptitud
Microorganismos Cepa Estándar
fic
Burkholderia cepacia ATCC 25416, NCTC 10743 o CIP 80.24

Burkholderia cenocepacia ATCC BAA-245 o LMG 16656

ATCC BAA-247, LMG 13010, CCUG 34080, CIP 105495, DSM 13243 o NCTC
Burkholderia multivorans 13007

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118 o NBRC 13275
O

Staphylococcus aureus ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83 o NBRC 13276

Microorganismos
Cultivar cada una de las cepas de prueba de manera separada en Caldo Digerido de Caseína y Soja o en Agar Digerido de
Caseína y Soja a 30°–35° durante 18–24 horas.
Usar Solución Amortiguada de Cloruro de Sodio–Peptona de pH 7,0 o Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2 para preparar
las suspensiones de prueba. Usar las suspensiones dentro de las 2 horas o dentro de las 24 horas si se almacenan a 2°–8°. Si se
compran, seguir las instrucciones del proveedor. Si los cultivos que se van a usar son de preparación propia, seguir un
procedimiento validado (tal como el que se encuentra en Pruebas de Recuento Microbiano á61ñ) durante la preparación. Usar un
inóculo de desafío de no más de 100 unidades formadoras de colonias (ufc) para las pruebas de promoción del crecimiento y
de aptitud.

CONTROLES NEGATIVOS
Incluir un control negativo para verificar las condiciones de prueba. No debe observarse crecimiento de microorganismos.
Asimismo, realizar un control negativo al analizar los productos según se indica en Pruebas de Productos.

PRUEBA DE LAS PROPIEDADES DE PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO, MEDIOS SÓLIDOS

Llevar a cabo el Método de extensión en superficie (ver Pruebas de Recuento Microbiano á61ñ, Prueba de Promoción del Crecimiento,
Aptitud del Método de Recuento y Controles Negativos, Aptitud del Método de Recuento en Presencia del Producto, Recuperación de
Microorganismos en Presencia del Producto, Métodos de Recuento en Placa), inoculando cada placa con un número pequeño (no
más de 100 ufc) del microorganismo apropiado (ver la Tabla 2). Incubar a la temperatura especificada durante un tiempo no
mayor al tiempo más corto especificado en la prueba. Se produce un crecimiento de microorganismos comparable al obtenido
anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada previamente.

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Tabla 2. Microorganismos para las Propiedades de Promoción del Crecimiento, Inhibitorias e Indicadoras de los Medios
Medio Propiedad Microorganismos
Burkholderia cepacia, Burkholderia cenocepacia o Burk-
Promoción del Crecimiento e Indicadoras holderia multivorans

Agar selectivo para Burkholderia cepacia Inhibitoria Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus

PRUEBA DE LAS PROPIEDADES INHIBITORIAS, MEDIOS SÓLIDOS

Inocular el medio apropiado con al menos 100 ufc del microorganismo apropiado. Incubar a la temperatura especificada
durante un tiempo no menor al tiempo más largo especificado en la prueba. Se presenta una inhibición del crecimiento del
microorganismo indicado (ver la Tabla 2).

PRUEBA DE PROPIEDADES INDICADORAS

Llevar a cabo el Método de extensión en superficie (ver Pruebas de Recuento Microbiano á61ñ, Prueba de Promoción del Crecimiento,
Aptitud del Método de Recuento y Controles Negativos, Aptitud del Método de Recuento en Presencia del Producto, Recuperación de
Microorganismos en Presencia del Producto, Métodos de Recuento en Placa), inoculando cada placa con un número pequeño (no
más de 100 ufc) del microorganismo indicado. Incubar a la temperatura especificada durante un período que se encuentre
dentro del intervalo indicado en la prueba. Las colonias son comparables, en apariencia y reacciones indicadoras, a aquellas
anteriormente obtenidas con una partida de medio analizada y aprobada previamente (ver la Tabla 2).

l
Aptitud del Método de Prueba

ia
Se debe establecer la capacidad de la prueba para detectar Bcc en presencia del producto a examinar. El tiempo de incubación
para la aptitud del método no debe exceder el tiempo de incubación más corto especificado. Se debe confirmar la aptitud si
hay un cambio en el desempeño de la prueba o un cambio en el producto que pudiera afectar los resultados del análisis.
Para cada producto nuevo a analizar, realizar una preparación de la muestra según se indica en Pruebas de Productos. Al
momento de la mezcla, agregar cada cepa de prueba en el medio de crecimiento indicado. Inocular individualmente las cepas
fic
de prueba. Usar un número de microorganismos equivalente a no más de 100 ufc en la preparación de prueba inoculada.
Llevar a cabo la prueba según se describe en Pruebas de Productos, usando el tiempo más corto de incubación indicado. Se
deben detectar los microorganismos Bcc con las reacciones indicadoras según se describe en Interpretación.
Cualquier actividad antimicrobiana del producto requiere de una modificación del procedimiento de prueba (ver Pruebas de
Recuento Microbiano á61ñ, Prueba de Promoción del Crecimiento, Aptitud del Método de Recuento y Controles Negativos, Aptitud del
Método de Recuento en Presencia del Producto, Neutralización/Eliminación de la Actividad Antimicrobiana).
O

PRUEBAS DE PRODUCTOS

Preparación de la Muestra e Incubación Previa

Preparar una muestra usando una dilución 1-en-10 de no menos de 1 g del producto que se va a analizar. Usar 10 mL o la
cantidad correspondiente a 1 g o 1 mL para inocular una cantidad adecuada (determinada según se describe en Aptitud del
Método de Prueba) de Caldo Digerido de Caseína y Soja o una dilución apropiada de Caldo Digerido de Caseína y Soja según se
determina durante la aptitud del método (por ejemplo, se puede requerir una dilución 1:10 cuando se lleva a cabo un análisis
opcional de aguas para uso farmacéutico). Luego mezclar e incubar a 30°–35° durante 48–72 horas.

Selección y Subcultivo
Subcultivar sembrando en estrías en una placa de agar selectivo para Burkholderia cepacia (BCSA) e incubar a 30°–35° durante
48–72 h.

Interpretación
El crecimiento de colonias de color marrón verdoso con halos de color amarillo o colonias de color blanco rodeadas de una
zona de color rosado–rojo en BCSA indica la posible presencia de Bcc. Cualquier crecimiento en BCSA se confirma mediante
pruebas de identificación. Ver Caracterización, Identificación y Tipificación de Cepas Microbianas á1113ñ para información
adicional.
Si no se detectan colonias de los tipos descritos o si las pruebas de identificación confirmatorias resultan negativas, el producto
cumple con la prueba.

MEDIOS DE CULTIVO RECOMENDADOS

[NOTA—Esta sección se proporciona como información.]

Las siguientes soluciones y medios de cultivo han resultado satisfactorios en el cumplimiento de los objetivos para los cuales
se indican en esta Farmacopea. Se pueden usar otros medios siempre que se pueda demostrar su aptitud.

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Solución Amortiguadora Madre

Transferir 34 g de fosfato monobásico de potasio a un matraz volumétrico de 1000 mL, disolver en 500 mL de Agua
Purificada, ajustar con hidróxido de sodio a un pH de 7,2 ± 0,2, agregar Agua Purificada a volumen y mezclar. Dispensar en
recipientes y esterilizar. Almacenar a una temperatura de 2°–8°.

Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2

Preparar una mezcla de Agua Purificada y Solución Amortiguadora Madre (800:1 v/v) y esterilizar.

Solución Amortiguada de Cloruro de Sodio–Peptona de pH 7,0

Preparar Solución Amortiguada de Cloruro de Sodio–Peptona de pH 7,0 según se indica en la Tabla 3. Esterilizar en un autoclave
usando un ciclo validado.

Tabla 3
Fosfato Monobásico de Potasio 3,6 g
Fosfato ácido disódico dihidrato 7,2 g (equivalente a 0,067 M de fosfato)

Cloruro de sodio 4,3 g

Peptona (de carne o caseína) 1,0 g

l
Agua Purificada 1000 mL

ia
Caldo Digerido de Caseína y Soja
Preparar Caldo Digerido de Caseína y Soja según se indica en la Tabla 4. Ajustar el pH para que después de la esterilización
este sea de 7,3 ± 0,2 a 25°. Esterilizar en un autoclave usando un ciclo validado.
fic
Tabla 4
Digerido pancreático de caseína 17,0 g

Digerido papaínico de soja 3,0 g

Cloruro de sodio 5,0 g

Fosfato dibásico de potasio 2,5 g

O

Glucosa monohidrato 2,5 g

Agua Purificada 1000 mL

Agar selectivo para Burkholderia cepacia

Preparar BCSA según se indica en la Tabla 5. Cuando se prepara el medio internamente, primero se deben preparar los
ingredientes base sin los antibióticos. Ajustar el pH para que después de la esterilización este sea de 6,8 ± 0,3 a 25°. Esterilizar
en un autoclave usando un ciclo validado. Enfriar el medio base a 45°–50° y agregar una solución al 1% de los antibióticos
estériles filtrados, mezclar y verter en las placas.

Tabla 5
Peptona de caseína 10,0 g

Lactosa 10,0 g

Sacarosa 10,0 g

Cloruro de sodio 5,0 g

Extracto de levadura 1,5 g

Rojo de fenol 0,08 g

Gentamicina 10,0 mg

Vancomicina 2,5 mg

Cristal violeta 2,0 mg

Polimixina B 600 000 U

Agar 14,0 g

Agua desmineralizada 1000 mL▲ (USP 1-dic-2019)

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