Cap 51 Prueba de Eficacia

Impreso el: mar. abr. 25 2023, 05:18:24 p. m.
(EST) Estado: Oficial Vigente al 25-abr-2023 DocId: GUID-772FE032-8921-4345-810E-945EF5BF1B15_3_es-ES

Impreso por: Alfonso Delgado Fecha Oficial: Oficial desde 01-may-2018 Tipo de Documento: Capítulos Generales @2023 USPC
No Distribuir DOI Ref: rps0x DOI: https://doi.org/10.31003/USPNF_M98790_03_02
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á51ñ PRUEBAS DE EFICACIA ANTIMICROBIANA

INTRODUCCIÓN
Los conservantes antimicrobianos son sustancias agregadas a productos farmacéuticos acuosos. Las formas farmacéuticas no
estériles pueden tener conservantes agregados para protegerlas del desarrollo de microorganismos introducidos
inadvertidamente durante o después del proceso de fabricación. En el caso de artículos estériles envasados en envases multidosis,
los conservantes antimicrobianos se agregan para inhibir el desarrollo de microorganismos que puedan introducirse por la
extracción reiterada de dosis individuales. En todas las unidades multidosis estériles se espera encontrar uno o más conservantes
antimicrobianos.
Los conservantes antimicrobianos no deben emplearse en lugar de las buenas prácticas de fabricación, solamente para reducir
la población microbiana viable de un producto no estéril, o para controlar la biocarga antes de la esterilización de formulaciones
multidosis durante la fabricación. Los conservantes antimicrobianos de las formas farmacéuticas farmacopeicas cumplen con
los requisitos en Advertencias y Requisitos Generales, 5.20 Sustancias Agregadas.
Todos los agentes antimicrobianos útiles son sustancias tóxicas. Para la máxima protección de los pacientes, la concentración
del conservante que se indique como eficaz en el producto envasado final debe ser inferior al nivel que pueda resultar tóxico
para los seres humanos, basándose en la dosis recomendada del producto medicinal.
La concentración de un conservante antimicrobiano agregado puede mantenerse al mínimo si los ingredientes activos de la
formulación poseen actividad antimicrobiana intrínseca. La eficacia antimicrobiana, ya sea inherente al producto o producida
por la adición de un conservante antimicrobiano, debe ser demostrada para todas las inyecciones envasadas en envases
multidosis o para otros productos que contengan conservantes antimicrobianos. La eficacia antimicrobiana debe ser demostrada
l
para formas farmacéuticas de base acuosa, multidosis tópicas y orales, y para otras formas farmacéuticas, como por ejemplo
oftálmicas, óticas, nasales, de irrigación y líquidos de diálisis (ver Formas Farmacéuticas á1151ñ). Para los propósitos de la prueba,
ia
"acuoso" se define como una actividad de agua de más de 0,6 (ver Determinación de Actividad de Agua en Productos Farmacéuticos
No Estériles á1112ñ).
Los organismos de desafío se basan generalmente en los posibles contaminantes del producto farmacéutico, teniendo en
cuenta los atributos físicos, la formulación y el uso previsto del mismo. La serie de organismos de desafío estándar descrita en
esta prueba no necesita prevenir la inclusión de otras especies, si se considera útil para medir la actividad biológica de los
fic
conservantes de un producto específico. Estos organismos de desafío suplementarios no se discuten en este capítulo, pero se
pueden añadir a los organismos de prueba descritos.
PROCEDIMIENTOS GENERALES
Este capítulo proporciona procedimientos para demostrar la eficacia de conservantes antimicrobianos agregados. Estos
conservantes antimicrobianos deben estar declarados en la etiqueta. Los procedimientos y los criterios de aceptación para la
O
eficacia se aplican a un producto en el envase original sellado en el que fue distribuido por el fabricante (ver la Tabla 1 para
categorías de productos). Esta prueba no tiene que realizarse en estos envases, pero se debe evitar el uso de materiales que
puedan interaccionar con el conservante en los envases que se usan para la prueba de eficacia microbiana.
Procedimiento de Promoción del Crecimiento y Aptitud del Método de Recuperación

CONSIDERACIONES GENERALES
Debe establecerse la capacidad del procedimiento para detectar microorganismos de desafío en presencia de un producto a
examinar adecuadamente neutralizado. La aptitud del procedimiento debe volver a confirmarse si se produce algún cambio en
los materiales o métodos, el producto o los materiales que están en contacto directo con el producto y que pueda alterar los
resultados de la prueba.
Debe establecerse la capacidad promotora del crecimiento de los medios usados en este procedimiento.
PREPARACIÓN DE CEPAS DE PRUEBA

Usar suspensiones estandarizadas de cepas de prueba o preparar según se indica a continuación. Las técnicas de
mantenimiento de cultivos de lote de siembra (sistemas de lote de siembra) se usan para que los microorganismos viables
empleados para inoculación correspondan a no más de cinco pasajes desde el lote de siembra maestro original. Cultivar por
separado cada cepa bacteriana y fúngica de prueba (ver la Tabla 2).
Usar los cultivos de los siguientes microorganismos:1 Candida albicans (ATCC Nº 10231), Aspergillus brasiliensis (ATCC Nº
16404), Escherichia coli (ATCC Nº 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC Nº 9027) y Staphylococcus aureus (ATCC Nº 6538).
Los microorganismos viables empleados en el procedimiento deben formar parte de un cultivo de crecimiento reciente (p. ej.,
en fase logarítmica de crecimiento) a excepción de las esporas A. brasiliensis. Se describen las condiciones de cultivo para el
inóculo (ver la Tabla 2) donde los medios adecuados son el Agar Digerido de Caseína y Soja o Medio de Agar Sabouraud
Dextrosa.
Para cosechar los cultivos bacterianos y de C. albicans, emplear solución salina SR estéril, lavar la superficie de crecimiento y
recogerlo en un recipiente adecuado. Para cosechar las esporas de A. brasiliensis, usar solución salina SR estéril que contenga
0,05% de polisorbato 80. La suspensión de esporas debe tratarse asépticamente (p. ej., filtración a través de lana de vidrio
1 Disponible en American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 (http://www.atcc.org).
https://online.uspnf.com/uspnf/document/4_GUID-772FE032-8921-4345-810E-945EF5BF1B15_3_es-ES 1/4
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estéril) para eliminar hifas. Todas las suspensiones microbianas deben prepararse para garantizar que no se produce un traslado
de medio de crecimiento residual del inóculo (p. ej., centrifugación seguida de resuspensión en un líquido de suspensión estéril
apropiado).
Como alternativa, los organismos del cultivo madre pueden crecer en un medio líquido adecuado (es decir, Caldo Digerido
de Caseína y Soja o Caldo Sabouraud Dextrosa) y las células se pueden cosechar mediante centrifugación, luego lavar y
resuspender en líquido de suspensión estéril apropiado. Las suspensiones microbianas que se usan para inoculaciones deben
ajustarse para obtener un recuento microbiano de aproximadamente 1 × 108 ufc/mL. Usar las suspensiones bacterianas y de
levaduras dentro de las 2 horas o dentro de las 24 horas, si se almacenan entre 2° y 8°. Se puede preparar una suspensión de
esporas estable y mantenerla a 2°–8° hasta 7 días. [NOTA—El cálculo estimado de la concentración del inóculo se puede obtener
mediante procedimientos turbidimétricos para los microorganismos de desafío y luego confirmarse mediante un recuento en
placa.]
PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO DE LOS MEDIOS

Los medios usados en este procedimiento deben ser capaces de permitir el crecimiento microbiano. Analizar cada partida
de medio listo para usar y cada partida de medio preparado a partir de medio deshidratado o de los ingredientes descritos.
Para medios sólidos, los recuentos obtenidos deben ser al menos 50% del valor calculado para un inóculo estandarizado.
Para un inóculo recientemente preparado, se produce un crecimiento de microorganismos comparable al obtenido
anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada previamente.
Aptitud del Método de Recuento en Presencia del Producto

Preparar una dilución 10−1 (en volumen) agregando 1 mL del producto a 9 mL de solución salina u otro diluyente
l
neutralizante. Continuar este patrón de dilución hasta niveles de dilución 10−2 y 10−3. Agregar un número apropiado de
organismos de desafío a cada tubo de producto diluido, mezclar y sembrar en placa un volumen adecuado de cada dilución
ia
para obtener menos de 250 ufc/placa para bacterias y levaduras (idealmente entre 25 y 250 ufc) o menos de 80 ufc/placa para
A. brasiliensis (idealmente entre 8 y 80 ufc). Esta siembra en placa debe realizarse como mínimo por duplicado (aunque un
número mayor de repeticiones puede ser útil para minimizar la variabilidad en la estimación del recuento en placa). Se realiza
un control positivo de este procedimiento al introducir los mismos inóculos en solución salina y transferir volúmenes similares
de solución salina a placas de agar. Un patrón de recuperación adecuado es aquél que proporciona al menos 50% del recuento
fic
de esta solución salina de control (promediado).
Si el producto diluido presenta propiedades antimicrobianas, quizás deban incorporarse neutralizadores específicos a los
diluyentes o a los medios de recuperación. Para más información, ver Validación de Recuperación Microbiana en Artículos
Farmacopeicos á1227ñ.
La capacidad del procedimiento para medir la eficacia de los conservantes puede verse comprometida si la aptitud del método
requiere una dilución significativa (10−2 ó 10−3), ya que esto afectará la recuperación medida (p. ej., puede ser difícil medir una
reducción logarítmica de 3 unidades para un inóculo de 105–106). Si no se encuentra un agente neutralizador o método
adecuado y la aptitud del método requiere una dilución significativa, se puede usar un nivel más alto de inóculo (p. ej., 107–
O
108) de manera que se pueda medir una reducción logarítmica de 3 unidades. El promedio de la recuperación informada no
puede ser menos de 1 ufc/placa (o 100 ufc/mL si se realiza el recuento en placa de 1 mL por duplicado a una dilución de 10−2).
La filtración por membrana se puede usar para filtrar volúmenes más grandes de diluciones para contrarrestar esta dificultad o
para asistir en la neutralización de las propiedades antimicrobianas.
Análisis del Producto

CATEGORÍAS DE PRODUCTOS
Para los fines de análisis, los artículos farmacopeicos se dividen en cuatro categorías (ver la Tabla 1). Los criterios de eficacia
antimicrobiana para estos productos se establecen en función de la ruta de administración. Es de esperar que las formulaciones
que contienen conservantes cumplan con los estándares mínimos de eficacia, si están envasados en envases multidosis o en
envases unitarios.
Tabla 1. Categorías de Productos Farmacopeicos

Categoría Descripción del Producto
Inyectables, otros parenterales incluyendo emulsiones, productos óticos, productos nasales estériles y productos oftál-
1 micos preparados con bases o vehículos acuosos
Productos empleados de manera tópica preparados con bases o vehículos acuosos, productos nasales no estériles y
2 emulsiones, incluyendo aquéllos que se aplican a membranas mucosas
3 Productos orales a excepción de antiácidos, preparados con bases o vehículos acuosos
4 Antiácidos preparados con una base acuosa
PROCEDIMIENTO
El procedimiento puede realizarse ya sea en cinco envases originales, si hay suficiente volumen de producto disponible en
cada envase y si el envase del producto puede ser penetrado asépticamente (es decir, aguja y jeringa a través de un tapón de
goma elastomérico), o en cinco recipientes bacteriológicos estériles con tapa [inerte con respecto a los agentes antimicrobianos]
3
de tamaño adecuado a los que se ha transferido un volumen suficiente de producto. Inocular cada envase o recipiente, según
corresponda, con uno de los inóculos preparados y normalizados, y mezclar. El volumen de suspensión del inóculo empleado
está entre 0,5% y 1,0% del volumen del producto para minimizar los efectos potenciales en el producto. La concentración de
microorganismos de prueba agregados al producto (Categoría 1; 2 ó 3) es tal que la concentración final de la preparación de
prueba después de la inoculación está comprendida entre 1 × 105 y 1 × 106 ufc/mL del producto. En los productos de la Categoría
4 (antiácidos), la concentración final de la preparación de prueba después de la inoculación está comprendida entre 1 × 103 y
1 × 104 ufc/mL del producto.
La concentración inicial de microorganismos viables en cada preparación de prueba se calcula a partir de la concentración
de microorganismos en cada inóculo normalizado determinada mediante el método de recuento en placa. Incubar los envases o
recipientes inoculados a 22,5 ± 2,5°. Tomar muestras de cada uno de ellos en los intervalos apropiados (especificados en la
Tabla 3). Registrar todos los cambios de apariencia observados en estos intervalos. Determinar mediante el procedimiento de
recuento en placa el número de ufc presentes en cada preparación de prueba en los intervalos correspondientes (ver
Procedimientos Generales en Pruebas de Recuento Microbiano á61ñ). El recuento en placa se realizará usando un mínimo de placas
por duplicado, con el número de ufc promediado antes de la determinación de ufc/mL deducido. Si se usa filtración por
membrana, usar filtros de membrana por duplicado para cada estimación. Usando las concentraciones calculadas de ufc/mL
presentes al inicio de la prueba, calcular el cambio en valores log10 de la concentración de ufc/mL para cada microorganismo
en los intervalos de prueba aplicables, y expresar los cambios en la concentración en términos de reducciones logarítmicas. La
reducción logarítmica se define como la diferencia entre el valor de la concentración inicial de ufc/mL en la suspensión, en
unidades log10, y el valor de ufc/mL, en unidades log10, de los sobrevivientes al tiempo correspondiente.
Tabla 2. Condiciones de Cultivo para la Preparación de Inóculos

Tiempo de
Tiempo Incubación de
l
Temperatura de Incubación Recuperación
Organismo Medio Apropiado de Incubación del Inóculo Microbiana
Escherichia coli
(ATCC Nº 8739)
Caldo Digerido de Caseína y
Soja;
Agar Digerido de Caseí-
na y Soja

ia
32,5 ± 2,5° 18–24 horas 3–5 días
fic
Soja;
Pseudomonas aeruginosa Agar Digerido de Caseí-
(ATCC Nº 9027) na y Soja 32,5 ± 2,5° 18–24 horas 3–5 días
Soja;
Staphylococcus aureus Agar Digerido de Caseí-
(ATCC Nº 6538) na y Soja 32,5 ± 2,5° 18–24 horas 3–5 días
Medio de Agar Sabouraud
O
Candida albicans Dextrosa;

(ATCC Nº 10231) Caldo Sabouraud Dextrosa 22,5 ± 2,5° 44–52 horas 3–5 días
Aspergillus brasiliens Agar Sabouraud Dextrosa;

(ATCC Nº 16404) Caldo Sabouraud Dextrosa 22,5 ± 2,5° 6–10 días 3–7 días
Criterios de Eficacia Antimicrobiana

Los requisitos de eficacia antimicrobiana se alcanzan si se cumplen los criterios especificados en la Tabla 3 (ver Advertencias y
Requisitos Generales, 7. Resultados de Pruebas). La expresión “ningún incremento” en los recuentos se define como no más de
0,5 unidades log10 por encima del valor con el que se compara.
Tabla 3. Criterios para los Microorganismos Evaluados

En productos de la Categoría 1
A los 7 días, una reducción logarítmica de no menos de 1,0 desde el recuento inicial calculado; a
los 14 días, una reducción logarítmica de no menos de 3,0 del recuento inicial; y a los 28 días
Bacterias ningún incremento con respecto al recuento de los 14 días.
Levaduras y Hongos Ningún incremento a los 7, 14 y 28 días con respecto al recuento inicial
Filamentosos
A los 14 días, una reducción logarítmica de no menos de 2,0 desde el recuento inicial; y a los
Bacterias 28 días ningún incremento con respecto al recuento de los 14 días
Levaduras y Hongos Ningún incremento a los 14 y 28 días con respecto al recuento inicial
Filamentosos
A los 14 días, una reducción logarítmica de no menos de 1,0 desde el recuento inicial; y a los
Bacterias 28 días ningún incremento con respecto al recuento de los 14 días
Levaduras y Hongos Ningún incremento a los 14 y 28 días con respecto al recuento inicial
Filamentosos
4
Tabla 3. Criterios para los Microorganismos Evaluados (continuación)

Bacterias, Levaduras y Hongos Filamentosos Ningún incremento a los 14 y 28 días con respecto al recuento inicial
l
ia
fic
O

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Procedimiento de Promoción del Crecimiento y Aptitud del Método de Recuperación

PREPARACIÓN DE CEPAS DE PRUEBA

PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO DE LOS MEDIOS

Aptitud del Método de Recuento en Presencia del Producto

Análisis del Producto

Tabla 1. Categorías de Productos Farmacopeicos

3 Productos orales a excepción de antiácidos, preparados con bases o vehículos acuosos

4 Antiácidos preparados con una base acuosa

Tabla 2. Condiciones de Cultivo para la Preparación de Inóculos

Caldo Digerido de Caseína y

Candida albicans Dextrosa;

Aspergillus brasiliens Agar Sabouraud Dextrosa;

Criterios de Eficacia Antimicrobiana

Tabla 3. Criterios para los Microorganismos Evaluados

Tabla 3. Criterios para los Microorganismos Evaluados (continuación)

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