CROMATOGRAFÍA

LABORATORIO N°4 GRUPO 1

DOCENTE: Luis Guillermo Borja Hidalgo

Luis Fernando Del Castillo Martelo 2022211009

Ana Valentina Collante 2022211019

Carlos Alfredo Godoy 2022211049

RESUMEN
En un esfuerzo por profundizar en el estudio de pigmentos derivados de fuentes vegetales, se ejecutaron series
de experimentos centrados específicamente en aquellos pigmentos encontrados en extractos de espinaca y en la
sustancia denominada azul metileno. Las herramientas principales de investigación seleccionadas fueron las
técnicas de cromatografía, tanto en su variante de columna como en capa fina. Estas metodologías no solo
proporcionaron un entendimiento más profundo de su funcionamiento y aplicabilidad, sino que también
demostraron ser esenciales para la separación precisa de pigmentos específicos, como la clorofila y las
antocianinas. Al concluir estos procedimientos experimentales, se logró con éxito el aislamiento y posterior
identificación de tres pigmentos distintos dentro del extracto de espinaca. Este proceso de identificación se basó
en la medición y comparación de sus valores de retención, conocidos en el ámbito científico como Rf.

ABSTRACT
In an endeavor to delve deeper into the study of pigments derived from plant sources, a series of experiments
were conducted, specifically focusing on pigments found in spinach extracts and the substance termed as
methylene blue. The primary investigative tools chosen were chromatography techniques, both in their column
variant and thin-layer format. These methodologies not only provided a deeper understanding of their operation
and applicability but also proved pivotal for the precise separation of specific pigments, such as chlorophyll and
anthocyanins. Upon concluding these experimental procedures, three distinct pigments within the spinach extract
were successfully isolated and subsequently identified. This identification process was anchored in measuring and
comparing their retention values, scientifically known as Rf values.

PALABRAS CLAVE
Mezcla, fases, móvil, estacionaria, eluyente

KEY WORDS
Mixture, phases, mobile, stationary, eluent
INTRODUCCIÓN
La cromatografía, una técnica analítica preeminente, ha demostrado ser esencial en múltiples campos de la ciencia
y la industria para separar y analizar diversos compuestos químicos. El fundamento de esta técnica radica en la
interacción diferencial de los componentes de una muestra entre las fases estacionaria y móvil, convirtiéndola en
una herramienta indispensable para identificar y cuantificar sustancias en innumerables contextos. A lo largo de
las décadas, desde su invención en el siglo XX, la cromatografía ha experimentado una evolución considerable,
ofreciendo una mayor precisión y adaptabilidad en la descomposición de mezclas complejas.

El objetivo principal de este documento es ofrecer una panorámica de los conceptos subyacentes de la
cromatografía, abordando sus variantes y aplicaciones, así como describir los procedimientos y equipamientos
habituales en el laboratorio. Adicionalmente, se expondrán los hallazgos de dos experimentos cromatográficos
particulares, resaltando su papel crucial en el análisis y diferenciación de sustancias. A través de este análisis, se
busca elucidar la importancia cardinal de la cromatografía en ámbitos de investigación e industriales, validando su
posición como un instrumento determinante para el progreso en numerosos campos de estudio.

Algunas modalidades relevantes de la cromatografía incluyen:

Cromatografía de Capa Fina (TLC): Este método emplea placas cubiertas con absorbentes para distinguir
compuestos basados en su movilidad a través de un solvente.

Cromatografía en Columna: Usa una columna cargada con material absorbente para segmentar componentes por
sus diferentes grados de afinidad con una fase móvil.

Cromatografía de Gases (GC): Distingue componentes según su volatilidad y su afinidad por una columna
estacionaria específica.

Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC): Aplica presión elevada para mover una muestra a través de una
columna, separando compuestos con gran precisión.

Cromatografía de Intercambio Iónico: Se centra en separar iones con base en sus cargas y preferencias por ciertas
resinas.

Cromatografía de Afinidad: Ideal para purificar biomoléculas, se fundamenta en la unión específica entre
moléculas y matrices de afinidad.

Cromatografía de Exclusión Molecular (SEC): Se basa en separar moléculas por tamaño utilizando columnas
repletas de material poroso.

Cromatografía de Fase Inversa: Una variante del HPLC, usa una fase estacionaria apolar y una fase móvil polar para
segmentar compuestos.

Cromatografía en Papel: Una técnica más sencilla que utiliza papel como matriz, separando componentes a través
de la acción capilar.

Con la variedad de técnicas disponibles, los científicos y profesionales pueden elegir la más adecuada según la
naturaleza de la muestra y los objetivos del análisis.
MATERIALES

Materiales y equipos usados Sustancias

Micro-pipeta automático y puntas amarrillas usadas
Colector de muestra (Biales)
Frasco lavador Hexano (C₆H₁₄)
Vidrio reloj
Balanza digital
Agua destilada
Beaker 25 mL (2) Agua (H2O)
Beaker 500 mL (1) para residuos ácidos, básicos, neutros
Tubos de ensayo (2)
Gradilla para tubos de ensayo (1)
Cámara cromatográfica Silica gel
Columna cromatografica
Algodón
Matraz de erlenmeyer
Frasquitos
Vaso de precipitado
Soporte
Embudo

METODOLOGIA
Parte 1: Cromatografía en capa delgada

Una vez que preparamos adecuadamente nuestra muestra de espinaca, procedimos con el análisis
cromatográfico. Tomando nuestro colector de muestras, denominado Biales, marcamos dos líneas verticales de
5mm en ambos extremos. Acto seguido, aplicamos con cuidado una gota del extracto líquido de espinaca sobre
una de las líneas marcadas en el extremo. Con todo listo, introdujimos el Biales en la cámara cromatográfica, que
previamente había sido cargada con 2ml de hexano.

A medida que el tiempo avanzaba, el hexano actuaba como un disolvente móvil, ascendiendo por el Biales. Al
hacerlo, arrastraba consigo los diferentes pigmentos presentes en la muestra de espinaca. Es importante destacar
que cada pigmento posee una propensión única a moverse con el hexano, lo que se traduce en diferentes
velocidades de ascenso. Este fenómeno resulta en la formación de distintas franjas coloreadas en el Biales, donde
cada color representa un componente específico de la espinaca. Estas franjas no solo revelan la presencia de
dichos componentes, sino que también ofrecen una visualización clara de la diversidad de compuestos presentes
en la muestra analizada. La cromatografía, en este caso, actúa como una ventana que nos permite observar y
entender la complejidad química de la espinaca en una representación visual simplificada.
Parte 2: Cromatografía de columna
Llenado de la columna: Iniciar el proceso de cromatografía requiere una preparación cuidadosa y meticulosa de
la columna. Primero, aseguramos la columna en una posición vertical utilizando un soporte adecuado,
garantizando su estabilidad y evitando posibles derrames. Una vez estable, introducimos una pequeña cantidad
de algodón en el fondo de la columna. Esta etapa es crucial para evitar que el adsorbente se salga durante el
proceso. Debajo de la columna, colocamos un Erlenmeyer para recoger cualquier líquido que pueda gotear. Con
la llave de la columna cerrada, vertemos el disolvente, que actuará como eluyente, llenando aproximadamente la
mitad de la columna. El siguiente paso es añadir el adsorbente. Lo hacemos en pequeñas porciones para asegurar
que, al asentarse en el fondo, se distribuya uniformemente y se humedezca correctamente, evitando así la
formación de grumos que podrían afectar la eficiencia del proceso. Para asegurar un asentamiento uniforme del
adsorbente, es esencial agitar suavemente la columna con golpes delicados, evitando la formación de canales,
grietas o burbujas que podrían comprometer el proceso de separación. Una vez que se ha añadido todo el
adsorbente y se ha asentado correctamente, permitimos que el disolvente gotee lentamente, preparando la
columna para la introducción de la muestra.

Introducción de la muestra: La cromatografía es una técnica poderosa para separar mezclas complejas, y en este
caso, utilizamos una mezcla de pigmentos vegetales. Con cuidado y precisión, introducimos la muestra
directamente en la parte superior de la columna. Utilizamos una pipeta para este proceso, añadiendo la mezcla
gota a gota, para asegurar una introducción controlada y evitar la saturación del adsorbente. Una vez introducida
la muestra, abrimos la llave de la columna, permitiendo que el disolvente fluya y comience el proceso de
separación. Monitoreamos de cerca el proceso y observamos la emergencia de distintas bandas de color, que
representan la separación de los componentes de la muestra. Cada una de estas bandas se recoge en diferentes
recipientes, asegurando así la obtención de muestras puras de cada componente separado.

Resumen: Se llevó a cabo un proceso de cromatografía utilizando una columna preparada meticulosamente. Esta
columna se llenó con un adsorbente y se introdujo una muestra de pigmentos vegetales. Durante el proceso, se
observó la separación de los componentes de la muestra en distintas bandas de color.

Conclusión: El proceso de cromatografía demostró ser eficaz para la separación de los componentes de la mezcla
de pigmentos vegetales. La correcta preparación y llenado de la columna fueron cruciales para obtener una
separación clara y definida. Las distintas bandas de color obtenidas evidencian la diversidad de compuestos
presentes en la muestra original, y la técnica permitió la recolección de estos componentes de manera
individualizada y pura.

RESULTADOS
Para este informe se realizó la separación de los pigmentos que contiene fotosintéticos que tiene la hoja de
espinaca por medio de la cromatografía en capa delgada y la de columna. En el caso de cromatografía de capa
delgada, utilizando las Biales como fase estacionaria y el hexano como la fase móvil. Las hojas de espinaca
contienen productos naturales como la clorofila y carotenos. El pigmento fotosintético mayoritario en extracto es
la clorofila a y b; es el principal agente que le da ese color verde característico a las hojas junto a los carotenos.
también ese logro apreciar la xantofila que es un derivado de los carotenos.
Los pigmentos que tiene la hoja de espinaca tienen una baja polaridad, esto mismo hace estacionaria sea más
rápida, de tal manera que, para extraer los pigmentos se usa el hexano como eluyente porque es soluble. Cabe
mencionar que al ser eluyente esto hace que se separe más fácil y pueda propulsarlo.

Cálculos del RF:

Da= Hay 4cm de la línea amarilla a la línea de referencia

Da = 4/4.8*100= 83%

Db= Hay 3 cm de la línea verde a la línea de referencia

Db= 3/4.8*100= 63.5%

Estos porcentajes equivalen a la distancia que recorrido la clorofila y la xantofila con respecto a la línea de
referencia.

DISCUSION
A lo largo de ambos experimentos, tuvimos la oportunidad de examinar minuciosamente las metodologías de
cromatografía. En el experimento relacionado con la cromatografía de capa delgada, nos basamos en la
investigación realizada por Carolyn Aguilera. Resultó notable que nuestros resultados en cuanto a la separación y
determinación de los pigmentos de la espinaca mostraron una gran similitud con los hallazgos de Aguilera,
sugiriendo una consistencia en la técnica y resultados.
Por otro lado, en el experimento de cromatografía de columna, tomamos como referencia el estudio llevado a
cabo por Martha Ruiz de la Universidad Simón Bolívar en 2020. Martha observó una clara separación de las
distintas sustancias y fases presentes en la columna cromatográfica. Esta observación coincidió con lo que Aguilera
había reportado anteriormente en su trabajo.

Estas concordancias entre investigaciones y nuestros experimentos no solo refuerzan la validez y confiabilidad de
las técnicas de cromatografía, sino que también subrayan su importancia y precisión en la investigación científica.
Es evidente que, cuando se aplican correctamente, estas técnicas proporcionan resultados consistentes y
replicables, fundamentales para avanzar en el conocimiento y comprensión de diversas sustancias y mezclas
químicas.

CONCLUSIONES
La cromatografía de capa delgada y de columna son herramientas valiosas en el ámbito científico para
descomponer y analizar componentes individuales de mezclas intrincadas, como es el caso de los pigmentos
presentes en las hojas de espinaca. En el desarrollo de este experimento, se depositó una muestra del extracto de
espinaca en una placa recubierta de sílice, que posteriormente se introdujo en una cámara conteniendo hexano.
A medida que el hexano ascendía por la placa mediante el proceso de capilaridad, ejercía una acción diferencial
sobre los pigmentos, desplazándolos a distintas alturas en función de sus características de polaridad.

A lo largo del experimento, pudimos distinguir claramente tres bandas coloreadas: una de tonalidad verde pálido,
otra amarilla y una final de color azul. Estos matices son representativos de los pigmentos clorofila a, clorofila b y
xantofila respectivamente. El resultado no solo reveló la presencia de estos tres pigmentos, sino que también
enfatizó sus diferencias intrínsecas en cuanto a propiedades físicas y químicas.

Concluyendo, este experimento no solo validó que las hojas de espinaca albergan al menos tres pigmentos
primordiales con propiedades únicas, sino que también destacó la potencia de la cromatografía como un enfoque
preciso y eficiente para la separación y identificación de componentes individuales en mezclas complejas. Esta
técnica sigue siendo fundamental para avanzar en la comprensión y caracterización de sustancias naturales y
sintéticas en diversas áreas de la ciencia.

BIBLIOGRAFIAS
1. (2020-08-12). Introducción a la cromatografía. Recuperado de https://quimicafacil.net/tecnicas-de-
laboratorio/introduccion-a-la-cromatografia/
2. Rodrigo. (2019). Tipos de cromatografía: ¿cuáles existen? Net Interlab. Recuperado de https://net-
interlab.es/tipos-de-cromatografia/
3. Cromatografía - concepto, principios, tipos, fases y ejemplos. (s. f.). Concepto. Recuperado de
https://concepto.de/cromatografia/
4. Why do we use alcohol to remove chlorophyll? – Sage-Answer. (2020, 2 agosto). Recuperado de
https://sage-answer.com/why-do-we-use-alcohol-to-remove-chlorophyll/
5. Aguilera, Carolyn. (s. f.). Cromatografia de capa fina y columna. Recuperado de
https://acortar.link/E2oc81
6. Ruiz, Martha. (2020, Agosto). Cromatografia de capa fina y columna. Recuperado de
https://hdl.handle.net/20.500.12442/7984
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1. ¿Qué motivo nos lleva a usar alcohol en la extracción de clorofila y otros pigmentos en muestras
vegetales?

El alcohol es seleccionado en la extracción de pigmentos vegetales, como la clorofila, debido a su naturaleza polar.
Los compuestos polares, tales como la clorofila y otros pigmentos, son solubles eficientemente en disolventes
polares como el alcohol. La elección de este disolvente optimiza la extracción, permitiendo separar los pigmentos
de otros constituyentes de la muestra de forma efectiva.

2. Si se incorporase benceno a la solución alcohólica con pigmentos vegetales, resultando en un benceno

verde y una solución alcohólica amarillo-naranja, ¿qué nos revelaría esto?

La transformación del benceno a un color verde, mientras que la solución alcohólica adopta un tono amarillo-
naranja, sugiere que los pigmentos como la clorofila tienen mayor afinidad hacia el benceno que hacia el alcohol.
Esto puede interpretarse como una indicación de que el benceno es menos polar que el alcohol, y por lo tanto,
tiene una mayor capacidad para solubilizar compuestos menos polares.

3. ¿Qué técnicas cromatográficas se encuentran actualmente en uso en un laboratorio investigativo y cuál

es la base de su funcionamiento?

En el ámbito de los laboratorios contemporáneos, existen varias técnicas cromatográficas, entre las que se
encuentran:

Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC): Basada en la utilización de una columna y un líquido a presiones
elevadas, esta técnica permite una separación de alta definición de una vasta gama de compuestos.

Cromatografía de Gases (GC): Ideal para compuestos volátiles, se apoya en el uso de un gas portador y una
columna capilar para separar sustancias volátiles.

Cromatografía de Intercambio Iónico: Esta técnica se especializa en segmentar iones basándose en sus
propiedades de carga y su interacción con resinas específicas.

Cromatografía de Afinidad: Explota interacciones específicas, como la unión entre anticuerpos y antígenos, para
purificar compuestos.

Cromatografía de Exclusión Molecular: Distingue moléculas en base a su tamaño, empleando columnas repletas
de materiales porosos.

Cromatografía en Columna: Empleando una columna cargada con un material específico y una fase móvil, esta
técnica separa compuestos basados en su afinidad y solubilidad.

4. Al optar por un eluyente más polar en lugar de uno menos polar, ¿de qué manera se modifica la elución
de un alcohol? ¿Y de una cetona?

Cuando se reemplaza un eluyente de menor polaridad por uno más polar, la velocidad de elución de alcoholes
suele disminuir debido a su mayor interacción con el solvente polar. Las cetonas, siendo menos polares que los
alcoholes, por lo general aumentarán su velocidad de elución en presencia de un eluyente más polar.

5. ¿El valor Rf, está influenciado por el tipo de adsorbente o el eluyente que se utilice? Por favor, explique.
El valor Rf es altamente sensible a las condiciones del experimento. Cambios en el tipo de adsorbente alteran las
interacciones entre el compuesto y la fase estacionaria, lo que puede influir en el Rf. De manera análoga, si se
modifica el eluyente, se altera la polaridad y, por ende, las interacciones entre el compuesto y el eluyente,
afectando así el valor Rf. En resumen, el Rf no es una constante, sino que se ve afectado por las condiciones
específicas bajo las cuales se realiza la cromatografía.