UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

FACULTAD DE CC.QQ. Y FARMACIA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA
“SARA BASTERRECHEA DE MONZÓN”
QUÍMICA ORGÁNICA I
PRIMER SEMESTRE 2023

Elaborado por: Licda. Irma Nohemí Orozco, Licda. Nora del Carmen Guzmán
Revisado y editado por: Br. Carlos Vargas, Br. Juan Carlos Velásquez

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA-CC-
SEPARACIÓN DE PIGMENTOS POR CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

Objetivos: Que el estudiante:

● Conozca la técnica de cromatografía en columna como método de separación y
purificación de un compuesto orgánico que forma parte de una mezcla.
● Aplique la técnica de cromatografía en columna para la separación de pigmentos
vegetales.
● Utilice materiales de uso común en los hogares, para realizar la técnica de
cromatografía
● Desarrolle la práctica de cromatografía en forma eficiente y responsable, en
ambiente fuera del laboratorio de Química Orgánica.
● Haga un manejo adecuado y responsable de los desechos generados en el
desarrollo del trabajo práctico

Material que el estudiante debe tener en su casa:

● Jeringa descartable de 60 ml.
● Papel filtro
● Manguera para administración de sueros con llave reguladora
● Soporte para la jeringa
● Beaker de 100 mL o recipiente de vidrio similar
● Tubos de ensayo de 10 mL o más, de preferencia con tapón de hule o corcho.
● Etiquetas o maskin tape para rotular
● Marcador rotulador
● Mortero y pistilo
● Embudo
● Espátula
● Micropipeta
● Papel mayordomo o similar
● Pinza para tubo de ensayo, pinza universal o similar
● Equipo de seguridad personal

Reactivos:
● 2 onzas de bicarbonato de sodio
● 100 mL de solvente mineral (comprar en ferretería)
● Acetona pura (sin color y sin aditivos)
● Material vegetal, hojas verdes (de preferencia espinaca o yerba de pollo )
● Etanol al 90%.
Sustancias a investigar: Bicarbonato de sodio, acetona (2-propanona), solvente mineral

Descripción
Se realizará la separación de pigmentos que están presentes en una muestra vegetal, con
el objeto de apreciar un método de separación de metabolitos secundarios de una muestra
vegetal, utilizando la técnica de cromatografía en columna.

Definición
La cromatografía (del griego khrôma = color y graphos = escritura) es un procedimiento
físico-químico que permite separar los componentes o sustancias integrantes de una
mezcla, por adsorción o separación diferencial entre dos fases, una de las cuales es
estacionaria y la otra móvil.

Fundamento teórico
Existen varios tipos de cromatografía, y básicamente constituyen una serie de técnicas de
separación y purificación de compuestos que actualmente son de gran utilidad en los
laboratorios debido a la gran diversidad de aplicaciones que tienen en la Química Orgánica,
en el Inorgánica y en la Bioquímica, ya sea para fines de purificación y separación de
mezclas de identificación y/o de cuantificación de compuestos.

La mezcla de sustancias en solución para separarse se aplica a un medio de sostén. Este

puede ser papel (cromatografía en papel), una capa de sílice (cromatografía en capa fina) o
una columna rellena con resina adsorbente o de intercambio iónico (cromatografía en
columna).

Se deja correr por medio de sostén un disolvente revelador y corre junto a él la mezcla de
las sustancias aplicadas. En el proceso, las diferentes moléculas de la mezcla son
arrastradas a distintas velocidades, por lo que estas sustancias se van separando
eventualmente. El grado de la separación depende de cuatro fuerzas que operan
independiente, las cuales son:
● La velocidad de flujo del disolvente
● La solubilidad de las sustancias en el disolvente
● Los efectos de fraccionamiento
● Los efectos de adsorción.

Los primeros dos factores son responsables de la movilización de la mezcla de sustancias

a través del medio de sostén y los dos últimos factores, son responsables del retardo del
movimiento de la mezcla a través del medio de sostén.

El flujo del disolvente no es el mismo para todas las sustancias presentes en la mezcla. Si
todas las sustancias fueran completamente solubles, no habría separación. No obstante, es
muy raro que las sustancias tengan la misma solubilidad en un disolvente o mezcla de
disolventes dada. Por lo tanto uno de los factores primordiales que determinan la
separación cromatográfica es la combinación de la solubilidad y del flujo del disolvente.
Una de las primeras técnicas desarrolladas fue la de cromatografía en columna. En esta, es
necesario utilizar un tubo de vidrio o plástico inerte, que se denomina columna, que tiene
en uno de sus extremos alguna llave o dispositivo que permite regular el flujo del contenido.
La columna se rellena con un material pulverizado que funcionará como la fase
estacionaria en el sistema cromatográfico y que puede ser: sílica gel, alúmina, óxido de
magnesio, carbonato o bicarbonato de sodio, almidón, carbón activado, etc.

Al rellenar la columna se dice que se está “empacando” y la forma de empaque es

determinante en el resultado de la separación; una buena técnica de empaque es aquella
que no deja bolsas de aire y permite que toda la fase estacionaria esté uniformemente
distribuida en la columna, pero no en forma demasiado compacta que limite el flujo de
solvente que se usará luego como fase móvil. El empaque de la columna puede hacerse de
dos maneras, básicamente un “empaque seco”, en el cual se añade la fase estacionaria a
la columna directamente, o bien un “empaque húmedo” en el cual la columna se llena
primer con el solvente que se va a usar como fase móvil y después se añade la fase
estacionaria poco a poco.

La fase móvil a utilizar es generalmente un solvente orgánico de polaridad bastante distinta

a la del material empleado como fase estacionaria, el cual normalmente tiene actividad
como adsorbente bastante alta, para que así pueda establecerse un equilibrio de
distribución de los componentes de la muestra entre la fase estacionaria y la fase móvil, de
acuerdo a su mayor afinidad por una de las dos fase. La fase móvil debe fluir
constantemente sobre la columna que contiene el adsorbente, para evitar la formación de
bolsas de aire, que arruinarán la separación. Puede suspenderse un momento la adición de
fase móvil para añadir la muestra a la columna, previamente disuelta en la misma fase
móvil y en otro solvente miscible con esta última, pero en ningún momento debe permitirse
que la columna se seque. La selección de o los solventes usados como fase móvil depende
del material seleccionado como fase estacionaria y si se va a emplear más de uno, se inicia
con el de menor polaridad.

El procedimiento de ir añadiendo fase móvil a la columna se conoce como elución y al

líquido que sale de la columna se le llama a menudo eluato, y contendrá la fase móvil y
cada uno de los componentes de la mezcla, ya separados, si nuestra selección y aplicación
de la técnica fueron correctas.

CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son las propiedades físicas y químicas en las que se basa la separación
cromatográfica?
2. ¿Qué muestras biológicas puede trabajar en cromatografía en columna?
3. ¿Cuál es la diferencia entre “absorción” y “adsorción”?
4. ¿Cómo afectan las propiedades de la columna, como el diámetro y la longitud en
la separación de los componentes de la mezcla?
5. ¿En qué consiste la cromatografía en fase normal y en fase inversa?
6. Mencione al menos tres disolventes apropiados para la cromatografía en fase
normal y tres para la fase reversa.
 7. Escriba 5 solventes utilizados en cromatografía en columna, en orden de
polaridad ascendente.
8. Describa el proceso de acondicionamiento de una columna cromatográfica.
9. Identifique la fase móvil y fase estacionaria, en el trabajo que va a realizar.
10. Explique la diferencia entre cromatografía de adsorción y de reparto.
11. El científico ruso Tswett (quien era biólogo) se considera el inventor de la
cromatografía. ¿En qué consistió el experimento que realizó y por el cual se le
dio el crédito de la invención?
12. ¿Qué es una serie eluotrópica?
13. La técnica HPLC es una técnica cromatográfica que podría definirse como una
cromatografía en columna más sofisticada. Enumere al menos tres aplicaciones
de la HPLC que sean de utilidad en el área de formación profesional de la
carrera que usted está estudiando.

PROCEDIMIENTO
Recuerde utilizar en todo momento: guantes, mascarilla, bata de laboratorio, utensilios de
limpieza, mantener el pelo recogido, no usar joyas ni accesorios.

A. Preparación del extracto vegetal: utilizar guantes en todo momento.

1. Colectar hojas de material vegetal, puede ser hojas de espinaca, yerba de pollo,
hojas con colores fuertes.
2. Dividir las hojas en pequeños fragmentos, con ayuda de cuchillo o tijera.
3. Triturar las hojas con papel absorbente, de tal forma que se elimine la mayor
cantidad de humedad contenida en ellas.
4. Pesar 4 g de hojas libres de humedad
5. Colocar en un mortero 2g de arena amarilla previamente secada, 6 g de sal de
cocina, lo más gruesa posible y los 4g de hojas del paso anterior, triturar con
pistilo.
6. Agregar 15 ml de acetona concentrada, agitar y decantar el extracto.
7. Dejar evaporar acetona a temperatura ambiente, en un lugar ventilado, tener
cuidado que no se evapore todo el solvente, solo el necesario para concentrar el
extracto, mientras prepara la columna cromatográfica,
Puede observar el siguiente video para apoyarse:https://youtu.be/EErXChi-fvk

B. Cromatografía
1. Usar una jeringa descartable nueva o limpia (sin aguja) de 30 ml de capacidad,
como columna cromatográfica. El flujo de solvente puede regularse si se le adapta
una manguerita del diámetro adecuado en el extremo donde va colocada la aguja.
(ver figura 1)
2. Colocar en el extremo inferior de la jeringa un pequeño disco de papel filtro, cortado
de acuerdo al diámetro de la jeringa (lo puede sustituir con un pedazo de algodón),
que servirá para evitar que la fase estacionaria se salga.
3. Colocar la columna en un soporte. Durante todo el experimento la columna
cromatográfica deberá estar en posición perfectamente vertical (ver figura 2 y 3).
4. Llenar la columna hasta la marca superior de 50 ml que trae impresa, usando
solvente mineral. No dejar que el solvente fluya fuera de la columna en este
momento. Evitar que el papel filtro o algodón flote.
5. Con la ayuda de una espátula y un embudo, añadir bicarbonato de sodio a la
columna poco a poco, permitiendo que el aire que pueda quedar atrapado salga.
Puede lograr esto dando unos golpecitos con un lápiz a la columna. El bicarbonato
que agregue debe llegar a una altura de 8-10 cm.
6. Puede permitir que el solvente fluya fuera de la columna, pero NO debe dejar que el
bicarbonato se seque en ningún momento. Asegúrese que siempre haya por lo
menos una capa de 5 mm de solvente sobre el bicarbonato. Detener el flujo de
solvente en este momento. La columna ya está empacada.
7. Dejar fluir el solvente en la columna hasta que el menisco toque el inicio del
bicarbonato.
8. Con ayuda de una micropipeta, añadir cuidadosamente el extracto vegetal,
preparado anteriormente, evite perturbar la capa de bicarbonato.
9. Dejar fluir el solvente con la muestra vegetal y cuanto el menisco toque el inicio del
bicarbonato añadir 1 mL de solvente mineral. Repetir este paso una vez más y luego
continuar añadiendo solvente mineral hasta que una banda verde claramente
observable llegue al fondo de la columna. Esta banda está constituida por clorofilas
a y b y pigmentos carotenoides y se debe guardar en un tubo de ensayo cuando
eluya fuera de la columna.
10. Añadir ahora acetona a la columna. Dependiendo de la especie vegetal empleada,
puede que se observe una banda verde pálida o amarillenta, que corresponde a
fitocromos. Continuar añadiendo acetona a la columna hasta que esta banda llegue
al fondo de la columna, guardar esta fracción en un tubo de ensayo diferente,
cuando eluya fuera de la columna.
11. Añadir ahora etanol al 90% aprox. a la columna. Aquí se separarán dos o tres
bandas de pigmentos amarillos o cafés, que corresponden a los flavonoides.
Guardar esta fracción cuando eluya de la columna. No olvide etiquetar cada una de
las fracciones obtenidas.
12. Medir la cantidad de cada una de las fracciones obtenidas. Todos los pigmentos
separados son fotosensibles así que su apariencia puede variar si se les deja en
tubos de ensayo claros antes de terminar el experimento.
Documente cada una de las fracciones obtenidas por medio de fotografías, así como la
distribución de las diferentes fracciones dentro de la columna.

Una vez terminado el experimento: Descarte los desechos en forma adecuada.

1. Los extractos de solvente mineral, los puede unir al frasco de solvente que le
sobró, etiquetarlo adecuadamente (Solvente mineral con extracto vegetal) y darle
el uso correspondiente en el hogar.
2. Los extractos de acetona, los puede almacenar en un frasco plástico, etiquetar
adecuadamente y utilizarlo como solvente.
3. El residuo de bicarbonato en la jeringa lo puede almacenar destapado 2 dias
mas, cuando se evapore todo el solvente, podra observar la presencia de anillos
de color formados, estos son otros componentes del material vegetal utilizado,
posteriormente a la documentación, puede sacar el bicarbonato de sodio de la
jeringa y desecharlo en la basura, no es tóxico.
 4. Guarde el equipo, no deseche nada, podría volver a utilizarlo.

Referencias:
Fundamento teóricos-práctico de química orgánica editorial brujas Córdoba 2008 pág. 62
Guzman, A. Química orgánica separación de pigmentos cromatográficos págs 108-110.
Benites I.L. Manual de laboratorio análisis instrumental.2020.
Días, A.M., Ferreira, M.L. J.Chem.Educ., 2015, 92, 189-192
Anwar, M.H. Separation of plant pigments by thin layer chromatography, Journal of
Chemical Education 40.1 (1963) pag 29 https://youtu.be/EErXChi-fvk
Pinagel, et al. Manual de Prácticas de Laboratorio de Química Orgánica I, Universidad de
San Carlos de Guatemala, 2018
Valcárcel, M. Técnicas analíticas de separación cap. CROMATOGRAFÍA PAG 400-416.
https://youtu.be/wTlT7RifcPE
https://youtu.be/aZnLYGDJiZE

Figura 1 Figura 2 Figura 3

Manguera adaptada al extremo Soporte con pinza de tubo Soporte con pinza universal
inferior de la jeringa de ensayo
“Recuerde que la imaginación no tiene límites”
NGG, INOG/mm,inog
2023