INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIA BIOLÓGICAS

MÉTODOS DE ANÁLISIS
5QM3

Cromatografía
por afinidad
Integrantes:
Badillo Garcia Leslie Anahi Profesora: M. en C. Martha Patricia
Victoria Chavez Ximena Johanna Cervantes Cervantes
Rentería Cal y Mayor Abril
 Contenidos

Principio Condiciones
1 Fisicoquímico 2 de operación

Fases
3 1. Móvil 4 Aplicaciones
2. Estacionaria
 Cromatografía por afinidad
Afinidad: Tendencia de un átomo o
molécula a reaccionar o combinarse con
átomos o moléculas de diferente
constitución química.

La Cromatografía de Afinidad utiliza una

fase estacionaria que está diseñada para
unirse a una molécula específica con el fin
de aislar esa molécula de una mezcla.

Requiere el enlace covalente de un reactivo,

llamado ligando por afinidad, con un
soporte solido.

Salas et. al., 2012

Cromatografía por afinidad: Principio fisicoquímico
1. Los ligandos se enlazan a las moléculas
del analito en la muestra.
2. Cuando esta última pasa por la columna,
solo sin retenidas las moléculas que se
unen de manera selectiva al ligando por
afinidad.
3. Las moléculas que no se unen atraviesan
la columna con la fase móvil.
4. Después de que se eliminan las moléculas
indeseables, los analitos retenidos pueden
ser arrastrados cambiando las
condiciones de la fase móvil.

(Skoog et. al., 2008)

 Fases de la cromatografía por afinidad

Fase estacionaria
Las matrices o soportes empleados en cromatografía de
afinidad como fase estacionaria deben ser rígidos,
resistentes, insolubles, permeables y reactivos. Suelen ser
de dos tipos:
1. Matrices de polisacáridos (agarosa, celulosa,
dextrano)
2. Matrices sintéticas (vidrio, poliacrilamida).
 Fases de la cromatografía por afinidad

Fase móvil

La fase móvil desempeña dos funciones distintas:

1. Debe soportar el fuerte enlace entre las
moléculas del analito y el ligando
2. Debe ser capaz de debilitar o eliminar la unión
entre el analito y el ligando, una vez se han
eliminado las especies indeseables, de modo
que el analito pueda ser eluido.
 Componentes de la cromatografía por
afinidad
Longitud de la Brazo
Compuesto
cadena
espaciador
Bromuro de
cianógeno
C1 Ligando
Epóxido C3

Epóxido don
C10
ácido C6

Diamin C10

Tampón

(MN, sf)
 Tipos de elución

Proteína para purificar Ligando Elución con

Anticuerpo Péptido antigénico Péptido libre

Proteína etiquetada con Anticuerpo específico de

pH bajo
Myc Myc

Proteína de unión al DNA Heparina Alta fuerza iónica

Proteína etiquetada con

Ni2+ o CO2+ Imizadol o histidina libre
polihistidina

(MN, sf)
Interacciones típicas
Tipos de ligando Molécula

Enzimas Sustrato

Antígenos Anticuerpo

Receptor Hormona

Socio de unión a
Calmodulina
calmodulina

(MN, sf)
 Aplicaciones
Su principal aplicación incluye:
● Separación de mezcla de compuestos.
● Eliminación de impurezas o en proceso de
purificación.
● En ensayos enzimáticos
● Detección de sustratos
● Investigación de los sitios de unión de las
enzimas
● Reacciones antígeno-anticuerpo in vitro
● Detección de polimorfismos y mutaciones de
nucleótidos simples en ácidos nucleicos
 Cromatografía por afinidad
Ventajas
● Alta sensibilidad en comparación con TCD y FID.
● La cromatografía de afinidad proporciona una
alta especificidad.
● Las enzimas y otras proteínas se estudian
mediante cromatografía de afinidad.
● Para mantener la calidad del producto, esta
cromatografía se utiliza en el fabricante
farmacéutico en la producción de vacunas.
● La cromatografía de afinidad no se basa en la
fuerza iónica, el pH, la temperatura y la
composición del tampón.
● El alto grado de pureza se puede obtener
mediante cromatografía de afinidad.
Desventajas
● A veces se observa una fuga de ligandos.
● El volumen de la muestra es limitado.
● Los ligandos utilizados en la cromatografía de
afinidad son caros.
● Productividad relativamente baja.
● Tiene adsorción no específica.
● La transferencia de iones metálicos y la fuga de
iones metálicos conducen a la pérdida de
proteínas.
● La cromatografía de afinidad no es específica
para la adsorción en comparación con otros
métodos de cromatografía.
● Las proteínas se desnaturalizan cuando no se
mantiene el pH necesario.
 Referencias
● SALAS-BANUET, G., RAMÍREZ-VIEYRA, J., RESTREPO-BAENA, O., COCKRELL, B. R., &
NOGUEZ-AMAYA, M. (2012). LA IMPORTANCIA DE LLAMARSE AFINIDAD QUÍMICA. PARTE I: LA
SEMILLA. Dyna, 79(173), 135-144.
● Bustamante R, A. J., Murillo C, N. M., Ayala, A., & Casas, J. A. (2009). ESTRATEGIA DIDÁCTICA
PARA EL APRENDIZAJE DE LOS CONCEPTOS DE pH, EFECTO BUFFER Y CAPACIDAD
AMORTIGUADORA A PARTIR DEL ESTUDIO DE BEBIDAS NO ALCOHÓLICAS. Umbral Científico,
(14), 181-192.
● Skoog, D. A., Holler, F. J., & Crouch, S. R. (2008). Principios de análisis instrumental. 6e. Cengage
Learning Editores S.A. de C.V.
● Skoog D., Holler F. J. & Crouch, S. R; Sexta Edición; (2008). Principios de análisis instrumental. 6ta
edicion. Cengage learning. P. 848.
● Marjeta Urh, Simpson, D., & Zhao, K. (2009). Chapter 26 Affinity Chromatography. Methods in
Enzymology, 417–438. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(09)63026-3
● Aryal, S. (2022, January 3). Affinity Chromatography- Definition, Principle, Parts, Steps, Uses.
Microbe Notes. https://microbenotes.com/affinity-chromatography/
●
● MN. (sf.). Cromatografía de afinidad. Principio, tipos, pasos, aplicaciones. Recuperado el 25 de
octubre de 2023, de
https://microbiologynote.com/es/affinity-chromatography/#Linking_the_substrate_to_the_support
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