Universidad Nacional Autónoma de México

Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán

Medicina Veterinaria y Zootecnia
Laboratorio de Bioquímica

Práctica 3. Separación e Identificación de

aminoácidos por Cromatografía en papel

Grupo: 2207

Equipo: 7
● Gómez Luna Sandra Paola
● González Olivar Wendy Mireya
● Gutiérrez Alanis Yesica
● Martínez García Aurora Paola
● Miguel Matus Damaris
● Zúñiga Linares Ximena Alejandra

Profesores:
● Dra. Rosa Isabel Higuera Piedrahita
● MVZ. Francisco Javier Cervantes Aguilar
● MVZ. Silvia Leticia Bonilla Orozco
Fecha de entrega: 25 de marzo de 2022
 ÍNDICE

RESUMEN 3

INTRODUCCIÓN 4

MARCO TEÓRICO 5

OBJETIVOS GENERALES 8

MATERIALES 8

METODOLOGÍA 8

RESULTADOS 9

DISCUSIÓN 10

CONCLUSIÓN 11

BIBLIOGRAFÍA 12

2
 RESUMEN

La cromatografía es un método químico utilizado en MVZ con fines de investigación,

consta de la separación de los componentes de las mezclas mediante una fase móvil; la
cual consta de un líquido o gas y una fase estacionaria; formada por una materia sólida o
líquido..

En la práctica se utilizó como fase móvil los diferentes aminoácidos; fenilalanina, leucina,
prolina, glicina, histidina y una mezcla de todos estos. Mientras que la fase estacionaria
fue el papel Whatman, ya que en el presente trabajo se realizó una cromatografía en
papel.

De igual manera, se empleó una solución de Ninhidrina 0.05%, la cual nos ayudó a
detectar los aminoácidos en el papel Whatman, marcandolos de un color azul (a
excepción de la prolina, la cual tomó un color amarrillo debido a sus propiedades las
cuales serán explicadas después), esta solución se utilizó con el fin de convertir a los
grupos funcionales Carboxilo y Amino, en CO2, NH3.

Una vez realizado todo el procedimiento, se calcularon los resultados; para cada
aminoácidos se empleó la fórmula de RP (Distancia recorrida por un compuesto/distancia
recorrida por el eluyente), ya que se conocen los compuestos, mientras que para la
mezcla, se utilizó el Rx (Distancia recorrida por un compuesto problema/distancia
recorrida por un compuesto patrón).

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 INTRODUCCIÓN

Un aminoácido es una pequeña molécula orgánica que contiene, al menos, un grupo

amino (-NH2), de naturaleza básica, y un grupo carboxilo (-COOH), de carácter ácido. Los
más importantes biológicamente son los que forman parte de las proteínas, todos los
cuales pertenecen al grupo de los α-aminoácidos; estos se caracterizan por presentar el
grupo carboxilo y el grupo amino unidos al mismo átomo de carbono (que se denomina
carbono α).
A este carbono α se une, como tercer sustituyente, un átomo de hidrógeno y, como cuarto
sustituyente, un grupo adicional de tamaño y características diversas, el cual diferencia a
cada aminoácido de los demás; a este se le denomina cadena lateral del aminoácido y, a
menudo, se le representa de forma simplificada por la letra R. (Moreno S., 2020)

Los 20 aminoácidos estándar encontrados en las proteínas son α-aminoácidos. Difieren

unos de otros en sus cadenas laterales, o grupos R, que varían en estructura, tamaño y
carga eléctrica y que influyen en su solubilidad en agua, además de estos 20 aminoácidos
existen muchos más que se encuentran con menor frecuencia. Algunos son residuos que
han sido modificados después de la síntesis de proteínas; otros se hallan en organismos
vivos pero no como unidades constituyentes de las proteínas. (Nelson D., Cox M., 2009)

Grupos de aminoácidos según su cadena lateral:

● Cadena lateral alifática: Glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina.
● Cadena lateral alcohólica no aromática: Serina y treonina
● Cadena lateral aromática: Fenilalanina, tirosina y triptófano.
● Cadena lateral que contiene azufre: cisteína y metionina.
● Cadenas laterales ácidas y derivados amídicos: ácido aspártico, glutámico,
asparagina y glutamina.
● Aminoácidos básicos: Lisina, arginina e histidina.
● Prolina: es un aminoácido ubicado en una categoría separada debidos a su
estructura. La cadena lateral de la prolina está unida al átomo de nitrógeno, que a
su vez está unido al carbono α. (Wolfe H., 1996)
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 MARCO TEÓRICO

Cromatografía

La cromatografía es un método muy utilizado que permite la separación, identificación y

determinación de los componentes químicos en mezclas complejas. Es un método
potente y de aplicación muy general. Las cromatografías son procesos que abarcan varias
técnicas separativas, basadas en propiedades físicas de ciertos materiales, que en
interacción con sustancias o mezclas de sustancias, las cuales guardan relación con las
propiedades químicas de éstas, permite descomponer una mezcla y analizar sus
constituyentes. (Sgariglia, M. s.f., 2010)

A diferencia de otros métodos físicos y químicos de separación es que se ponen en

contacto dos fases mutuamente inmiscibles. Una es estacionaria y la otra móvil. Una
muestra que se introduce en la fase móvil es transportada a lo largo de la columna que
contiene una fase estacionaria distribuida.

Cuando ambas fases se han escogido en forma apropiada los componentes de la muestra
se separan gradualmente en bandas en la fase móvil. Al final del proceso los
componentes separados emergen en orden creciente de interacción con la fase
estacionaria. El reparto entre las fases aprovecha las diferencias entre las propiedades
físicas y/o químicas de los componentes de la muestra. La columna de separación es el
corazón del cromatógrafo. Proporciona versatilidad en los tipos de análisis que pueden
realizarse, debido a la amplia gama de selección de materiales para las fases móvil y
estacionaria, permite separar moléculas que difieren muy poco en sus propiedades físicas
y químicas. (Gomis Yagües, V. (2008).)

Tipos de cromatografía
Para poder clasificar los tipos de cromatografía se tendrá que basar en el estado físico de
la fase móvil, mientras que el estado de la fase estacionaria puede ser sólido o líquido.
(Sgariglia, Melina Araceli, José Roldolfo Soberón, Diego Alejandro Sampietro, y Marta
Amelia Vattuone, 2010)

La clasificación dependerá de:

1) El tipo de técnica empleada

a) plana
i) Papel
5
 ii) Capa fina
b) Columna
2) Tipo de fase móvil
a) Gas
b) Líquido
c) Supercrítica (Características de gas y líquido)
3) Según el estado físico
a) Líquido-Sólido: Fase móvil líquida y estacionaria sólido
i) Cromatografía de adsorción: Se emplea en separación de
compuestos orgánicos diversos
ii) Cromatografía de intercambio iónico: Se emplea en sustancias que se
ionicen
iii) Cromatografía de exclusión: Se emplea en separación de proteínas
b) Líquido-Líquido: Fase estacionaria es líquida y fase móvil líquida:
i) Cromatografía de reparto: Entre la fase móvil y estacionaria se
separan de acuerdo a la diferencia de las solubilidades
ii) Cromatografía de afinidad: Se aplica en la separación de sustancias
como anticuerpos, cofactores, inhibidores enzimáticos y proteínas
c) Gases: La fase móvil es un gas
i) Adsorción
ii) Partición

Aminoácidos
Todos los aminoácidos poseen un grupo ácido (-COOH) y un grupo básico (-NH2), todos
los aminoácidos libres presentan características ácido-base. Dado que los aminoácidos
comunes en las proteínas difieren entre sí por la cadena lateral, su clasificación obedece
a las propiedades químicas de la cadena lateral, esta puede clasificarse según su
polaridad en (Rodríguez S., s. f.):

● Polares
Son aquellos que su cadena lateral tiene carga, se pueden encontrar en tres tipos:
a) Sin carga: No tienen carga en el grupo "R". Pueden encontrar participando en la
formación de enlaces de hidrógeno en moléculas de proteínas (Sawakinome,
2021).Tienen posibilidades de tener asimetría en la distribución de las cargas, por
la presencia de un átomo de O ó N (Prada G., 2019).
Ejem: treonina, tirosina, cisteína, glutamina y asparagina..

6
 b) Carga positiva: Tienen más grupos amino que grupos carboxílicos. Entonces el
aminoácido se vuelve más básico, teniendo carga positiva en el grupo "R"
(Sawakinome, 2021).
Ejem: lisina, arginina e histidina.
c) Carga negativa: Tienen más grupos carboxilo en comparación con los grupos
amina. Entonces el aminoácido se vuelve más ácido, teniendo carga negativa en el
grupo "R".
Ejem: ácido aspártico y ácido glutámico (Sawakinome, 2021).

● Apolares
Estos aminoácidos tienen un número igual de grupos ácido carboxílico y grupos amina.
Los aminoácidos no polares son hidrófobos. Esto hace que los aminoácidos no polares
tengan una carga neutra, es decir, no tienen carga en el grupo "R" (Sawakinome,
2021).
a) Alifáticos: Su cadena lateral carece de enlaces dobles conjugados.
b) Aromáticos: Su cadena lateral tiene enlaces conjugados. Son responsables de la
absorbancia a 280nm, típica de las proteínas. Se encuentran en hibridación sp2
(Prada G., 2019).

Separación de aminoácidos por cromatografía

Los aminoácidos pueden cuantificarse mediante la reacción del grupo α-amino con
ninhidrina. Este compuesto reacciona rápidamente con el grupo amino, lo oxida y libera
amonio, el cual se condensa con la ninhidrina reducida y con otra molécula de ninhidrina
para producir un aducto púrpura.

A menudo se tienen mezclas de aminoácidos que se desean analizar. Antes de poder

cuantificar estas mezclas es necesario separarlas por diferentes métodos.

Cromatografía en papel: Este método consiste en aplicar los aminoácidos disueltos en

una fase acuosa acidificada a una columna de sílice unida a una cadena hidrocarbonada.
Los aminoácidos, según su polaridad se van a unir a la columna y entonces el líquido se
mezcla gradualmente con cantidades cada vez mayores de un disolvente menos polar
que el agua. Los aminoácidos van siendo lavados de la columna conforme la polaridad del
solvente baja lo suficiente (Rodríguez S., s. f.).

7
 OBJETIVOS GENERALES

● Conocer el principio de separación por cromatografía en papel y a través de ello,

comprender su importancia al ser empleada como técnica de separación de
moléculas, tales como los aminoácidos
● Realizar la separación de aminoácidos por cromatografía en papel e identificar los
aminoácidos presentes en una mezcla a través del uso de aminoácidos patrón.

MATERIALES

Material Reactivos y Soluciones

● 1 Pieza de papel Whatman No. 3 (10 x 8 ● Solución de Fenilalanina 1%
cm) ● Solución de Leucina 1%
● 1 Cámara cromatográfica ● Solución de Prolina 1%
● 6 tubos capilares ● Solución de Glicina 1%
● 1 Parrilla eléctrica ● Solución de Histidina 1%
● Solución de Ninhidrina 0.05%

Material que deberá traer cada equipo Eluyente: v/v/v/v

● Regla y lápiz Butanol/acetona/ácido acético/agua
● 2 Pinzas de disección sin dientes de 7.0/7.0/1.5/4.5
ratón
● 1 Par de guantes de látex Muestra biológica
● Cubre bocas por cada integrante Mezcla de aminoácidos

METODOLOGÍA

1. Se sujeta el papel de cromatografía (cromatograma) por los bordes empleando pinzas

de disección, pues las yemas de los dedos no deben tener contacto con la superficie
del mismo.
2. A 0.5 cm del extremo inferior del cromatograma, se marcó, con lápiz, seis cruces muy
finas y bien distribuidas a lo largo de los 10 cm. de este, las cuales indicaron la
posición respectiva para cada aminoácido y de la mezcla.
3. Se colocó con un capilar, en el centro de la primera cruz, una pequeña muestra del
aminoácido Histidina, en la segunda la Fenilalanina, en la tercera la Prolina, en la
cuarta la Glicina y, en la quinta, la Leucina (estos 5 aminoácidos fueron los
aminoácidos patrón). En la sexta, se colocó la mezcla de aminoácidos problema.
4. Una vez que se secaron las aplicaciones, se realizó una segunda en el mismo orden.

8
 5. Se colocó el cromatograma dentro de la cámara de cromatografía, la cual fue
previamente preparada con el eluyente saturado dentro de las 24 horas anteriores a
su uso. Al momento de haber colocado el papel dentro de la cámara, se tuvo cuidado
de que no se rebasará el nivel de aplicación de las muestras, antes de comenzar a
ascender por capilaridad.
6. Se cerró la cámara y se dejó desarrollar el corrimiento cromatográfico hasta que el
eluyente llegó aproximadamente 0.5 cm antes del borde superior.
7. Se retiró el cromatograma de la cámara y se secó por calentamiento en la parrilla,
evitando quemar el papel. Auxiliándose de las pinzas de disección sin dientes de ratón
para el manejo de este.
8. Una vez seco el cromatograma, se roció sobre éste la solución de ninhidrina, misma
que estaba dentro de un frasco aspersor.
9. Se dejó secar nuevamente el cromatograma, sin pegar a la parrilla, hasta que se
hicieron visibles las manchas de los aminoácidos.
10. Se marcaron los bordes de cada una de las manchas para medir la distancia recorrida
y se calcularon los factores de corrimiento de los aminoácidos.

RESULTADOS

𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑢𝑛 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜

Rf= 𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑒𝑙𝑢𝑦𝑒𝑛𝑡𝑒

Histidina Fenilalanina Prolina Glicina Leucina

2.5𝑐𝑚 6.2𝑐𝑚 4.3𝑐𝑚 2.6𝑐𝑚 6.6𝑐𝑚
Rf= 7𝑐𝑚
Rf= 7𝑐𝑚
Rf= 7𝑐𝑚
Rf= 7𝑐𝑚
Rf= 7𝑐𝑚
Rf= 0.35cm Rf= 0.88cm Rf= 0.61cm Rf= 0.37cm Rf= 0.94cm

𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑢𝑛 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜 𝑝𝑟𝑜𝑏𝑙𝑒𝑚𝑎

Rx= 𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑢𝑛 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜 𝑝𝑎𝑡𝑟𝑜𝑛

Histidina Fenilalanina Prolina Glicina Leucina

2.3𝑐𝑚 2.3𝑐𝑚 2.3𝑐𝑚 2.3𝑐𝑚 2.3𝑐𝑚
Rx= 2.5𝑐𝑚
Rx= 6.2𝑐𝑚
Rx= 4.3𝑐𝑚
Rx= 2.6𝑐𝑚
Rx= 6.6𝑐𝑚
Rx= 0.92cm Rx= 0.37cm Rx= 0.53cm Rx= 0.88cm Rx= 0.34cm

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 4.5𝑐𝑚 4.5𝑐𝑚 4.5𝑐𝑚 4.5𝑐𝑚 4.5𝑐𝑚
Rx= 2.5𝑐𝑚
Rx= 6.2𝑐𝑚
Rx= 4.3𝑐𝑚
Rx= 2.6𝑐𝑚
Rx= 6.6𝑐𝑚
Rx= 1.8cm Rx= 0.72cm Rx= 1.04cm Rx= 1.73cm Rx= 0.68cm

6.3𝑐𝑚 6.3𝑐𝑚 6.3𝑐𝑚 6.3𝑐𝑚 6.3𝑐𝑚

Rx= 2.5𝑐𝑚
Rx= 6.2𝑐𝑚
Rx= 4.3𝑐𝑚
Rx= 2.6𝑐𝑚
Rx= 6.6𝑐𝑚
Rx= 2.52cm Rx= 1.01cm Rx= 1.46cm Rx= 2.04 Rx= 0.95cm

Compuesto problema
●1er marca= 2.3cm= Histidina
●2da marca= 4.5cm= Prolina
●3ra marca= 6.3cm= Fenilalanina

DISCUSIÓN

Esta práctica nos ayudó a observar el corrimiento de los aminoácidos y analizamos sus Rf
y Rx, es importante reconocer las cualidades de cada aminoácido para poder identificarlos
y a través de este tipo de procesos volverlos en una herramienta aplicable en diversos
procedimientos médicos principalmente de diagnóstico.

Los resultados respecto a los de otros estudios son muy inconsistentes si lo comparamos
con Jaritza Mero, 2021, por ejemplo. Pues en el caso de histidina obtuvieron los
siguientes resultados:

Es únicamente comparable con Rf, sin embargo nuestro resultado fue de 0.35 y ella
obtuvo 0.11 que es un poco alejado.

La mayoría de los reportes a los cuales se tiene acceso difieren mucho de nuestra
metodología, pues no se ocuparon los mismos aminoácidos ni se encontró ninguno que
adicionara al experimento una mezcla de aminoácidos, o por ejemplo, no se realizaron
tablas que explicaran de forma cuantitativa sus resultados.

10
Otro estudio, es el de Jhoana Parreño, 2018, que muestra los resultados Rf de
Fenilalanina:

Nosotros obtuvimos 0.88 en el resultado de fenilalanina , mientras que ellos 0.57.

La explicación que se puede dar ante tal diferencia de resultados puede ser la cantidad de
aminoácido que se agregó al papel, si alguno de esos estudios utilizó un equipo diferente
al nuestro, por ejemplo, Jaritza Mero, no utilizó ninhidrina ni papel whatman. A diferencia
de Jhoana Parreño, que utilizó estos dos recursos y aún así los resultados obtenidos
fueron diferentes.

CONCLUSIÓN

El proceso de separación de los aminoácidos nos permitió conocer la importancia de esta

técnica. Es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar análisis cualitativos,
ya que, pese a no ser una técnica muy potente, no requiere de ningún tipo de
equipamiento.

Tiene gran importancia en la aplicación biológica ya que a través de este método se

podrían identificar secreciones anormales de ciertos aminoácidos.

Una vez hecha la separación de aminoácidos mencionados en la práctica (histidina,

fenilalanina, prolina, glicina, leucina), se pudieron identificar también los aminoácidos
presentes en la mezcla, esto con ayuda de los compuestos problemas, obteniendo así los
aminoácidos histidina, prolina y leucina.

La reacción que se provocó en los aminoácidos fue debido a la ninhidrina.

La prolina tiene un grupo -NH- ya que forma parte del anillo de pirrolidina y al reaccionar
con la ninhidrina se forma un color amarillo.

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BIBLIOGRAFÍA

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