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Aislamiento de lectinas por cromatografía.

afinidad
Aislamiento de lectinas por cromatografía de afinidad

Aislamiento de lectinas por cromatografía de afinidad.

José Camilo Torres Romero1 , Myriam Janeth Ortega Torres 2,

Jhon Alexander Infante Betancour3 & Cicero Antonio Maia Cavalcante4

1 Licenciado en Biología, Magister en Ciencias – Bioquímica, Doctor en Bioquímica. MagisterenenCiencias

Ciencias Magister
Agrario 2 Licenciada en Biología. Magister en Producción Animal­ Genética Molecular Animal. Estudiante Docto­rado en Producción Animal.

Universidad Nacional de Colombia. Bogotá. Colombia. 3 Biólogo, Magister en Ciencias­

Biología. 4 Licenciatura en Ciencias Farmacéuticas, Licenciatura en Ciencias Biológicas, Especialización en Enseñanza de la Biología, Especialización en

Salud Pública, Maestría Profesional en Enseñanza de las Ciencias y Matemáticas.

1, 2Facultad de Ciencias Agrícolas, Ganaderas y Ambientales –ECAPMA. Universidad Nacional Abierta a Distancia UNAD. Bogotá. Colombia. 3

ONG YOLUKA Fundación para la Investigación de la Biodiversidad y la Conservación. 4 Instituto Federal de Ceará – IFCE. Jaguaribe –

Ceará, Brasil.

1 2 3
myriam.ortega@unad.edu.co, jose.torres@unad.edu.co, jhon.infante@yoluka.org.co, 4 cicero.carla@uol.com.br
4 cicero.carla@uol.com.br

Resumen
La cromatografía de afinidad es una técnica utilizada para separar
compuestos, como ciertas proteínas, que tienen la capacidad de
unirse de forma no covalente y reversible a moléculas específicas
conocidas como ligandos.
Este método se diferencia de las técnicas de cromatografía clásicas
porque la proteína se puede separar en función de una única
propiedad bioquímica. En la cromatografía de afinidad, el ligando
está unido covalentemente a la matriz, que debe ser químicamente
inerte, porosa y además tener una variedad de grupos funcionales
adecuados para acoplarse con diferentes ligandos. En la
cromatografía de afinidad se utilizan diversas matrices y ligandos,
dependiendo de la proteína que se va a purificar. Este trabajo
describirá algunos aspectos importantes para el aislamiento de
lectinas mediante la técnica de cromatografía de afinidad utilizando
carbohidratos.
Palabras clave: proteínas, lectinas, carbohidratos, isolectinas,
cromatografía.
Resumen
La cromatografía de afinidad es una técnica utilizada para separar
compuestos de muestras complejas, tales como ciertas proteínas,
que tienen la capa­cidad de unirse de forma reversible y no
covalente con moléculas específicas conocidas como ligando.
Este método difiere de las técnicas de cromatografía clásicas de
proteína para realizar el aislamiento en la base de una única
propiedad bioquímica. En la cromatografía de afinidad el ligando
se une cova­lentemente a la matriz, que debe ser químicamen­te
inerte, porosa y, además, tener una variedad de grupos funcionales
adecuados para el acoplamiento con diferentes enlazadores. Varias
matrices y con­diciones se utilizan en cromatografía de afinidad,
dependiendo de la proteína a purificar. Este artículo

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Revista de Investigación Agraria y Ambiental – Volumen 8 Número 1 – enero ­ junio de 2017 – ISSN 2145­6097
de investigación describe algunos aspectos impor­tantes para
aislar lectinas por cromatografía de afi­nidad utilizando
carbohidratos.
Palabras clave: proteínas, lectinas, carbohidratos, isolectinas,
cromatografía.
Abstracto
La cromatografía de afinidad es una técnica utilizada para separar
compuestos de muestras complejas, como ciertas proteínas, que
tienen la capacidad de unirse de forma reversible y no covalente
con moléculas específicas conocidas como ligandos. Este método
difiere de la proteína clásica.
Introducción
Los métodos para separar mezclas de diferentes componentes
mediante fases se conocen como cromatografía (Cardona &
Muñoz, 2016). El inicio del uso de la cromatografía como método
de separación se remonta a 1903, teniendo su posterior desarrollo
y evolución a partir de 1930. El primero en definir el término
cromatografía fue el botánico ruso Miguel Tswett (1872­
1913) en 1906, eligiendo este término de las palabras griegas
khromatos (color) y graphein (escritura) para describir la separación
de pigmentos vegetales en diferentes zonas coloreadas.
Actualmente, el término cromatografía también se ha utilizado para
aislar compuestos incoloros, permitiendo aislar proteínas a través
de su afinidad por otras biomoléculas. Este trabajo tiene como
objetivo demostrar la importancia de la cromatografía de afinidad
para el aislamiento de lectinas.
Características de las lectinas importantes para su
aislamiento.
Las lectinas son un grupo de proteínas cuya principal característica
es la capacidad de unirse a carbohidratos (Micucci & Camps,
1987). Están presentes en todos los organismos, lo que sugiere
que realizan varias funciones biológicas básicas, como regulación,
adherencia, defensa contra patógenos, entre otras. (Varki et al.,
2009). Un organismo normalmente tiene una serie de
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Técnicas de cromatografía mediante la realización de aislamiento
en la base de una única propiedad bioquímica. En la cromatografía
de afinidad el ligando se une covalentemente a la matriz, que debe
ser químicamente inerte, porosa y, además, tener una variedad de
grupos funcionales adecuados para acoplarse con diferentes
conectores. En la cromatografía de afinidad se utilizan varias
matrices y condiciones, dependiendo de la proteína a purificar.
Este artículo describe algunos aspectos importantes para el
aislamiento de lectinas mediante cromatografía de afinidad
utilizando carbohidratos.
Palabras clave: proteínas, lectinas, carbohidratos, isolec­ C
estaño, cromatografía.
diferentes lectinas presentes en diversas isoformas, denominadas
isolectinas (Van Damme et al., 1998). Las isolectinas se diferencian
en su estructura primaria, presentando pequeñas variaciones en
esta estructura, y en la especificidad de unión a carbohidratos,
pudiendo presentar diferencias en sus actividades biológicas
(Leavitt et al., 1977). Por tanto, a la hora de aislar una lectina
también es importante pensar en sus isolectinas.
La estructura general de las lectinas permite clasificarlas en tres
grandes grupos. El primero está representado por las merolectinas,
que tienen un único dominio de unión a carbohidratos. El segundo
representado por las Hololectinas que tienen dos o más dominios
de unión a carbohidratos. El tercero está representado por la
quimerolectina, que contiene dominios no lectínicos adicionales,
generalmente catalíticos (Peumans & Van Damme, 1995). La
mayoría de las lectinas tienen múltiples sitios de unión que
pueden ser útiles en asociaciones cruzadas con glucorreceptores
específicos en la superficie celular (Geijtenbeek & Gringhuis,
2016). Las lectinas también actúan como moléculas de
reconocimiento en interacciones molécula­célula (Brown, Crocker,
2016), célula­célula (Geijtenbeek & Gringhuis, 2016) y participan
en procesos celulares, incluida la adhesión,
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Aislamiento de lectinas por cromatografía de afinidad.
migración, diferenciación, proliferación y apoptosis (Huang et al.,
2017). Además, muchas lectinas activan diversas respuestas
fisiológicas en varios organismos y tienen propiedades
inmunomoduladoras, presentando roles potenciales en el cáncer
y la metástasis (Perillo et al., 1998; Sha­ron & Lis, 1989, Wu et al.,
2017), lo que las convierte en potencialmente útil en aplicaciones
biotecnológicas y biomédicas.
El vínculo entre lectinas y carbohidratos se caracteriza por ser no
covalentes y reversibles, realizándose mediante interacciones
hidrofóbicas, enlaces de hidrógeno, interacciones electrostáticas,
interacciones de van der Waals y atracción dipolar (Lehr, 2000).
El vínculo entre los azúcares ­mono y disacáridos­ y la lectina es
relativamente
débil, con valores de disociación expresados en micromolar o
milimolar. Por otro lado, las interacciones multivalentes de lectinas
con complejos de carbohidratos ramificados dan como resultado
enlaces más fuertes con constantes de disociación expresadas
en nanomolares o incluso picomolares (Varki et al., 2008).
En general, las lectinas tienen propiedades bioquímicas y de
unión, lo que resulta muy conveniente para su purificación
mediante cromatografía de afinidad utilizando carbohidratos. No
reaccionan catalíticamente con ellos, a menos que la lectina tenga
un subdominio de glicosidasa catalítica.
Como se señaló anteriormente, las lectinas se unen a los
carbohidratos de forma no covalente y reversible. Los ligandos
más utilizados para el aislamiento de lectinas.
, son mono y disac­
Los rígidos, que están unidos relativamente débilmente a estas
proteínas, se liberan fácilmente de una columna de afinidad
mediante elución competitiva utilizando carbohidratos específicos
libres (Moreira et al., 1997; Moreira & Perrone, 1975).
Además, las lectinas y los carbohidratos son compuestos
generalmente estables, por lo que también se pueden aplicar
técnicas de elución que utilizan condiciones extremas de pH y/o
fuerza iónica para liberar una lectina de la columna de afinidad
(Vega y Pérez, 2006).
Se puede seleccionar cualquier fuente de interés para el aislamiento
de lectinas, desde humanos y otros animales, hasta plantas,
hongos, bacterias e incluso virus (Procópio et al., 2017). Primero,
se debe liberar una lectina desde la fuente a la solución,
generalmente mediante liberación desde las células. Se pueden
utilizar varios métodos, dependiendo de las características
mecánicas del tejido de origen, como la homogeneización por
rotura mecánica o por lisis (Voet y Voet, 1995). Las lectinas son
proteínas solubles en agua, por lo que se extraen con tampones
acuosos y salinos.
La extracción de la lectina de interés debe realizarse a 4°C para
evitar su desnaturalización y degradación por enzimas proteolíticas.
Se recomienda la adición de inhibidores de proteasa al tampón de
extracción si se observa actividad proteolítica en el extracto
(Kvennefors et al, 2008; Matsumoto et al, 2011; Watanabe et al,
2007), aunque algunas lectinas encontradas son bastante
resistentes a la degradación proteolítica. (Pohleven et al., 2009).
También se pueden añadir al extracto inhibidores de la glucosidasa,
como el inhibidor de la glucosidasa desoximanojirimicina (0,2 mM)
y el inhibidor de la manosidasa desoximanojirimicina (0,2 mM),
para evitar la escisión de los carbohidratos inmovilizados en la
columna de afinidad (Watanabe et al., 2007). ). Antes de aplicar
el extracto a la columna de afinidad, algunas impurezas se pueden
eliminar mediante precipitación fraccionada con sulfato de amonio
y/u otras técnicas cromatográficas clásicas.
Las fracciones de lectina se pueden controlar durante todo el
proceso de purificación controlando su actividad aglutinante en
sangre, para ello se utilizan eritrocitos específicos, ya que sólo se
aglutinan glóbulos rojos con lectina glucanos específicos.
(Cavalcante et al., 2016).
Aislamiento de Lectinas mediante la técnica
Cromatografía de afinidad Una vez
preparado el extracto que presenta actividad de hemoaglutinación,
se debe seleccionar el método de cromatografía de afinidad de
carbohidratos apropiado para la purificación de lectinas.
Se trata del adsorbente que puede unirse a la lectina y separarla
del extracto, y una técnica
sesenta y cinco
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Método de elución que puede liberar la lectina unida a la columna.
Por lo tanto, es importante conocer la especificidad y estabilidad
de la lectina y también examinar la estabilidad del adsorbente; se
pueden usar pH y temperatura extremos para acoplar el ligando
con el agente de elución (Melgarejo et al., 2005). La especificidad
de la lectina deseada en un extracto se puede determinar
analizando su actividad aglutinante, utilizando varias clases de
eritrocitos que exponen diferentes glicanos en sus superficies. Por
ejemplo, en el sistema ABO, el grupo sanguíneo humano A expresa
la forma no reductora del carbohidrato N­acetilgalactosamina, el
grupo B expresa galactosa y el grupo O expresa fucosil­galactosa
(Schenkel­Brunner, 2007). Además, se puede utilizar la inhibición
de la aglutinación utilizando diversos carbohidratos o glicoproteínas
para determinar la especificidad de la lectina, permitiendo
seleccionar el adsorbente de lectina específico.
La estabilidad de la lectina se puede evaluar examinando la
actividad de aglutinación del extracto.
Sin embargo, varias observaciones (Moreira et al., 1997) sugieren
que la lectina en un extracto es más estable que la aislada,
probablemente debido a la importancia de los azúcares en el
contexto molecular de la proteína (Abrantes et al., 2013).
Dependiendo del ligando y adsorbente, se pueden utilizar técnicas
de elución competitiva o elución a diferente pH y/o fuerza iónica
para que se libere la lectina unida a la columna de afinidad. Al
elegir la técnica más adecuada para desorber una lectina unida, se
deben considerar la especificidad, su estabilidad y el tipo de
adsorbente, es decir, azúcar o polisacárido complejo. Cuando se
utiliza un monosacárido o disacárido como ligando, la lectina se
libera fácilmente de la columna de afinidad mediante elución
competitiva; para esto se deben utilizar carbohidratos específicos
con mayor afinidad por la lectina que el adsorbente (Moreira &
Perrone, 1975).
La mayoría de los autores informan el uso de elución competitiva
de lectinas utilizando mono o disacáridos específicos. Por ejemplo,
cuando se aisló una lectina en Sepharose, se utilizó galactosa
66
para la desorción (Cao et al., 2010; DeSimone et al., 2006),
mientras que se utilizó glucosa con Sephadex (Rittidach et al.,
2007; Sun et al., 2007). Las concentraciones de azúcares utilizadas
son generalmente de 0,2 M (que oscilan entre 0,01 ­ 0,5 M),
aunque también se han utilizado gradientes de azúcar (Cammarata
et al., 2007; Man­sour & Abdul­Salam, 2009). Posteriormente,
estas lectinas asociadas a azúcares deben ser tratadas para
liberar sus sitios de unión, generalmente mediante diálisis (Vega &
Pérez, 2006). Alternativamente, para evitar el último paso, las
lectinas pueden ser desorbidas de la columna con condiciones
cambiantes a extremos de pH o fuerza iónica (Vega & Pérez,
2006). Esta última técnica depende de la estabilidad química de la
matriz y de las sustancias adsorbidas y no es adecuada para
lectinas y adsorbentes que se destruyen en tales condiciones
(Vega & Pérez, 2006). Aunque los carbohidratos y las lectinas
son moléculas generalmente estables, hay que tener cuidado de
no dañarlas de forma irreversible (Obando, Barahona & Cha­morro,
2014). Las fracciones que contienen proteínas deben neutralizarse
inmediatamente, generalmente con Tris­HCl 2 M o 1 M, pH 7,5
(Vega & Pérez, 2006). La columna también debe equilibrarse con
el tampón de unión. Cuando se usan como adsorbentes oligo­ o
polisacáridos ramificados con alta avidez por las lectinas, las
lectinas no pueden eluir fácilmente usando azúcares monovalentes
con menor afinidad por las lectinas. En este caso, se deben utilizar
condiciones extremas de pH y/o fuerza iónica. Varios autores han
informado sobre la elución de lectinas utilizando ácidos (glicina­
HCl 20­100 mM o alanina, pH 2,5 o ácido acético 1­3%) (Kaur et
al.,
2006) o bases (NaOH 10 mM, trietanolamina 0,1 M, pH 11, o
tampón Tris­OH pH 11,4 (Vega & Pérez, 2006), así como soluciones
tampón que contienen NaCl 1 M y MgCl2 3 M (también se utilizó
gradiente) (Naganuma et al., 2006) En algunos casos, las lectinas
se eluyeron usando urea 6 M (Matsumoto et al., 2011) o 8 M
(Susee­lan et al., 2002). La actividad de unión a carbohidratos de
la lectina puede depender de divalentes. iones metálicos, como
es el caso de las lectinas.
tipo C (Gringhuis et al., 2007; Den Dunnen et al.,
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Aislamiento de lectinas por cromatografía de afinidad.
2008), que se puede eluir utilizando tampones que
contienen agentes quelantes, como ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA) 2­100 mM (Ourth et
al., 2005).
Otros métodos para purificar lectinas
Además de la cromatografía de afinidad por
carbohidratos, se han utilizado otros métodos para
purificar lectinas. Algunas lectinas se purificaron
mediante precipitación fraccionada con sulfato de
amonio como sal precipitante como lo indican Oliveira
et al. (2002) y Vence et al. (2012), seguidos de métodos
clásicos, como la cromatografía de intercambio iónico y
la cromatografía de filtración en gel (Horibe et al, 2010;
Pan et al, 2010). Las lectinas generalmente son
glicoproteínas, por ello, algunos autores describen su
aislamiento mediante cromatografía de afinidad
basándose en el uso de lectinas para capturar otra, por
ejemplo, la Concanavalina A suele ser inmovilizada para
aislar otras lectinas (Absar et al. al, 2005.; Charungchitrak
et al , 2011; Konkumnerd et al, 2010; Petnual et al,
2010; Yan et al, 2010). Además, es posible trabajar con
partículas ferromagnéticas con polisacárido inmovilizado
preparado para el aislamiento de lectinas (Porter et al.,
1998). Las propiedades magnéticas de las partículas
favorecen el lavado de impurezas mediante un campo
magnético, y los azúcares se utilizan para liberar
lectinas y recuperar las partículas (Angeli et al., 2009;
Kavunja et al., 2015). Un nuevo método para la
purificación por afinidad cromatográfica de lectinas es
el uso de membranas con nanofibras glicosiladas, en
las que una membrana de afinidad por glucosa
inmovilizada mostró una capacidad fuerte y reversible
para aislar lectinas (Che et al., 2011).
Conclusiones
Se puede concluir que la cromatografía de afinidad por
carbohidratos es el método más utilizado para la
purificación de lectinas, presentándose como un método
simple que aprovecha sus propiedades específicas. Sin
embargo, no existe un protocolo de aplicación general y
la selección de la matriz de unión más adecuada,
La elución y activación de la matriz pueden resultar
difíciles y deben seleccionarse según cada tipo de
lectina a aislar.
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Conflicto de Intereses
Los autores declaran no tener ningún
conflicto de intereses
Recibido: agosto 04 de 2016
Aceptado: agosto 26 de 2016
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